آماده كردن تركيب آميلوز در برگهاي Arabidopsis
مكانيسم تركيب آميلوز را در برگ هاي Arabidopsis با استفاده از تكنيك هاي برچسب زني C بررسي كرديم. در ابتدا اين فرضيه را امتحان كرديم كه ممكن است malto – oligosaccharides (MOS) به عنوان چاشني (آستر) براي سنتاز ۱ نشاسته اي كه داراي دانه هاي محدود است عمل كند. متوجه شديم تركيب افزوده شده آميلوز در دانه ها جدا شده نشاسته با گلوكز ADP تهيه مي شود و MOS تهيه مي شود و MOS كه با دانه ها مقايسه شده با گلوكز ADP تهيه مي گردد.

علاوه بر اين، با استفاده از گياهان تغيير پذير (Matant) جمع آوري كننده MOS متوجه شديم كه نسبت به نوع وحشي آميلوز بيشتري تركيب گرديد كه به مقدار MOS در Vivo ارتباط دارد. زماني كه گياهان تغيير پذير و نوع وحشي در موقعيت هايي كه هر دو خطوط داراي محتوي مشابه MOS هستند، آزمايش گرديدند، هيچ تفاوتي در تركيب آميلوز مشاهده نشده همچنين فرضيه اي را آزمايش كرديم كه ممكن است شاخه هاي آميلو پكتين به عنوان چاشني براي سينتاز ۱ نشاسته اي كه داراي دانه هاي محدود است عمل كند. در اين مدل شاخه هاي كشيده آميلو پكتين براي شكل دادن آميلوز پشت سر هم شكافته مي شوند. آزمايشات تعقيب پالس (ضربه) را انجام داديم پالس گلوكز ADP براي دانه هاي جدا شده نشاسته يا CO2 را براي گياهان سالم به كار برديم، و با دوره تعقيب در اشكال فرعي بدون برچسب دنبال شد. هيچ انتقال برچسب را از قسمتي از آميلو پكتين به بخش آميلوز نشاسته در دانه هاي جدا شده نشاسته و برگ هاي سالم با وجود تنوع دوره زماني تجارب و با استفاده از مسير تغيير پذيري كه نشاسته با مقدار بالايي آميلوز در آن تركيب مي شود، كشف نكرديم. بنابراين هيچ مدركي در تركيب آميلوز آستر شده Arabidopsis در Arabidopsis وجود ندارد. در نظر مي گيريم كه MOS آسترهايي براي تركيب آميلوز در برگ هاي Arabidopsis هستند.

نشاسته از دو پليمر گلوكان (glucan): آميلو پكتين و آميلوز تشكيل شده است % ۷۰ يا بيشتر نشاسته گياهان نوع وحشي، آميلوپكتين است. آن مولكول بزرگي است كه به اندازه زيادي شاخه بندي شده در حالي كه آميلوز كوچكتر بوده و زياد شاخه بندي نشده است مولكول هاي آميلو پكتين براي شكل دادن ماتريكس نيمه بلوري سازماندهي شده اند و مولكول هاي آميلوز در حالت نامنظمي در اين ماتريكس قرار دارند. آميلوز و آميلو پكتين به طور همزمان در طور بيوسنتز دانه نشاسته تركيب مي شوند. بررسي ضد حسي و جهشي نشان داده كه ستياز نشاسته دانه محدود آنزيم ۱ منحصرا مسئول تركيب آميلوز است. ايزو فرم هاي سيتاز نشاسته كه مسئول تركيب آميلو پكتين هستند اساسا به همراه بخشي از اين پروتئين هايي كه در ماتريكس دانه گنجانده شده اند در شكل قابل حل Plastid جاي گرفته اند. بنابراين، حتي زماني كه دانه ها محدود هستند اين ايزوفرم ها آميلوز را تركيب نمي كنند.

GPSS انتقال باقيمانده گلوكزي يك ADP-GlC را در انتهاي كاهش ناپذير آستر گلوكان كاتاليز ميكند، اما نوع اين آستر در Vivo مشخص نيست. در ابتدا، ممكن است MOS قابل حل به عنوان استر براي تركيب آميلوز عمل كند. زماني كه با دانه هاي مجزاي نشاسته نخود فرنگي، سيب زميني و جلبك سبز غير سلولي Chlamydomonas reinhardtii تهيه مي شود، MOS بين دو و هفت واحد گلوكز در طول براي شكل دادن آميلوز در حدود ماتريكس دانه از طريق افزودن گلوكز از گلوكز ADP كشيده مي شوند دوما ممكن است شاخه هاي آميلو پكتين در حدود ماتريكس از طريق GBSS كشيده و سپس براي شكل دادن آميلوز شكافته شوند. كار اخير با دانه هاي نشاسته كه از C. reinhardtii جدا شده اين ايده را تضمين كرده است. Vandewal و همكارانش دريافتند كه گلوكز گلوكز ADP داخل بخشي از آميلو پكتين ادغام مي شود اما در طول رشد نهفته دانه ها، به بخش آميلوز انتقال مي يابد. در طي اين رشد نهفته نيز محتوي آميلوز در دانه ها افزايش مي يابد. اين نتايج مطابق ايده اي است كه آميلو پكتين براي GBSS آستر است و آميلوز از طريق شكافتن زنجيره طولني توسط فعل و انفعال آنزيمي نامشخص شكل مي يابد.

GBSS در حدود دانه هاي نشاسته اي كه از سيب زميني، سيب زميني شيرين و embryos نخود فرنگي جدا شده نيز مي تواند گلوكز از گلوكز ADP به شاخه هاي آميلو پكتين انتقال دهد. بنابراين براي اين گونه هايي كه شاخه ها براي شكل دادن آميلوز شكافته مي شوند مدركي وجود ندارد.

هر دو مدل برا چيدن برگ و تركيب آميلوز براساس آزمايشاتي است كه در Uitro (مايع زجاجيه) انجام شده اگر چه با فراهم آوردن سرنخ هاي حياتي، چنين آزمايشاتي نمي تواند نوع آستر را براي تركيب آميلوز در Vivo آنزيم هاي قابل حل تركيب نشاسته ساير اجزاي Plastid شسته شده و تركيبات آميلوز در انزوا روي مي دهد. اين ممكن است شامل فاكتورهايي نشود كه بر تركيب آميلوز در Vivo برگ هاي Arabidopsis را به كار برديم. به خاطر اين كه نشاسته برگ مستقيما از كربني كه از طريق فتو سنتز جذب گرديده ساخته شده تركيباتش مي تواند با تهيه CO214 در طول دوره نور مورد بررسي قرار گيرد.

آزمايش كرديم كه آيا ممكن است تركيبات آميلوز آستر شده MOS با استفاده از مسير تغيير Arabidopsis كه MOS را جمع آوري مي كند روي مي دهد. اين مسير تغيير پذير فاقد آنزيم نامناسبي است كه در طول افت نشاسته در گير متابوليسم MOS شود متعاقبا MOS تا ۱۵ بار در طول به حركت درآوردن نشاسته در شب برگ هاي نوع وحشي را جمع آوري مي كند و سپس در طول ۴ ساعت اول روز بعد به سطح نوع وحشي افت مي كند MOS كوتاه كه در طول افت نشاسته توليد شده براي فراهم آوردن MOS بزرگتر به عنوان اشكال فرعي براي ساير آنزيم هاي كاهش دهنده نشاسته توسط آنزيم نامناسبي دگرگون مي شود بنابراين سطح MOS در سرتاسر چرخه روزانه كم است. گياه تغيير پذير ۱ dpe نشاسته را با محتوي آميلوز بيشتري نسبت به نشاسته اي كه در برگ هاي نوع وحشي توليد شده، توليد مي كند.

اگر MOS به عنوان آستر براي تركيب آميلوز عمل كند، ممكن است اين مقدار بالاي آميلوز از طريق MOS زياد موجود در برگ تغيير پذير در چند ساعت اول روز محاسبه شود. پالس CO214 را براي گياهان تغيير پذير تحت شرايطي كه آن ها MOS كم يا زياد داشتند فراهم كرديم و ادغام CO214 داخل آميلوز در اين گياهان و در گياهان وحشي تحت شرايط مشابه مقايسه شد. همچنين بررسي كرديم آيا ممكن است تركيب آميلوز آستر شده آميلوپكتين با استفاده از آزمايشات تعقيب پالس براي جستجوي انتقال برچسب از آميلو پكتين به آميلوز روي دهد.
نتايج مان مطابق اين عقيده است كه MOS مي تواند به عنوان آستر براي تركيب آميلوز عمل كند اما هيچ مدركي براي تركيب آميلوز آستر شده آميلو پكتين در برگ هاي Arabidopsis فراهم نمي كند.

نتايج
تركيب آميلوز در دانه هاي مجزاي نشاسته
در آزمايشات اوليه، بررسي كرديم آيا دانه هاي نشاسته از Arabidopsis كه تركيب گزارش شده آميلوز آستر شده آميلو پكتين يا آستر شده MOS را براي دانه هاي ساير گونه ها نمايش داده، جدا شده اند. در ابتدا مشخص كرديم كه آيا فعل و انفعال GBSS در نشاسته Arabidopsis استخراج شده ثابت است. دانه ها از برگ هاي تغيير پذير گياهان وحشي، نيمه راه از طريق دوره عكس ۶ ساعته، جدا مي شوند و حداكثر تا ۲۴ ساعت در محيط كشت آزمايش قرار مي گيرند. در ۶ ساعت اول، فقدان فعل و انفعال GBSS وجود ندارد اما بعد از ۲۴ ساعت، % ۳۰ فعل و انفعالات اوليه GBSS باقي مي ماند. آزمايشات بعدي تعقيب پالس در ۶ ساعت يا كمتر انجام شد.

براي تعيين اين كه آيا تركيب آميلوز توسط MOS تحريك مي شود، دانه هاي به همراه MOS يا بدون آن كه در محيط كشتي كه حاوي ADP lmm است خوابيده شدند. بعد از يك ساعت دانه هاي نشاسته كشف شده و با استفاده از كروماتوگرافي سفاروز CLZB داخل آميلوز و آميلو پكتين جدا شدند. نتايج نشان مي دهد كه در حضور مالتوتريوس (maltotrios) اتصال برچسب از گلوكز ADP افزايش يافته و نسبت به فقدان مالتوتريوس مقدار بيشتري در بخش هاي آميلوز M2 پايين وجود دارد.

براي تعيين اين كه آيا تركيب آستر شده آميلو پكتين اتفاق افتاده است دانه هاي نشاسته از برگ ها جدا شده و براي ۳۰ دقيقه با گلوكز ADP تهيه مي شوند سپس با گلوكز ADP برداشته شده و براي پيگيري ۲ يا ۶ ساعت گلوكز ADP بدون برچسب جايگزين مي شود. نمونه هاي دانه هاي نشاسته برچسب زده شده بعد از پالس و در انتهاي دوره پيگيري گرفته مي شوند. نشاسته داخل آميلوز و آميلوپكتين جدا مي شود. نتايج نشان مي دهد كه اكثر بر چسب ها داخل بخش هايي كه حاوي آميلو پكتين Mr بالا هستند ادغام مي شوند در طول دوره پيگيري حركت مشهود برچسب از بخش آميلو پكتين به بخشي كه داراي آميلوز پايين Mr است وجود نداشت.

تست آميلوز آستر شده MOS در Vivo
براي تعيين اين كه آيا ممكن است MOS به عنوان آسترهايي براي تركيب آميلوز در Vivo عمل كند، گياهان وحشي را با گياهان مسير تغيير پذير ۱ dpe مقايسه كرديم به خاطر اين كه اين گياهان تغيير پذير داراي سطوح بالاي MOS در شروع روز هستند اما در زمان نور داراي سطوح نرما هستند، با دليل ثابت كرديم كه آن مي توانست براي كشف تاثير MOS افزوده در تركيب آميلوز استفاده شود.

به گياهان ۱ dpe و نوع وحشي براي ۶ ساعت اول دوره عكس اجازه فتوسنتز شدن داده مي شود سپس نيمي از گياهان براي ۴ ساعت به محل تاريكي منتقل مي شد، در حالي كه آزمايش در نور باقي مي ماند. نمونه بندي گياهان در اين مرحله نشان داد كه محتوي MOS در گياهان موجود در نور و در گياهان وحشي موجود در تاريكي پايين است. اين به خاطر افزايش مالتو تريوس است. سپس گياهان موجود در تاريكي به نور برگردانده مي شوند و بعد از ۱۵ دقيقه تمام گياهان براي ۳۰ دقيقه بعد در معرض CO214 قرار مي گيرند سپس گياهان برداشت شده و در مايع N2 منجمد مي شوند. نشاسته از گياهان استخراج شده و آميلوز و آميلو پكتين از طريق كروماتوگرافي سفاروز CL2B جدا مي گردند در صد برچسب ادغام شده در آميلوز درگياهان ۱ dpe و گياهان وحشي كه در نور عمل كرده اند مشابه بود.

بنابراين در گياهاني كه در تاريكي عمل كردند ادغام بيشتر بر چسب داخل بخش هاي آميلوز نشاسته ۱ dpe نسبت به داخل همان بخش هاي نشاسته نوع وحشي وجود دارد. آناليزهاي بعدي نشان داد كه هيچ تفاوت مهمي بين برچسب ادغام شده در آميلوز موجود در نوع وحشي بدون توجه به طرز عمل نور و تاريكي ندارد، اما در گياهان تغيير پذير محل تاريك افزايش برچسب در زماني كه با گياهان تغيير پذير در محل نوراني مقايسه مي شود، مهم است بنابراين فقط در گياهان ۱ dpe محل تاريك كه محتوي MOS زياد است، همچنين تركيب افزايش يافته آميلوز وجود دارد.