چكيده
به منظور بررسي اثرات استفاده از لجن فاضلاب و ساير مواد زائد شهري و كشاورزي بر آلودگيهاي ميكروبي خاك ، چهار نوع كود آلي شامل لجن فاضلاب ، كود حيواني ، كمپوست زباله و مخلوط كاه گندم و يونجه در آزمايشات گلخانه اي در قالب طرح هاي كاملا تصادفي مورد ارزيابي قرار گرفتند. بررسي تغييرات جمعيت ميكروبي مخلوط كودهاي فوق با خاك شامل باكتريها ، قارچها و آكتينومايستها بررسي تغييرات جمعيت كليفرمها و شناسايي تعدادي از آنها و همچنين شناسايي انواع ميكرو فلور غالب در تيمارهاي مختلف به روش اسلايد پنهان ، از اهداف اختصاصي در تحقيق فوق بوده است. بيشترين جمعيت باكتريها و قارچها در كودهاي كمپوست زباله و لجن فاضلاب و بيشترين جمعيت آكتينومايست ها در كاه گندم مشاهده شد. شمارش كليفرمها نشان داد كه در هفته اول انكوباسيون ، جمعيت كليفرمها بخصوص در كود حيواني بسيار زياد است. در اين مدت وجود بعضي از باكتريهاي كليفرم در كودهاي لجن فاضلاب ، حيواني و كمپوست زباله تشخيص داده شد. همچنين در اين تحقيق ، تكنيك اسلايد پنهان به عنوان يكي از بهترين روشهاي بررسي تنوع اكولوژيكي موجودات ذره بيني خاك معرفي شده است. كلمات كليدي: لجن فاضلاب ، خاك، محيط زيست ، ميكروارگانيسم ها

مقدمه
خاك مي تواند موجب انتقال عوامل بيماريزاي بسياري از امراض عفوني گردد(۱۱) . تعداد ميكروبهايي كه از طريق فضولات به خاك اضافه مي شوند ، به وسعت آلودگي هاي خاك مي افزايند. بررسي خصوصيات فيزيكي و شيميايي مواد زائد يا به عبارتي كودهاي آلي ، مدتهاست كه به منظور بهينه سازي و استفاده آگاهانه از آنها صورت مي پذيرد(۹)در اين ميان خصوصيات بيولوژيكي كودهاي آلي در مطالعات فوق ناديده گرفته مي شود و توصيه به استفاده از كودهاي آلي بدون بررسيهاي همه جانبه بيولوژي و زيست محيطي آنها صورت مي گيرد. از آنجايي كه خاك پايگاه موجودات خشكي زي بويژه جوامع انساني است و انتقال عوامل پاتوژن از راههاي گوناگون توسط گرد و غبار از راه تنفس و زخمهاي سطحي بدن به انسان و حيوان صورت مي گيرد ، بنابراين خصوصيات بيولوژيكي و جمعيت فلور ميكروبي بيماريزاي خاك را بايد تعيين نمود

. كليفرمها كه از باكتريهاي خانواده انتروباكترياسه هستند ، معمولا به عنوان شاخص آلودگي آب و خاك مورد ارزيابي قرار مي گيرند(۸). خانواده انتروباكترياسه شامل گروه بزرگي از باكتريها مي باشد كه بطور وسيع در طبيعت پراكنده هستند. اين باكتريها در روده انسان ، حيوانات ، در خاك و آب وجود دارند كه به دليل زندگي آنها در روده انسان و حيوانات به باسيلهاي انتريك معروفند. همه اين باكتريها هوازي و بي هوازي اختياري ، گرم منفي ، بدون اسپور و ميله اي شكل ، داراي متابوليسم تنفسي و تخميري ، داراي قدرت تخمير گلوكز و لاكتوز هستند. علاوه بر توليد بيماريهاي مختلف ، از انجايي كه اين باكتريها ساكن طبيعي دستگاه گوارش مي باشند ، به محض وارد شدن به هر نقطه از بدن ، مي توانند در تمام بافتها و اعضاء ايجاد عفونت كنند (۵). در شهر اصفهان به دليل وجود كارخانه توليد كود آلي كمپوست و چند تصفيه خانه فاضلاب ، هر ساله مقادير زيادي كمپوست زباله و لجن فاضلاب در زمينهاي كشاورزي مصرف مي شود و چون مصرف اين كودها بدون نظارتهاي بيولوژيكي صورت مي گيرد ، لذا مي تواند تاثير نا مطلوبي را در محيط زيست بگذارد. تحقيق حاضر نيز در راستاي ارزيابي آلودگيهاي ميكروبي خاكهاي كشاورزي كه با استفاده از انواع مواد زائد و فضولات تيمار ميشوند ، صورت پذيرفت.

مواد و روشها
در اين تحقيق چهار نوع كود آلي شامل لجن فاضلاب ، كود حيواني ، كمپوست زباله و مخلوط كاه گندم و يونجه ، به عنوان چهار تيمار اصلي ( به ميزان دو درصد وزني ) به همراه شاهد بدون كود در سه تكرار در يك طرح آماري كاملا تصادفي در آزمايشات گلخانه اي ارزيابي شدند. اين آزمايشات بطور كلي در سه بخش شامل تعيين جمعيت باكتريها ، قارچها و اكتينومايست ها در خاك ، بررسي ميزان آلودگي خاك به كليفرمها و شناسايي انواع ميكروفلور غالب در تيمارهاي مختلف به روش اسلايد پنهان انجام پذيرفت. براي تعيين جمعيت ميكروبي خاك ، ابتدا از نمونه خاك در تيمارهاي مختلف ، سوسپانسيون و سپس سري رقت تهيه شده و به منظور پراكنده شدن خاكدانه ها و جداشدن ميكروارگانيسمها از ذرات خاك ، از ارتعاشات اولتراسونيك استفاده شد.

پس از تهيه سري رقت ، از محيط كشت نوترينت آگار براي كشت باكتريها ، از محيط كشت +PDA كلرامفنيكل براي كشت قارچ و از محيط كشت جنسون آگار به منظور كشت اكتينومايست ها استفاده شد. پس از طي زمان انكوباسيون ، تمام كلني ها بر روي محيط كشت مورد نظر توسط كلني كانتر كوبك شمارش گرديد. براي مطالعه كليفرمها از روش تخمير چند لوله اي در محيط كشت لاكتوز برات و EMB و تست هاي فرضي و تأييدي و IMVic استفاده شده و نتايج به صورت MpN گزارش گرديد(۲و۸) . براي مشاهده ميكروارگانيسم ها به روش اسلايد پنهان ، محيط كشت مورد نظر را به طريقه استريل تهيه كرده و لايه نازكي از آن را روي لام شيشه اي قرار مي دهيم. سپس لام مغذي را درون پليت حاوي خاك در تيمارهاي مورد نظر قرار داده پس از ۷-۴ روز انكوباسيون در دماي ۳۰ درجه سانتي گراد ، لام را از خاك در آورده ، پس از شستشو و حرارت دادن به منظور فيكسه كردن ، لام را با استفاده از رنگ آميزي گرم ، رنگ كرده و با بزرگنماييهاي مختلف توسط ميكروسكپ مشاهده و عكسبرداري مي شود.

نتايج و بحث
در ميان تيمارهاي مورد استفاده ، بيشترين جمعيت باكتريها و قارچها در كودهاي كمپوست زباله و لجن فاضلاب مشاهده شد ، نتايج تجزيه واريانس نيز معني دار بودن اثر زمان نگهداري و تيمار كودي را بر تعداد جمعيت باكتريها و قارچها نشان مي دهند. شايد بتوان مهمترين علت افزايش جمعيت باكتريها در لجن فاضلاب را نسبت C/N پائين اين كود دانست اين نسبت باعث مي شود شرايط تجزيه مواد آلي براي يورش ميكروبي مساعد شده و باكتريها كه عمدتا بر روي مواد با C/N كم فعاليت بيشتري دارند ، در مدت كوتاهي رشد و تكثير يابند(۱۰). در مورد افزايش جمعيت باكتريها در كود كمپوست مي توان به چند دليل اشاره كرد. اول اينكه بسياري از محققين معتقدند وجود مواد مغذي و احتمالا بعضي از كاتاليزورهاي حياتي در كمپوست زباله مي تواند رشد باكتريها را تشديد كند (۳).

همچنين جمعيت بالاي ازتوباكترهاي تثبيت كننده ازت در اين كود مي تواند نوعي منبع دائمي ازت را براي رشد باكتريها فراهم كرده و اثر C/N بالاي اين كود را تا حدي برطرف نمايد. در اين راستا ، نتايج آزمايشات مختلف نشان داده است كه باكتريهاي تجزيه كننده سلولز ، به دليل نياز شديدي كه به ازت دارند ، در مجاورت باكتريهاي تثبيت كننده ازت خيلي بهتر رشد مي كنند(۴) . افزودن مواد آلي قابل تجزيه در تيمارهاي مختلف باعث شد كه قارچهاي خاك از حالت فونجيستاسيس و ركود خارج شده و رشد فعال خود را از سر بگيرند (۶). نتايج نشان مي دهد كه جنسهاي پنيسيليوم ، آسپرژيلوس ، آلترناريا و فوزاريوم كه جزء قارچهاي ناقص محسوب مي شوند ، درصد بالايي از قارچهاي خاك را تشكيل مي دهند. همچنين علاوه بر قارچهاي فوق ، در تيمار لجن فاظلاب قارچهاي كريزوسپوريوم،تريكوفيتون و اسكو پولاريوپسيس،در تيمار كود حيواني قارچ موكور و پسيلومايسس در تيمار كود كمپوست زباله، قارچ كلادوسپوريم،كريزوسپوريوم و تريكو درما و در تيمار كود گياهي جنس كلادو سپوريوم،پسيلو مايسس، رايزو پوس و تريكو درما مشاهده شدند.وجود قارچهاي تجزيه كننده سلولز مثل آلترناريا،آسپرژيلوس، فوزاريم،پنيسيليوم و رايزوپوس بخصوص در تيمار كود گياهي ، اهميت اين پروسه را نشان مي دهد.همچنين بيشتر جمعيت آكتينومايست ها در كود كاه گندم و يونجه مشاهده شد .

مقايسه ميانگين جمعيت آكتينومايست ها نشان مي دهد كه كود گياهي بالا ترين اثر معني دار را نسبت به شاهد داشته و با كود كمپوست زباله اختلاف معني داري ندارد. آكتينومايست ها در مراحل اوليه تجزيه مواد آلي تازه ،بعلت قدرت رقابت ضعيفي كه در مصرف مواد كربن دار ساده با باكتريها و قارچها دارند، تعداد و فعاليتشان خيلي كم است اما به تدريج با كاهش مواد ساده و ميكرو ارگانسيم هاي وابسته به اين مواد، تعداد آكتينو مايست ها افزايش يافته و فعاليت خود را روي قسمتهاي مقاوم باقي مانده شروع مي كنند .

نتايج حاصل از بررسي تغيرات جمعيت كليفرمها در تيمارهاي مختلف نشان داد كه در اولين زمان نمونه برداري ، كود حيواني بيشترين آلودگي را از نظر تعداد كليفرمها در خاك ايجاد كرده است. علت اين امر را مي توان تازه بودن كود حيواني مورد استفاده عنوان كرد. در همين زمان كود هاي لجن فاضلاب و كمپوست زباله به ترتيب داراي بيشترين جمعيت كليفرمها بعد از كود حيواني بوده اند. در يك هفته بعد جمعيت كليفرمها در خاك حاوي كود حيواني هنوز جمعيت بالايي را نشان مي دهند۸۲۰×۱۰۲ در ۱۰۰ميلي ليتر). در خاك تيمار شده توسط لجن فاضلاب جمعيت كليفرمها به شدت كاهش يافته و به حدود يك چهارم خود رسيده اند. از آنجائي كه كليفرمها عمر كوتاهي دارند و بعنوان باكتريهاي فرصت طلب در خاك شهرت دارند،پس از كاهش مواد مغذي مورد استفاده و همچنين رقابت ساير ميكروارگانيسم ها با آنها ، جمعيت آنها در همه تيمارها در هفته سوم و هشتم نيز سير نزولي داشته است.