تکنيک‌هاي تهیه و توليد کشت آگار
مقدمه
هوايي كه از آن تنفس مي‌كنيم مملو از موجودات بسيار ريز است كه با باد به حركت درمي‌آيند. قارچ‌ها، باكتريها، ويروسها و گياهان براي انتقال گرده‌هاي خود به مناطق ديگر از باد كمك مي‌گيرند. در صورت عدم رعايت نكات بهداشتي، اين ذرات مي‌توانند چه در تهيه كشت خالص و چه در فرآيند توليد قارچ خوراكي خلل وارد نمايند.

به طور كلي منابع اصلي آلاينده محيط كشت عبارتند از
۱٫ محيط اطراف
۲٫ ظروف كشت
۳٫ ادوات و ابزار کشت
۴٫ پرورش دهنده و لباس وي
۵٫ هاگ‌ها يا ميسليوم قارچ خوراكي

قارچ‌ها و تمامي موجودات زنده نسبت به مواد غذايي، رقابت تنگاتنگ و دائمي با يكديگر دارند. هدف از ايجاد يك محيط استريل، حذف يا كاهش اين گونه رقابت و در نهايت فراهم ساختن شرايط مناسب براي تكثير قارچ خوراكي مي‌باشد. اولين مرحله قبل از تهيه كشت خالص، احداث اطاقک تلقيح يا آزمايشگاه استريل است.

طراحي و احداث آزمايشگاه استريل
علت عمده شكست بيشتر پرورش‌دهندگان قارچ، عدم صرف وقت كافي به منظور احداث آزمايشگاه استريل است. كاري كه چندان هم وقت و انرژي نمي‌برد، بلكه فقط يك و نيم روز كافي است تا يك انباري كوچك يا يك آبدارخانه را به يك اطاقک تلقيح مفيد تبديل نمود.

براي شروع تمام قاليچه‌ها، پتوها، پرده‌ها و ديگر مواد پارچه‌اي را كه پناهگاه خوبي براي گرد و غبار و هاگ‌هاي مضر می باشند از محل دور كرده و تمامي ديوارها و سقف را با يك ماده ضد عفوني كننده كاملاً تميز نمائيد. اطاق را با يك رنگ روغني براق يا اپوكسي بهداشتي رنگ زده تا شستشو‌هاي بعدي راحت‌تر گردد. پنجره‌ها يا هر منبع ورودي هوا را با يك پوشش پلاستيكي مناسب بپوشانيد. محل ورودي اطاق را با پلاستيك يا هر ماده ديگر بصورت يك محفظه انتظار درآورده تا مانع جريان مستقيم هوا بدرون اطاق گردد و طراحي اين محفظه بايد به گونه‌اي باشد كه هنگام ورود به آن؛ درب آزمايشگاه بسته باشد.

تجهيزات ذيل در هر آزمايشگاه ضروري است:
۱- صندلي و ميز محكم با سطح كاملاً صاف
۲- چراغ الكلي، چراغ بنسن يا يك شعله معمولي گاز بوتان براي توليد حرارت
۳- بطري اسپري حاوي محلول سفيد كننده ۱۰ درصد
۴- تعدادي پتري ديش استريل و لوله آزمايش

۵- تعدادي برچسب ، يك دفتر و خودكار
۶- يك چاقوي آگار و حلقه تلقيح
۷- يك دستگاه اتوكلاو يا زودپز معمولي (بخار تحت فشار)
۸- pH سنج يا كاغذ تورنسل معمولي
۹- الكل ۹۶ درصد و ديگر مواد ضد عفوني همچون وايتكس، فرمالين…
۱۰- قفسه براي ظروف كشت، جالوله‌اي و…

تمامي اين اجزاء بايستي درون آزمايشگاه بماند و در صورت خروج يكي از آنها به بيرون، هنگام برگشت آن به داخل آزمايشگاه بايد از تميز بودن آن، مطمئن شد.
به طور كلي براي طراحي يك آزمايشگاه بايد علاوه بر تجهيزات و وسايل گفته شده اصول زير نيز درنظر گرفته شود.

 اطاق تهيه محيط كشت كه داراي تجهيزات كامل و قفسه‌هاي متعدد است (۳۵ درصد مساحت كل)
 اطاقك شيشه‌اي استريل (محفظه تلقيح)(۱۵ درصد مساحت كل)
 اتاق كشت (۴۰ درصد مساحت كل)
 الباقي مساحت براي نگهداري وسايل، اتوكلاو، ترازوها، يخچال و انبار ميسليوم
و اسپان مادري (حدوداً ۱۰ درصد)

با روش ساده‌اي مي‌توان آزمايشگاه يا محيطي نيمه استريل بسته به حجم استفاده و دفعات كاري ايجاد نمود. درصد پاكي لازم براي اطاق استريل تابع مقدار هاگ محيط بيرون است. به عنوان مثال، در فصل زمستان با سرد شدن هوا، مقدار هاگ و آلاينده‌هاي هوا تا حد زيادي كاهش يافته، حال آن كه در طول تابستان و بهار اين مقدار بسيار زياد مي‌باشد.

بنابراين لازم است در طي اين دو فصل توجه كافي به استريل بودن محيط آزمايشگاه مبذول گردد. نكته مهم ديگر اين كه، تمامي ظروف و بطري‌هاي شيشه‌اي آلوده را بايد به طريقي از بين برد تا ضريب آلودگي محيط آزمايشگاه به حداقل برسد.

بعد از احداث اطاق استريل بايد يك سري اصول و نكات بهداشتي را كاملاً رعايت نمود. به اين صورت كه اطاق استريل را بايد با يك محلول سفيدكننده (آب ژاول) كاملاً تميز نمود؛ كف را طي كشيده و در پايان هواي اطاق را با يك محلول سفيد كننده ۱۰ درصد و با استفاده از يك سمپاشي پشتي يا اسپري ضدعفوني نمائيم. حداقل تا ۱۵ دقيقه بعد از محلول پاشي نبايد وارد اطاق شد. در هر مرحله از تلقيح و كشت اين عمليات بايد تكرار شود، چرا كه همواره پيشگيري آسانتر و بهتر از درمان است.

پيش از ادامه بحث، ذكر چند نكته ضروري است. استريل نمودن و استريل نگاه داشتن محيط مستلزم توجه زياد همراه با كمك و ياري مداوم ديگران است. اين امر وقت‌گير بوده و نبايد سرسري و مقطعي انجام گيرد. هرگز يك چراغ الكلي يا شعله گاز را درون اطاق يا محفظه تلقيح روشن نگذاريد، چرا كه در يك محيط بسته اكسيژن هوا به زودي تمام مي‌شود.
بعضي از پرورش‌دهندگان، بيش از نياز لازم بهداشتي با آلودگي مقابله مي‌نمايند. بدين ترتيب اين افراد آزمايشگاه و در نهايت سلامتي خود را با مصرف وسواسي و افراطي قارچ‌كشها، باكتري‌كشها و ضدعفوني كننده‌هاي شيميائي جهش‌زاي خطرناك به خطر مي‌اندازند. به طور مثال مي‌توان به عوارضي همچون تنگي نفس،

بي‌حسي‌هاي شديد همراه با تشنج‌هاي مداوم كه گاه تا چندين روز نيز به درازا مي‌انجامد كه بر اثر كار طولاني مدت افراد، بلافاصله در اطاق‌هائي كه مدت چنداني (كمتر از ۱۵ دقيقه) از سمپاشي آنها بالاخص با سموم فنلي نگذشته اشاره كرد و يا از بين موارد متعدد ديگر، ابتلاء به سرطان پوست بواسطه تماس طولاني (چند سال) و مستقيم پوست (بدون پوشش ايمني) با اشعه ماوراي بنفش (uv) در حين استريل كردن نمونه‌ها داخل محفظه شيشه‌اي درون اطاق تلقيح اشاره نمود.

چنانچه عليرغم تلاش فراوان در جهت استريل نمودن محيط آلودگي باز هم در محيط باقي بماند در آن صورت مي‌توان از راه‌كارهاي ذيل استفاده نمود.
۱٫ بخوردادن روغن استريل‌كننده مانند تري‌اتيلن گلايکول با‌گرم‌كن‌فتيله‌اي در‌فضاي اطاق كه ابري از قطرات بسيار ريز و نسبتاً سنگين در هوا ايجاد شده كه ضمن پائين آمدن ذرات آلاينده معلق در هوا را جذب كرده و از بين مي‌برند. ذرات اين روغن نسبتاً ريز و فرار بوده و هيچ گونه لايه قابل مشاهده‌اي در فضا ايجاد نمي‌نمايد. اين روش ارزان و آسان مي‌باشد.

۲٫ احداث نوعي محفظه شيشه‌اي كاملاً مسدود و نيمه استريل براي نقل و انتقال و كارهاي كشت بافت كه مي‌توان آنها را از چوب و پنجره‌اي كوچك براي نگاه كردن درون آن ساخت كه در يك طرف آن دو سوراخ لاستيكي مخصوص تعبيه مي‌نمايند تا هنگام كار، فرد بتواند دستان خود را داخل محفظه كرده و در صورت عدم استفاده، ورودي سوراخ‌ها با لفافه‌اي پوشيده مي‌شود. مزيت عمده اين محفظه ارزان، بودن استريل كردن آسان محيط داخل آن و عدم جريان مستقيم هوا به درون آن در ضمن كار مي‌باشد.

۳٫ استفاده از صافي‌هاي بسيار ريز كه قطر چشمه‌هاي آن ۳/۰-۱/۰ ميكرون بوده و از قطر هاگهاي مضر بعضي قارچ‌ها و حتي از باكتري‌ها نيز كوچكتر است. از اين صافي‌ها در سامانه‌هاي مخصوصي بنام هود تهويه ملايم استفاده مي‌نمايند. در برخي از آزمايشگاه‌هاي پيشرفته تمام استريل، درون ديوارها يا سقف نيز از اين نوع صافي‌ها استفاده شده و هواي ورودي اطاق با عبور از ميان آنها تصفيه مي‌شود.

براي كسب اطلاعات بيشتر به ضميمه چهارم مراجعه شود
آلودگي، ممكن است در يك محل كم و در جاي ديگر زياد باشد و يا در يك مرحله از پرورش طغيان نمايد يا اين كه علي‌رغم چند سال فعاليت، اثري از آن ديده نشود. از طرفي بايد توجه داشت كه نوع آلودگي، در مراحل و مكان‌هاي مختلف يكسان است، اما شدت و ضعف آن بسته به يك سري عوامل مختلف داخلي يا محيطي متفاوت است كه با اعمال يك سري تمهيدات و اصول بهداشتي تا حدي مي‌توان آن را كنترل نمود.