الکتروفورز

امروزه الكتروفورز شايد اصلي ترين تكنيك براي جداسازي ملكولها در آزمايشگاه‌هاي سلولهاي زيستي است. زيرا تكنيك قدرتمندي است و هنوز به طور معقولانه اي آسان و ارزان است و خيلي آسان و پيش پا افتاده شده است. علي رغم بسياري از آرايش هاي فيزيكي براي دستگاه ها و صرف نظر از محيطي كه ملكولها اجازه مهاجرت در آن دارند جداسازي با الكتروفورز به توزيع بار در ملكولي كه جداسازي مي شود بستگي دارد. الكتروفورز مي تواند يك بعدي يا دو بعدي باشد. الكتروفورز يك بخشي براي جداسازي اغلب پروتئين‌هاي روتين و اسيد نوكلئيك استفاده مي شود. بخش دوم الكتروفورز براي جداسازي پروتئين هايي كه در اثر انگشت هستند استفاده مي شود. محيط كمكي براي الكتروفورز مي تواند در ژل در لوله يا در ورقه هاي صاف خوابيده تشكيل شود لوله ها براي جداسازي يك بعدي استفاده مي شوند و زماني كه ورقه ها فضاي سطحي بلندي را اشغال مي كنند براي جداسازي دو بعدي بهترند. شكل ۱-۴ نوعي واحد الكتروفورز ورقه اي تخت را نشان مي دهد. زماني كه ديترجنت SDS سديم دو دسيل سولفات با پروتئين ها استفاده مي شود، همه پروتئين ها داراي بار منفي مي شوند به وسيله وابستگي به آنيون سديم دودسيل سولفات در زمان جدا سازي با ژل پلي آكريلاميد طرز عمل و رويه با پلي آكريلاميد ژل الكتروفورز خلاصه مي شود اين تكنيك براي تعيين وزن مولكولي استاندارد شده است. ژل هاي پلي آكريلاميد از پليمريزه كردن دو تركيب تشكيل شده اند. آكريلاميد و N , N متيلن بيس آكريلاميد.

بيس در اينجا عامل پيوند دهنده براي ژل هاست. پليمريزاسيون با اضافه كردن آمونيوم پرسولفات در زماني كه همچنين دي متيل آمينوپرپيونيتريل يا N , N , N , N تترامتيل اتيل انديامين آغاز مي شود. ژل ها خنثي و هيدروفيل هستند و شبكه سه بعدي از هيدروكربن هاي طولاني كه به وسيله گروه هاي متيلن به هم وصل شده اند تشكيل شده است جداسازي ملكول ها در ژل بستگي به اندازه منفذها و سوراخهاي تشكيل شده در ژل دارد. اندازه سوراخهاي ژل به وسيله دو فاكتور تعيين مي شوند. %T كه مقدار درصد آكريلاميد را نشان مي دهد. %۳۰ كه مقدار درصد پيوند دهنده را نشان مي دهد. هر چه مقدار كل آكريلاميد افزايش يابد اندازه منفذ ژل كاهش مي يابد. پيوند دهنده هاي با ۵% C كوچكترين اندازه منفذ را مي دهد. هر افزايش يا كاهش در %C باعث افزايش در اندازه منفذ مي شود. كل آكريلاميد داده شده بعنوان نسبت درصد وزن به حجم از آكريلاميد+بيس آكريلاميد است.

پروتئين ها با وزن مولكولي در محدوده ده هزار يا يك ميليون با ۲/۷۱% ژل هاي آكريلاميد جداسازي مي شوند. زماني كه پروتئين ها با وزن ملكولي بالاتر نيازمند تمركز ژل آكريلاميد پايين تر هستند برعكس ژل هاي ۳۰% براي جداسازي پلي پپتيدهاي كوچك استفاده مي شود.
تمركز بيشتر ژل باعث كوچكتر شدن اندازه منفذ ژل و جداسازي بهتر ملكولهاي كوچك مي شود. درصد ژل مورد استفاده بستگي به وزن مولكولي پروتئين مورد جداسازي دارد.
ژل هاي ۵درصد براي پروتئين هايي در محدوده ۶۰۰۰۰ تا ۲۰۰۰۰۰ دالتون استفاده مي شوند. ژل هاي ده درصد براي پروتئين هاي ۱۶۰۰۰ تا ۷۰۰۰۰ دالتون استفاده مي شوند و ژل هاي پانزده درصد براي پروتئين هاي ۱۲۰۰۰ تا ۴۵۰۰۰ دالتون استفاده مي شوند.

سيستم هاي كاتيوني و آنيوني
در الكتروفورز پروتئين ها در يك بار پايه جداسازي مي شوند و بار پروتئين مي تواند مثبت يا منفي باشد.بسته به PH بافر. در عمليات معمولي ستون حاوي ژل قيمت بندي شده در سه قسمت شامل: ۱- ژل جدا كننده ۲- ژل توده شده ۳- ژل نمونه . ژل نمونه ممكن است حذف بشود و نمونه از طريق غليظ شدن محيط غير هدايتي مانند ساكاروز به وجود بيايد. الكترودها به دو انتهاي ستون متصل مي شوند و جريان الكتريكي از طريق ژل جزءبندي شده عبور مي كند. اگر الكترودها به صورت بالا آرايش پيدا كنند حمام بالايي كاتد و حمام پايين آند (+) است.
آنيون ها اجازه دارند كه به سمت آند بروند و به اين سيستم آنودي مي گويند. كاتيون ها اجازه دارند كه به سمت كاتد بروند و به اين سيستم كاتدي مي گويند.

سيستم هاي لوله اي و ورقه اي
در طراحي پروتكل الكتروفورز دو سيستم نزديك به هم طراحي شده است يكي ستون الكتروفورز كه از ژلهاي لوله مانند در لوله هاي شيشه اي تشكيل شده است و ديگري ژل هاي تخت كه از ژل تخت بين دو صفحه شيشه اي تشكيل شده است. مزاياي ژل هاي تيوبي در حركت ملكولها از طريق ژل ها كمتر مستعد و مهياست تا حركت افقي و بنابراين گسترش آرامي در تجزيه و تحليل باندها به خصوص در پروتئين ها وجود دارد و از نظر اقتصادي هم به صرفه است زيرا نسبتا آسان است براي ساختن اين سيستم مي توان در خانه از مواد قابل دسترس استفاده كرد.

با وجود اينكه ژل هاي تخت مزايايي دارند كه اجازه مي دهند براي تجزيه هاي دو بعدي از آنها استفاده شود جدا كردن چندين نمونه به طور همزمان در يك ژل وجود دارد. ژل هاي تخت طوري طراحي شده اند كه چندين راه باريك دارند كه نمونه ها به طور موازي حركت كنند. اندازه و تعداد راه ها مي تواند مختلف باشد زماني كه نمونه ها در يك محيط حركت مي كنند كمترين همانندي نمونه هاي مختلف منجر به تغييرات جزئي در ساختار ژل مي شود. ژل تخت تكنيكي براي تجزيه هاي لكه‌اي و تجزيه هاي اتوراديوگرافيك است. نتيجتا براي عمليات آزمايشگاهي روزمره مثل تجزيه نوكلئيك اسيدها و كنترل هاي آنتي ژني ژل هاي تخت مناسبند. قابليت استفاده و قيمت تجاري ژل تخت باعث استفاده بيشتر از اينها شده و به ندرت از ژل لوله اي استفاده مي شود. تئوري و عمليات ژل تخت با ژل لوله اي الكتروفورز يكسان است و اين كه از كدام سيستم استفاده كنيم بستگي بيشتر به تجهيزات موجود دارد.

سيستم هاي ژل دنباله دار و بدون دنباله
استفاده اصلي از ژل ها بعنوان محيط جدا كننده كه شامل استفاده از يك ژل با پوشش PH است. مولكولها به وسيله حركتشان در پايه از طريق ماتريكس ژل تنها جدا مي شوند اين سيستم امروزه فقط گاهي در آزمايشگاهها استفاده مي شود. و با سيستم هاي ژل چندتايي بدون دنباله جايگزين شده است. در سيستم هاي ژل چندتايي ژل جدا كننده به ژل توده اي و ژل نمونه انتخابي اضافه مي شود. اين ژل ها مي توانند تجمع متفاوتي در يك محيط كمكي داشته باشند. يا ممكن است به طور كلي عامل هاي متفاوتي داشته باشند. تفاوت كليدي در جداسازي ملكولها زماني كه آن ها به ژل جدا كننده وارد مي شوند است ژل جدا كننده تجمع خواهند كرد. اين منطقه در ژل توده كننده در محدوده ميكرون تا ميليمتر است. زماني كه پروتئينها در باندهاي تجمع توده مي شوند آنها به مهاجرت ادامه مي دهند براي رسيدن به ژل جداكننده تا باندهاي باريك تشكيل دهند. باندها سپس از يكديگر جدا مي شوند.

ژل PH بدون دنباله
ابتدا باندهاي پروتئين به ژل جدا كننده وارد مي شوند جداسازي باندها با يون هاي عبوري از طريق ستون ژل در جفت افزايش مي يابد هر يون در اين جفت داراي پلاريته بار يكسان مانند پروتئين هستند. ولي متفاوت در بزرگي بار هستند. يك يون بزرگي بار بيشتي از پروتئين دارد. در حالي كه ديگري بزرگي بار كمتري از پروتئين دارد. يوني كه بار بيشتري دارد تندتر حركت مي كند و بنابراين يون رهبر خواهد بود و يون با بار كمتر يون دنباله رو خواهد بود در سيستم هاي آنيوني يونهاي كلر و گليسينات از مخزن بافر (تريس گليسين) مشتق مي شوند يون رهبر معمولا كلر و گليسينات يون دنباله رو است طرح اين سيستم آنيوني در شكل ۴-۳ نمايش داده شده است. يون كلر اول به ژل جدا كننده وارد مي شود و به سرعت از ژل خارج مي شوند سپس پروتئين و بعد يون گليسينات يون گليسينات پروتئين را خارج مي سازد و در آخر يك پوشش گراديان ولتاژ خطي با ژل مي سازد. پروتئين ها سپس خودشان را با اين شيب بر طبق بار و اندازه شان جور مي كنند.

ژل هاي آگارز
زماني كه ژل هاي آكريلاميد براي تجزيه پروتئين ها استاندارد شدند آنها كمتر براي اسيدهاي نوكلئيك با وزن مولكولي بالا مناسب بوده اند به اين منظور براي جداسازي مناسب اين مولكولهاي بزرگ تجمع آكريلاميد نياز به كاهش تا سطحي كه مايع باقي بماند دارد.
ژلها مي توانند تشكيل بشوند با وجود اينكه آگارز اضافه شود (آگارز يك پلي ساكاريد طبيعي است) براي كاهش تجمع آكريلاميد. با اضافه كردن آگارز تجمع آكريلاميد ۵% مي شود و مي توان براي ملكولهاي با وزن ملكولي بالاتر از ۱۰ دالتون جداسازي كرد. اين روش مخصوصا براي جداسازي ترتيب طولاني از DNA مفيد است. امروزه ژل هاي آگارز- آكريلاميد به طور گسترده در آزمايش‌گاه‌هاي ژنتيك براي تعيين نقشه ژن ها استفاده مي شود اين فصل بروي جداسازي پروتئين ها متمركز است.

ترمينولوژي براي تكنيكهاي تجزيه اي، مهاجرت الكتروني با لوله موئينه:
تكنيهاي مهاجرت الكتروني با لوله موئينه به طور افزاينده اي در شيمي تجزيه محبوب و مهم شده اند به خصوص در بيوتجزيه . بعضي از ترمينولوژي هاي وابسته در كاغذ يافت مي شوند در ترمينولوژي الكتروفورز در شيمي كلينيكي. اما در بسياري از موارد اينها براي تكنيكها كاپيلاري كاربردي نيستند و در تعاريف آيوپاك به حساب نمي آيند. در ۱۹۹۴ آقاي KNOX مقاله اي را در زمينه تكنيكهاي جداسازي الكتروني منتشر كرد اما اين مقاله هماهنگ با فهرست علائم كروماتوگرافي آيوپاك نبود مقاله جاري بحث مي كند و تعريف مي كند جمله هاي وابسته مورد نياز در تامين جاري، شامل نامهاي تكنيكهاي مختلف كه در اصول مهاجرت الكتروني استفاده مي شود و آن بايد مورد توجه قرار بگيرد كه تعداد موارد مرزي موجود با ترتيب و احترام به نامگذاري تكنيك هاي مخصوص اقدام كند. جداسازي با تكنيك هاي مهاجرت الكتروني كاپيلاري در لوله موئينه باريك به وسيله اعمال ميدان الكتريكي قوي به دست مي آيد اين تكنيكها شامل كاپيلاري الكتروفورز و مشتقات تكنيكهاي مهاجرت الكتروني كاپيلاري است كه بر پايه اصول جداسازي متفاوت اند.

در بعضي موارد اين اصول داراي هم پوشاني هستند. ميسلار كاپيلاري الكتروفورز براي جداسازي يونهاي كوچك آلي و معدني و پليمرها رنگها، منفجر كننده ها، پروتئينها، پپتيدها و اسيدهاي نوكلئيك استفاده مي شود. جريان الكترواسمز براي جداسازي همكاري مي كنند اگر چه هميشه مورد نياز نيست. جريان الكتروسمز از تاثير ميدان الكتريكي بر روي بارها در قسمت پخش شده در لايه دوگانه در سطح داخلي كاپيلاري به وجود مي آيند براي مثال در كاپيلاري فيوز سيليكا در برخورد با بافر در PH بالاي ۲ سطح گروه هاي سيلانول دپروتونه شده و پروتون از دست مي دهند و ديواره كاپيلاري بار منفي پيدا مي كند. اين گروه ها اتمسفر يوني را بالا مي برند كاربرد ميدان الكتريكي در كاپيلاري باعث مي شود يونهاي داراي بار مثبت به سمت كاتد حركت كنند و آنيونها به سمت آند حركت كنند مزاياي الكترواسمز شامل موارد زير است:

۱- جداسازي خوب است
۲- زمان جداسازي كوتاه است
۳- مقدار نمونه مورد نياز بسيار كم است
۴- هزينه تجزيه اي كم است