روش‌هاي انجام عمليات صحرايي و آزمايشگاهي در حشره‌شناسي پزشكي

كلياتي در مورد روش‌هاي مطالعه بندپايان مهم پزشكي در شرايط آزمايشگاهي و صحرايي

۱٫ جمع‌آوري، نگهداري و كار با نمونه
هر متخصص حشره‌شناسي پزشكي، در حين انجام تحقيقات صحرايي مجبور به صيد كردن نمونه‌ها و كار با آنهاست. اين كار معمولاً شامل جمع‌آوري و نگهداري نمونه‌ها با روش‌هاي خاصي است كه عمدتاً، و گاهي اوقات تنها روش‌هايي هستند كه براي مطالعه گروه خاصي از بندپايان به كار مي‌روند. اين روش‌ها براي گروههاي مختلف حشرات مهم پزشكي و همچنين در نقاط مختلف، متفاوت هستند. بنابراين، در ذيل به شرح برخي از نكات اساسي در اين مورد مي‌پردازيم و روش‌هاي تخصصي در فصل مربوط به هر گروه ارائه گرديده است.

اصول جمع‌آوري نمونه و كار با آن
لوازم جمع‌آوري
اين وسايل از ساده‌ترين ابزار، از قبيل توري‌هاي حشره‌شناسي و لوله‌هاي صيد، تا تله هاي بسيار تخصصي كه براي اهداف خاصي به كار مي‌رود، متفاوتند. نمونه‌گيري عبارتست از جمع‌آوري نمونه‌ها با يك روش استاندارد به منظور انجام مطالعه كمّي، كه در آن مي‌توان از ابزار بسيار متفاوتي استفاده نمود. در اين قسمت فقط برخي از نكات ساده و اساسي كه به صورت روتين مورد استفاده بوده و براي صيد لازم هستند، مورد بررسي قرار گرفته‌اند. انواع مختلف تله‌ها براي صيد حشرات به منظور انجام تحقيقات خاص به كار رفته‌اند. برخي از آنها حشرات را به صورت انفرادي و از طريق مكانيكي به دام مي‌اندازند مثل تله‌هاي مكنده)، در حاليكه سايرين با استفاده از مواد جلب كننده از قبيل نور، دي‌اكسيدكربن و يا بوي بدن ميزبان آنها را صيد مي‌كنند.

توري‌هاي حشره‌شناسي دستي (شكل ۱) معمولاً شامل يك كيسه ساخته شده از توري‌هاي داراي سوراخ‌هاي ريز هستند كه به دور يك قاب دايره‌اي متصل گرديده است. اين قاب از جنس آلومينيوم بوده و طوري طراحي شده كه مي‌توان در موقع عدم استفاده، آن را از هم جدا نمود. به دليل ريز بودن جثه اكثر حشرات و بندپايان مهم پزشكي، توري‌ها معمولاً در حشره‌شناسي پزشكي ارزش محدودي دارند. با وجود اين، در مورد جمع‌آوري پشه‌ها از طريق حركت جارويي بر روي رويش گياهي و صيد مگس‌هاي تسه‌تسه از روي ميزبانهايشان، از آن‌ها استفاده مي‌شود. هدف صيد، مشخص كننده نوع مناسب توري است. در مورد حشرات مهم پزشكي، كار با كيسه‌هاي توري سفيد راحت تر است، در حالي كه براي جمع‌آوري پروانه‌ها توري سياه طرفدار بيشتري دارد.

وسيله جمع‌آوري مهم ديگر در حشره‌شناسي پزشكي، آسپيراتور است (شكل ۲). اين وسيله كه انواع مختلفي هم دارد، براي جمع‌آوري پشه‌ها و پشه‌خاكي‌ها از اماكن استراحتشان و حتي براي جمع‌آوري اكتوپارازيت‌هايي كه وادار به ترك ميزبانهايشان مي‌شوند، مورد استفاده قرار مي‌گيرد.

آسپيراتورها وسايل ساده، ولي مؤثري هستند كه حشرات كوچك را از طريق مكيدن به داخل، صيد مي‌كنند. عمل مكش هوا هم توسط دهان فرد جمع‌آوري كننده و هم با وسايل حبابي شكل پلاستيكي صورت مي‌گيرد. در برخي موارد هم فَن‌هاي كوچكي كه با نيروي باتري كار مي‌كنند، اين عمل را به عهده دارند. ساده‌ترين نوع آسپيراتور، يك لوله شيشه‌اي يا پلاستيكي شفاف به طول حدود ۲۵ سانتيمتر است كه يك توري بر روي يك انتهاي آن قرار گرفته و بر روي توري يك لوله بلند قابل انعطاف متصل شده است. انتهاي ديگر لوله پلاستيكي قابل انعطاف در دهان فرد جمع‌آوري كننده قرار مي‌گيرد و با عمل مكش هوا، حشرات را مي‌توان به سادگي درون لوله شيشه‌اي كشيد.

نوع ديگر آسپيراتور داراي يك قسمت شيشه‌اي يا لوله پلاستيكي به طول حدود ۱۵-۱۰ سانتيمتر است كه دو انتهاي آن توسط يك درپوش مسدود شده‌اند. يك لوله شيشه‌اي باريك كه در هر دو انتها باز است از اين درپوش عبور داده مي‌شود. در كنار اين لوله يك لوله پلاستيكي وجود دارد و حشرات از طريق انتهاي لوله باريك ديگري وارد محفظه مي‌شوند. يك تكه توري كه روي انتهاي داخلي لوله مكش قرار دارد، جلوي ورود نمونه‌ها را از محفظه به داخل حلق فرد جمع‌آوري كننده مي‌گيرد.

بسياري از حشرات مهم پزشكي را مي‌توان حتي بدون استفاده از توري يا آسپيراتور و از طريق قرار دادن يك لوله آزمايش بدون لبه بر روي آنها كه در حال استراحت يا خونخواري هستند، صيد نمود. لوله‌ها يا ويال‌هاي داراي اندازه و شكل مختلف براي اين كار مناسب هستند.
حشرات كوچك مثل پشه‌خاكي‌ها و ميدج‌هاي Culocoides را مي‌توان از طريق الكتريسيته ساكن كه در لوله‌هاي پلاستيكي ايجاد مي‌شود، به آنها چسباند و جمع‌آوري نمود؛ به ويژه اين كار را مي‌توان با لوله‌هاي ساخته شده از جنس پلي استيرن شفاف به خوبي انجام داد.

كشتن و نگهداري نمونه‌ها
مهمترين نكته‌اي كه بايد در حين كشتن و نگهداري نمونه مد نظر داشت، ويژگي‌هايي است كه براي تشخيص آن به كار مي‌روند. عدم توجه به اين نكته در هر يك از مراحل اوليه مي‌تواند تعداد زيادي از نمونه‌هايي را كه به دقت جمع‌آوري شده‌اند، غير قابل استفاده سازد. به عنوان مثال، پشه‌ها نبايد در مايعات نگهداري شوند و يا توسط آنها جمع‌آوري گردند؛ زيرا فلس‌هايي را كه بدن و بال‌هايشان را پوشانده از دست خواهند داد و اين كار، تشخيص آنها را تقريباً غير ممكن مي‌سازد. همچنين كيفيت نمونه در بسياري از حشرات و ساير بندپايان در صورتي كه گذاشته شوند تا بميرند، پايين خواهد آمد. براي شناسايي يا ذخيره طولاني مدت به صورت نمونه‌هاي مورد استفاده در شناسايي ساير نمونه‌ها (نمونه‌هاي مرجع)، بايد آنها را از طريق تماس دادن با يكي از تركيبات كشندة استاندارد، كشت.

اين مواد شامل استات اتيل، اتر، تتراكلرواتان و كلروفرم هستند كه مي‌توان آنها را روي يك تكه پنبه ريخت و پنبه آغشته را به همراه نمونه در يك بطري يا لوله شيشه‌اي گذاشت. حشرات را مي‌توان از طريق سرما دادن (فريز كردن) نيز كشت (اگر چنين امكاناتي در شرايط صحرايي وجود داشته باشد). همچنين به عنوان آخرين راهكار مي‌توان نمونه‌ها را از طريق تماس با دود سيگار كشت، اما توجه داشته باشيد در اين روش، لوازم به دود سيگار آلوده مي‌شوندو براي جمع‌آوري‌هاي بعدي حشرات به صورت زنده، بايد اين نكته را مد نظر داشت. راه ديگر براي كشتن نمونه‌ها، استفاده از گرماي شديد نور آفتاب است.

لاروها را مي‌توان با انداختن در الكل كشت. افراد بالغ بندپايان كوچك را نيز مي‌توان در الكل يا به صورت مونته در لام نگهداري نمود. لاروهاي بزرگ دوبالان (مثل لارو مگس‌هاي موسيده يا كاليفوريده) را به به خوبي در آب جوش مي‌توان كشت. نمونه‌ها در آب جوش شكل خود را حفظ مي‌كنند و چروكيده نمي‌شوند. بخار حاصل از مايعات كشنده بر روي ديواره‌هاي بطري‌ها و لوله‌هاي مرگ، به ويژه در شرايط گرم نواحي گرمسيري، باقي مي‌ماند و رعايت اين نكته مهم است كه نمونه‌ها به محض مردن بايد براي سوزن زدن از شيشه مرگ خارج شوند. نمونه‌ها بايد بلافاصله پس از مرگ، اندازه‌گيري و سوزن زده شوند و يا به روش ديگري ذخيره گردند تا از چروكيده و يا شكننده شدن زياد آنها جلوگيري به عمل آيد. اين عمل به ويژه در مورد هر نمونه‌اي كه در معرض كلروفرم قرار گرفته، بايد انجام شود؛ ‌چون اين ماده كشنده به سرعت بدن حشرات را سفت و شكننده مي‌سازد.

سه روش اساسي نگهداري كه به صورت عمومي مورد استفاده‌اند، عبارتند از: خشك، غوطه‌ور در مايع و مونته در لام.
نگهداري به صورت خشك، براي چندين گروه از بندپايان ناقل (پشه‌ها، مگس‌هاي سياه، مگس‌هاي اسب و مگس‌هاي وزوزو -blowfly-) مطلوب و در برخي موارد ضروري است. اسكلت خارجي سخت بدن آنها اغلب ويژگي‌هاي مرفولوژيكي خارجي خود را حفظ مي‌كند و اين حشرات معمولاً به صورت سوزن زده شده نگهداري مي‌شوند. نمونه‌هاي بزرگ (مثل مگس اسب جنس Tabanus) را مي‌توان مستقيماً با روش‌هاي بالا مونته كرد، اما در مورد نمونه‌هاي كوچك لازم است كه اول روي يك سوزن بسيار ريز سوزن زده شوند و سپس بر روي پايه قرار گيرند.

يعني نمونه‌هايي كه با سوزن‌هاي بسيار ريز سوزن زده شده اند؛ روي قطعات كوچكي از موادي از قبيل پلي‌اورتان مونته مي‌شوند و سپس اين قطعات روي يك سوزن حمل كننده بلند فيكس مي‌شوند (شكل ۳). براي جلوگيري از خطر آسيب ديدن و شكستن، نمونه بايد در نزديكي وسط سوزن بسيار ريز فيكس شود. گاهي اوقات ديده مي‌شود كه براي مونته نمونه ابتدا سوزن بسيار ريز از پايه بلند عبور داده مي‌شود و سپس نمونه به صورت اريب روي گوشه سوزن بسيار ريز قرار مي‌گيرد. از اين روش هرگز نبايد استفاده شود. ميكروسوزن‌هاي استيل ضد زنگ در چندين اندازه و قطر مختلف، براي نمونه‌هاي با اندازه‌هاي مختلف ساخته شده‌اند. كار با چنين سوزن‌هايي توسط پنس انجام مي‌شود. روش مورد استفاده براي نمونه‌هاي كوچك، چسباندن آنها به قطعات كارت است. از به كار بردن سلولوئيد و يا ساير مواد بايد خودداري شود، چرا كه نمونه‌ها اغلب پس از خشك شدن ماده چسبدار از بين مي‌روند.

نگهداري به صورت مرطوب، براي بسياري از بندپايان مهم پزشكي لازم است و براي حشرات در مرحله لاروي متداول مي‌باشد. بعضي از حشرات بالغ (مثل اكتوپارازيت هايي از قبيل كك‌ها و شپش‌ها) و كنه‌ها به اين روش نگهداري مي‌شوند. در اين روش، نمونه‌ها بايد در يك مايع كه از متلاشي شدن آنها جلوگيري مي‌كند (اتيل الكل يا اتانول) قرار داده مي‌شوند. از ساير مايعات نگهدارنده مي‌توان به فرمالين و متيل الكل (متانول) اشاره كرد. با وجود اين، اولي رنگ نمونه‌ها را تغيير مي‌دهد و دومي آنها را ترد و شكننده مي‌سازد. با گذشت زمان، همه مايعات نگهدارنده باعث سفيد و بي‌رنگ شدن نمونه‌ها مي‌شوند؛ اما نگهداري آنها در تاريكي، روند اين كار را كند مي‌سازد. بسياري از انواع لوله‌ها يا ويال‌ها، براي نگهداري نمونه‌ها در اتانول مناسب هستند، اما اين ماده از همه ظروف تبخير مي‌شود؛ حتي اگر درب آن بسته شده و يا يك چوب پنبه در درب آن قرار گرفته باشد. بنابراين، بايد ويال‌ها و لوله‌ها براي امنيت در داخل يكسري جارهاي بزرگتر كه با الكل پر شده و درب آنها كاملاً ‌بسته و درزگيري شده، قرار داده شوند (شكل ۴).

تعدادي از بندپايان مهم پزشكي از قبيل: ميدج‌ها، پشه‌خاكي‌ها، كك‌ها و مايت‌ها بايد براي شناسايي و نگهداري طولاني مدت پس از شناسايي، به صورت لام‌هاي ميكروسكوپي مونته شوند. با وجود اين، مي‌توان آنها را به صورت موقتي در الكل هم نگهداري كرد. دو نوع اصلي از مواد مونته كننده وجود دارند:
۱٫ موادي كه محيط سازنده آنها آب است؛ مثل محيط‌هاي برلز و پوري.
۲٫ موادي كه محيط سازنده آنها حلال آلي است؛ مانند كانادا بالزام و اوپارال.

مواد مونته كننده، از نظر شاخص‌هاي انكسار نور تفاوت دارند. بدين معني كه برخي از آنها براي يك گروه از بندپايان، مناسبتر از گروه ديگر هستند. روش‌هاي مونته و تكنيك‌هاي مناسب براي هر گروه در بخش مربوط به هر يك توضيح داده شده‌اند. در صورت مونته نمونه در وضعيت و حالت صحيح، مي‌توان آن را در راحت‌ترين حالت ممكن و با حداقل اتلاف وقت مطالعه كرد و تشخيص داد.

مراقبت از كلكسيون‌هاي حاوي حشرات سوزن زده شده در برابر آفات و قارچ‌ها، به ويژه در نواحي گرمسيري ممكن است كار مشكلي باشد. براي اين كار بايد مراحلي طي شود كه اولين آنها مطمئن شدن از نگهداري نمونه‌ها در جعبه‌هايي است كه تا حد امكان در برابر نفوذ هوا عايق باشند. بدين منظور جعبه‌هاي مخصوصي ساخته شده‌اند كه توصيه مي‌كنيم از آنها استفاده گردد. كيپ بودن درب اين جعبه‌ها، مانع از ورود آفات به داخل جعبه و از بين رفتن نمونه‌ها مي‌شود. آغشتن جعبه با قارچ‌كش (مثل مرتيولات) معمولاً براي جلوگيري از كپك زدن نمونه كافي است، اما براي حفاظت بيشتر در مكان‌هاي به شدت نمور و مرطوب، هر جعبه نگهداري را مي‌توان به صورت محكم و كاملاً عايق، در يك جعبه پلاستيكي حاوي مقداري سيليكاژل پيچيد. يك حشره‌كش (از قبيل ديكلرووس) كه در جعبه‌اي در داخل يك بلوك پلاستيكي كه در قسمتي از جعبه ثابت شده، پاشيده مي‌شود؛ مي‌تواند بسيار مؤثر باشد. اما اين كار بايد به صورت مرتب تكرار گردد.

اطلاعات مربوط به نمونه
نمونه‌هاي فاقد برچسب ارزشي ندارند. بنابراين هر نمونه بايد داراي برچسب‌هايي كه اطلاعات مربوط به محل و زمان صيد نمونه،‌ و ميزبان (در مورد اكتوپارازيت‌ها) در آن درج شده،‌ باشد.
اطلاعات جغرافيايي، بايد شامل كشور، بخش كشور (استان، ‌ناحيه يا شهرستان)، جهت‌يابي با ذكر خصوصياتي از قبيل نام روستا، رودخانه، ارتفاع محل و … باشد.
اطلاعات برچسب بايد ارائه كننده تاريخ صيد بر حسب روز، و همراه نمونه باشند. يعني به سوزني كه نمونه خشك مونته شده به آن متصل است، الصاق گردند؛ يا در زير ويال‌ها (در مورد نمونه‌هايي كه به صورت مايع نگهداري مي‌شوند) قرار گيرند و اگر نمونه‌ها به صورت لام ميكروسكوپي مونته شده باشند، به لام‌ها چسبانده مي‌شوند.

ارسال نمونه‌ها از طريق پست
در صورتي كه براي تشخيص نمونه نياز به يك متخصص باشد، و يا براي ساير مقاصد، از قبيل ارسال نمونه براي قرار گرفتن در يك كلكسيون مرجع، مي‌خواهيد آن را از طريق پست ارسال نماييد؛ نياز به بسته‌بندي خاصي مي‌باشد. متأسفانه بسياري از نمونه‌ها به صورت شكسته شده يا با خسارت‌هاي غير قابل جبران به مقصد مي‌رسند. اين امر تقريباً بيشتر به خاطر بسته‌بندي نادرست و ضعيف آنها مي‌باشد، تا به خاطر اهمال و بي‌دقتي در سرويس‌هاي پستي. از خسارت ديدن نمونه مي‌توان با رعايت احتياطات ساده‌اي جلوگيري به عمل آورد.

نمونه‌هاي موجود در مايعات بايد در داخل ويال‌هاي پلاستيكي يا شيشه‌اي كه داراي يك درب پيچ‌دار هستند، ارسال شوند (مثلاً لوله‌هايي كه در كشت انگل و ميكروبيولوژي كاربرد دارند)، و نبايد در لوله‌هايي كه با چوب پنبه يا قطعات پلاستيكي مسدود شده‌اند، قرار گيرند. در صورتي كه ويال‌هاي شيشه‌اي به دقت بسته‌بندي شوند، امنيت آنها به اندازه انواع پلاستيكي است، اما از هر نوعي كه استفاده مي‌شود، درپوش‌هايشان بايد با چسب بسته شوند، تا خطر تراوش مايع و خشك شدن محتويات لوله كاهش يابد. از ظروف چوبي توخالي موجود در بازار مي‌توان براي پست كردن ويال‌هاي با اندازه‌هاي مختلف، استفاده نمود. هر ويال بايد در داخل اين لوله‌ها با نوارهاي دستمال كاغذي كه در اطراف آن چپانده مي‌شود، در جاي خودش فيكس شود تا نمونه‌ها در حين انتقال تكان نخورند و بدن آنها متلاشي نشود.

براي ارسال پستي حشراتي كه به صورت خشك سوزن زده شده‌اند، بايد آنها را در يك جعبه محكم و تانشو، لاستيكي يا چوبي كه آن هم به نوبه خود در يك كارتن بزرگتر قرار مي‌گيرد، بسته‌بندي كرد. تقريباً همه خسارتي كه به نمونه‌هاي سوزن زده شده در پست وارد مي‌شود، در اثر فقدان يا ضخامت كم و ناكافي بسته‌بندي اطراف آن‌ها و جعبه محتوي نمونه مي‌باشد. حداقل ضخامت ۸ سانتيمتر از ماده بسته‌بندي نرم (مثل پلاستيك حباب‌دار)، يا پشم چوب بايد در اطراف هر سطحي حتي يك جعبه نمونه كوچك، و بيشتر براي جعبه‌هاي ذخيره بزرگ مورد استفاده قرار گيرد. فضاي بين نمونه‌هايي كه به صورت سوزن زده شده ارسال مي‌شوند، بايد طوري تنظيم شود كه اگر نمونه‌ها به صورت تصادفي در حين حمل و نقل بچرخند، با يكديگر برخورد نكنند. يك قطعه پنبه بايد در گوشه جعبه قرار داده شود تا قطعات شكسته شده بدن نمونه‌ها در آن گير كنند و به بقيه صدمه نزنند.

محتويات بسته ارسال شده، به صورت متداول روي سطح خارجي آن يا روي هر فرم لازم به صورت “ نمونه براي مطالعه علمي؛ فاقد ارزش تجاري” بايد نوشته شود. اين كار باعث مي‌شود كه در موقع بازرسي گمرك، جعبه را باز نكنند و محتويات آن آسيب نبيند.

روش‌هاي مطالعه آزمايشگاهي و صحرايي گروههاي مختلف بندپايان مهم پزشكي
فصل اول
پشه‌ها (Culicidae)
الف) روش‌هاي انجام مطالعات صحرايي
با توجه به اهميتي كه پشه‌هاي زير خانوادة آنوفلينه در انتقال مالاريا دارند، در اين بخش بيشتر روش مطالعه اين گروه از پشه‌ها را توضيح مي‌دهيم. با وجود اين، اكثر روش‌هاي مطالعه را در مورد كوليسينه‌ها هم مي‌توان به كار برد. در موارد خاص هم روش‌هاي مطالعه اين زير خانواده ذكر شده است.

۱ – جمع‌آوري تخم پشه‌ها
تخم‌هاي پشه‌ها را مي‌توان به صورت شناور در سطح آب اماكن تخمريزي مشاهده كرد و آنها را به كمك يك كف‌گير يا يك تشتك لعابي كوچك يا عميق‌تر جمع‌آوري نمود. يك روش ساده براي جمع‌آوري تخم‌ها استفاده از دستكش‌هاي Barbe است (دستكشي كه انگشت شست آن جدا و ساير انگشتان آن با هم يكي است). اين دستكش كه از ململ سفيد يا ساير پارچه‌هاي متخلخل كه داراي بافت محكمي است ساخته شده، به دست چپ پوشيده مي‌شود (شكل۱). آب جمع‌آوري شده در ظرف يا ملاقه، كم‌كم از قسمت كف دست دستكش عبور داده مي‌شود. هر لكه سياه مشكوك كه بر روي سطح سفيد باقي‌مانده، مورد بررسي قرار مي‌گيرد. پس از كسب مقداري تجربه در اين روش، تشخيص تخم‌ها از مواد ديگر كار آساني خواهد بود. به منظور انجام مطالعات بيشتر بايد تخم‌ها را جدا كرد و روي كاغذ صافي مرطوب گذاشت و آنها را درون لوله‌هاي شيشه‌اي كوچك درپوش‌دار به آزمايشگاه منتقل نمود. پارچة سفيد را مي‌توان درون قاب‌هاي مخصوص گلدوزي و يا ساير وسايل مشابه، به صورت محكم ثابت كرد. همچنين مي‌توان از آن به جاي دستكش براي تصفيه آب استفاده نمود.

۲ – جمع‌آوري لاروها و شفيره‌ها
۲ – ۱ – لوازم مورد استفاده
از وسايل مختلفي براي جمع‌آوري لاروها يا شفيره‌ها از اماكن لاروي استفاده مي‌شود. نوع اين ابزار بسته به شرايط و ترجيح افراد مختلف از يك ملاقة حشره‌شناسي تا يك ظرف لعابي يا قاشق چيني متفاوت است، اما براي مطالعات مقايسه‌اي بهترين كار استفاده از يك ملاقه استاندارد به ظرفيت حدود ۴۰۰ ميلي‌ليتر است. بايد قسمت داخلي ملاقه سفيد باشد و يك دريچة توري‌دار كه با يك صفحه از قسمت بيرون محافظت مي‌شود، در يك طرف آن وجود داشته باشد، به طوري كه آب را بتوان بدون از دست دادن لاروها خارج نمود (شكل۲). در برخي موارد متصل كردن يك دسته چوبي محكم نشكن به ملاقه مفيد است. اين كار نه تنها دامنه عمل ملاقه را افزايش مي‌دهد، بلكه براي مقابله با حملات موجوداتي از قبيل مارها كه گاه در لابلاي گياهان موجود در اماكن لاروي استراحت مي‌كنند هم مي‌توان از آن استفاده نمود. براي جمع‌آوري نمونه از چاههاي آب مي‌توان از يك توري سنگين مخروطي شكل استفاده نمود (شكل۳). در اين روش بايد اين توري را كاملاً در داخل قسمت وسط سطح آب فرو برد و سپس از قسمت كناري ديوار چاه بالا كشيد (شكل۴). يك وسيله مناسب ديگر براي استفاده در چاهها يك ملاقه متصل به يك دسته بلند است. زاويه اتصال اين دسته با ملاقه كم است و يك پيچ شستي شكل دارد كه به كمك آن مي‌توان ملاقه را در يك زاويه مناسب جهت استفاده تنظيم كرد.

براي خارج كردن لاروها و شفيره‌ها از ملاقه، مي‌توان از يك پيپت دهان گشاد مانند يك قطره چكان معمولي پزشكي كه انتهاي باريك آن بريده شده، استفاده كرد. تعدادي بطري براي حمل شفيره‌هاي صيد شده به آزمايشگاه لازم است. بدين منظور جارهاي ۲۵۰ سي‌سي Mason كه سيم‌هاي فنري براي قرار دادن يك پوشش روي آن دارد، مفيد است؛ زيرا آنها را مي‌توان به سهولت روي كمربند بست. بر روي هر جار بايد يك برچسب كوچك كه روي آن تعداد صيد نوشته مي‌شود، چسباند. همچنين براي هر مكان لاروي كه از آن نمونه‌گيري به عمل مي‌آيد، بايد يك بطري جداگانه تهيه گردد. بطري‌ها بايد تا حدود ظرفيتشان از آب همان زيستگاه لاروي كه نمونه از آن جمع‌آوري شده، پر شوند.

برخي از محققين ترجيح مي‌دهند كه نمونه‌هاي جمع‌آوري شده خود را در ظروف شيشه‌اي درپيچ‌دار كوچك قرار دهند و آنها را درون يك كمربند حجره‌دار حمل كنند. در غير اين صورت بايد از يك جعبه استفاده كرد و بهترين وسيله براي اين كار جعبه‌هاي چوبي يا پلاستيكي است كه يك صفحه سوراخ‌دار در كف آن قرار دارد و بطري‌ها را مي‌توان در داخل آنها قرار داد. در صورتي كه وسيله حمل و نقل و جابجايي وجود نداشت، مي‌توان از يك كيف مخصوص وسايل نقاشي استفاده نمود (شكل۵). پوتين‌ها يا چكمه‌هاي پلاستيكي، يك قطب نما، يك چاقوي بلند و يك دفترچه يادداشت مناسب نيز از ديگر وسايل لازم به شمار مي‌روند.

۲-۲- روش ملاقه‌زني
بايد در نظر داشت كه لاروها و شفيره‌هاي آنوفلينه معمولاً در سطح اماكن لاروي يافت مي‌شوند، مگر اين كه در اثر تلاطم آب، سايه و يا تكان خوردن رويش گياهي يا وسيله‌اي كه به آن چسبيده‌اند، برآشفته شوند. آنها در موقع احساس خطر به سمت پايين حركت مي‌كنند و ممكن است به مدت چندين دقيقه مخفي باقي بمانند. بنابراين اغلب بايد تلاش كرد تا بتوان آنها را قبل از اين كه برآشفته شوند، در سطح آب به كمك ملاقه صيد نمود (شكل‌هاي۶و۷).

موقعي كه منطقه تخمريزي روباز است، ملاقه بايد در سطح آن (مثل كف‌گير) حركت داده شود، به طوري كه لبه آن دقيقاً‌ در زير سطح آب قرار گيرد. اما موقعي كه لاروها در لابلاي ساقه‌هاي گياهان وجود دارند، يا به برخي از وسايل شناور چسبيده‌اند، يا در كناره مخزن قرار دارند، از روش مكيدن استفاده مي‌شود. در اين مورد آب سطحي با كج كردن لبه ملاقه در زير سطح آب با فشار وارد آن شده و لاروها به كمك آن بيرون كشيده مي‌شوند. نبايد ملاقه را بي‌هدف در اماكن تخمريزي چرخاند، بلكه بايد حركات قطعي و واضحي انجام داد. اگر ملاقه بيش از حد پر شود، بسياري از لاروها ممكن است از آن خارج شوند. اگر آب گل آلوده (تيره) و يا مملو از گياهان كوچك يا آشغال باشد، مي‌توان از پيپت براي خارج كردن لاروها از آب درون ملاقه استفاده نمود.

قبل از ملاقه‌زني مي‌توان از پاروهاي كوچك براي به هم زدن سطح آب استفاده كرد. آب گل آلوده زمينه‌اي را فراهم مي‌كند كه لاروها را پس از چند لحظه مي‌توان به سهولت در آن مشاهده نمود و تك‌تك آنها را به كمك پيپت يا قاشق مخصوص صيد كرد. براي جمع‌آوري لاروها از سوراخ‌هاي تنه درختان مي‌توان از يك پيپت بلند كه به يك حباب مكنده متصل است، استفاده نمود. اگر سوراخ تنه درخت خشك باشد، مي‌توان مقداري از مواد باقي‌مانده در آن را جمع‌آوري كرد. سپس در صورتي كه مواد مذكور در آزمايشگاه قرار داده شوند، ممكن است لارو از آنها بيرون بيايد؛ چرا كه گاهي اوقات مرحلة تخم در گونه‌هايي كه درون سوراخ درختان تخمريزي مي‌كنند، به خشكي مقاوم است و پس از يك دوره خشكي با فراهم شدن آب به لارو تبديل مي‌شود.

در جمع‌آوري لاروهاي مانسونيا لازم است كه گياه Pistia يا ساير گياهاني كه اين لاروها به آن مي‌چسبند، بيرون كشيده شوند و از نظر وجود لارو بر روي ساقه يا ريشه مورد بررسي قرار گيرند. لاروهاي موجود بر روي آنها بايد به كمك آب به داخل يك ظرف لعابي شسته و منتقل شوند. با يافتن تعداد كمي از لاروهاي سنين اول نمي‌توان يك محل را به عنوان يك مكان تخمريزي معرفي كرد، چرا كه معلوم نيست اين لاروها بتوانند دوره زندگي خود را تحت اين شرايط به پايان برسانند و به فرد بالغ تبديل شوند. بايد شك كرد كه اين مكان ممكن است براي گونه موجود در آن يك زيستگاه لاروي تا حدي حائز اهميت باشد.

اگر ۱۰ ملاقة زده شده در يك متري لبة زيستگاه لاروي عاري از لارو باشد، مي‌توان آن محل را تحت عنوان منفي در زمان بررسي قلمداد كرد. بايد توجه داشت كه نتايج منفي گاهي اوقات ممكن است مربوط به بي‌تجربگي فرد جمع‌آوري كننده، استفاده از سموم لاروكش‌ در محل، تغييراتي كه اخيراً در ميزان آب محل صورت گرفته، يا علل ديگري باشد. بنابراين، محلي كه منفي بود، الزاماً نبايد از بازديدهاي بعدي حذف شود.
جمع‌آوري لاروها و شفيره‌ها مستلزم تمرين و تجربه بوده و جمع‌آوري از آب گاهي بدون ورود به آن غير ممكن است. سرانجام، شخص نبايد هميشه به ظاهر كلي يك مكان اعتماد كند و ملاقه‌زني را فقط در زماني كه اين محل را مناسب تشخيص داد انجام دهد. گاهي اوقات، به ويژه در فصول خشك، لاروها در مكان‌هاي غير طبيعي يافت مي‌شوند.

۲-۳- نمونه‌گيري اختصاصي
در صورت انجام مطالعات كمّي، بايد لاروهاي سنين مختلف به صورت جداگانه شمرده شوند. تعداد ملاقه‌ها هم بايد ثبت گردد. همچنين ثبت زماني كه صرف ملاقه‌زني شده نيز مفيد است. بر اساس مطالعات انجام شده، مشخص گرديده كه همبستگي خوبي بين لگاريتم‌هاي ميزان صيدهاي لاروي ماهيانه و همچنين عامل جمع‌آوري منطقه‌اي كه در آن ملاقه‌زني انجام شده، با زماني كه صرف ملاقه‌زني شده وجود دارد. نتايج اين مطالعات نشان داده كه محاسبه يك نسبت ساده، يعني لاروهاي صيد شده تقسيم بر دقايقي كه صرف ملاقه‌زني شده، بهترين معيار براي محاسبه تراكم لاروها در يك مكان لاروي است.
يك روش ديگر براي انجام مطالعات كمي به شرح زير است:

واحدهاي ۱-۵/۰ متر مربعي سطح آب را در قاب‌هاي تخته‌اي به عمق ۱۵ سانتيمتر محصور مي‌كنند. تمام لاروهاي موجود در اين قسمت جمع‌آوري و به دقت تفكيك مي‌شوند. نتايج بدست آمده را مي‌توان به عنوان تراكم در واحد سطح بيان كرد و وفور نسبي لاروهاي مختلف را به صورت جدول ارائه داد. اين روش به ويژه در جايي كه مواد شناور در سطح آب زياد هستند و يا جايي كه رويش گياهي بسيار متراكمي دارد، توصيه مي‌شود.

از قوطي‌هاي حلبي با مساحت قاعده ۱۰ تا ۱۵ سانتيمتر مربع هم مي‌توان استفاده كرد. اين ظروف بايد در هر دو انتها باز باشند و طول كافي براي اين كه آنها را بتوان در حين مطالعه در كف زيستگاه لاروي قرار داد، داشته باشند؛ ضمن اين كه سطح رويي آن بالاتر از سطح آب قرار گيرد. طول اين وسايل از ۱۰ تا ۳۰ سانتيمتر براي استفاده در آب‌هاي داراي عمق مختلف فرق مي‌كند. اين قوطي‌هاي حلبي با كمترين ايجاد آشفتگي در زيستگاه لاروي در كف آن گذاشته ‌شده، تعداد لاروها و شفيره‌هاي موجود در آنها شمرده مي‌شوند و متوسط آنها در واحد سطح بر‌آورد مي‌گردد (شكل ۸). گاهي اوقات در موقعي كه از چنين قوطي‌هاي حلبي براي تخمين تعداد لاروها استفاده مي‌شود، مي‌توان توري‌هايي را در بالاي اين ظروف نصب نمود تا افراد بالغي را كه از آن زيستگاه لاروي خارج مي‌شوند، شناسايي كرد. بدين منظور، يك توري كه منطقه‌اي به وسعت ۱۸۰ سانتيمتر مربع و ارتفاع حدود ۱۵۰ سانتيمتر را مي‌پوشاند، ‌مناسب به نظر مي‌رسد.

لبه‌هاي زيري توري بايد از مواد سنگين ساخته شده، با يك قاب چوبي به سمت پايين كشيده شده، و محكم در گل كف محل فرو برده شود. يك ورودي مناسب براي هر يك از اين محفظه‌هاي توري تعبيه شده و به دقت پس از هر بازديد مسدود مي‌گردد. درب‌هاي زيپ‌دار براي اين كار مناسب هستند. بايد مطمئن شد كه هيچ عنكبوت يا سنجاقكي درون توري وجود نداشته باشد تا به شكار پشه‌ها بپردازد. اين توري‌هاي را بايد هر روز بلافاصله پس از طلوع آفتاب به مدت ۲ هفته يا بيشتر بازديد كرد و بالغين متولد شده را جمع‌آوري و شمارش نمود (شكل۹).

استفاده از قوطي‌هاي حلبي شمارش و توري‌هاي خروجي بالغين، گاهي اوقات حقيقت مهمي را نشان مي‌دهد. بدين ترتيب كه هيچ تضميني وجود ندارد تا يك جمعيت زياد از لاروها، يك جمعيت زياد افراد بالغ را توليد نمايد. بنا به دلايل متعدد درصد بالايي از لاروها ممكن است نتوانند به شفيره تبديل شوند.

از ساير وسايل مي‌توان به تله‌هاي اتوماتيك اشاره كرد. اين وسيله شامل يك لوله، قيف مخروطي، تغليظ كننده (كنسانتره كننده)‌ و سطل است. موقعي كه لوله در موقعيت خاص خود قرار داده مي‌شود، لاروها به كف آن مي‌روند. سپس قيف در داخل لوله در نزديكي برجستگي كف آن قرار داده مي‌شود. در مدت ۱۰ تا ۲۰ دقيقه لاروهاي محصور در قسمت زيري قيف داخل شده و از طريق مجراي انتهايي آن به لوله وارد مي‌شوند. تغليظ كننده يك لوله مخروطي نوك تيز است كه قسمتي از آن از طرف بالا در لوله اولي فرو مي‌رود. ديواره‌هاي آن چهار مجراي پوشيده با توري به اندازه ۸ مش در هر سانتيمتر دارند كه به لاروها اجازه عبور مي‌دهد. همچنين سطل داراي ۴ سوراخ جانبي است كه با توري ۶۰ مش پوشيده شده است. يك آستين توري هم در بالاي تغليظ كننده نصب مي‌شود.

يك چوب پنبه در سوراخ قيف قرار داده مي‌شود، سطل به تغليظ كننده چسبيده و تغليظ كننده به لوله متصل شده است. تله توسط دستگيره‌ها آويزان ‌شده، بالا برده و سپس وارونه مي‌شود تا خشك گردد. سپس سطل را خارج كرده پيچ‌هايش را باز مي‌كنند و محتويات آن را در يك جار ۲ اونسي مي‌ريزند. لاروهاي بدست آمده از اين روش را مي‌توان در شرايط صحرايي يا آزمايشگاه شمارش نمود.

۳ – انتقال لاروها
لاروهاي زنده آنوفلينه را مي‌توان با رعايت دقت كافي تا فواصل قابل ملاحظه‌اي انتقال داد. جارهاي ۲۵۰ سي‌سي كه در بالا ذكر شدند و تا آنها پر از آب مي‌شود و مقداري جلبك به آن افزوده مي‌گردد، بدين منظور بسيار مناسب هستند. در صورتي كه ظرف بهتري در دسترس نبود، مي‌توان ني‌هاي موجود در مكان لاروي را به صورت ظروف مناسب بريد و مورد استفاده قرار داد.
اگر وسيله نقليه براي اين كار داراي تكان زيادي باشد، بايد آب را روي يك توري يا پارچه پاشيد تا لاروهايي را كه به قسمت لبه‌هاي ظرف رفته‌اند، مرطوب نگه دارد. آنها در اين صورت چندين ساعت زنده مي‌مانند و شرايط بهتري را نسبت به موقعي كه در آب متلاطم فرو مي‌روند، خواهند داشت.

براي انتقال در فواصل دورتر، يا براي انتقال لاروها از طريق پست، استفاده از يك چوب پنبه منفذ‌دار، همانند آنچه كه در شكل ۱۰ نشان داده شده، الزامي است. با پر كردن بطري تا يك ارتفاع معين، اكسيژن لازم براي لاروها فراهم مي‌گردد و همزمان از هر گونه نشط احتمالي آب، صرف‌نظر از وضعيتي كه بطري ممكن است در آن قرار داده شود، جلوگيري به عمل مي‌آيد.
استفاده از جعبه‌هاي فلزي را كه هر كدام با يك پارچه مرطوب (براي انتقال بدون آب لاروهاي زنده) پوشانده شده، توصيه مي‌گردد. توري‌هاي فلزي براي جدا كردن جعبه‌هايي كه در داخل آنها يك ظرف فلزي سبك قرار دارد، استفاده مي‌شوند. اين ظرف را مي‌توان به نوبه خود در يك پارچه مرطوب قرار داد. بخار حاصله از اين پارچه مرطوب، از افزايش بسيار بالاي دما كه در موقع انتقال ممكن است در اثر تابش مستقيم نور آفتاب به جعبه ايجاد شود، جلوگيري مي‌كند. لاروها به صورت رضايت‌بخشي براي چندين روز زنده مي‌مانند و در اين مدت ممكن است تعدادي از آنها به شفيره و سپس به پشه بالغ تبديل شوند.

۴ – ايستگاههاي جمع‌آوري
يك بررسي اوليه به منظور صيد و مطالعه لاروهاي آنوفل‌ها در يك منطقه ممكن است لازم باشد. اين كار را مي‌توان از طريق نمونه‌گيري از همه انواع اماكن لاروي آن منطقه و يا در نقاطي از يك منطقه محدود كه در آن لاروها مي‌توانند زنده بمانند، انجام داد. متعاقب اين بررسي مي‌توان منطقه مناسب براي مطالعه در طول فصل فعاليت پشه‌ها، اجراي برنامه كنترل و يا مطالعات مداوم چندين ساله را پيدا كرد. وقتي مشاهدات مستمر چند ساله طراحي مي‌شوند، انتخاب ايستگاههاي جمع‌آوري براي بازديد‌هاي منظم و ملاقه‌زني به روش استاندارد در فواصل مناسب ضروري به نظر مي‌رسد.

در بعضي از پروژه‌ها يك نوبت بازديد در هفته ممكن است لازم باشد، در حالي كه در بقيه آنها ممكن است يك نوبت بازديد در هر دو هفته يا حتي هر ماه كافي باشد. به هر حال، در هر مورد داشتن نمونه‌هاي آن محل كه به يك روش صيد شده‌اند، براي مقايسه مفيد است. فرد محقق بايد تلاش كند ايستگاههايي را انتخاب نمايد كه نمايندة منطقه مورد مطالعه يا مشكل موجود باشد. برخي از آبگيرها ممكن است اماكن تخمريزي موقتي باشند، لذا بايد محل‌هايي انتخاب شوند كه در تمام دورة مطالعه آب داشته باشند. در همه اماكن انتخاب شده بايد لارو وجود داشته باشد، مگر اين كه در زمان انجام مطالعه مقدماتي در آنها اقدامات كنترلي صورت گرفته باشد. همه ايستگاهها بايد به خوبي در روي يك نقشه مناسب علامتگذاري شوند و به هر يك بايد يك نام يا شماره داده شود. در موقع انتخاب ايستگاه، فيلد مربوطه نيز بايد به دقت توصيف شود و هر گونه تغييرات معني‌دار با پيشرفت فصل بايد يادداشت گردد. صرف زمان كافي در انتخاب ايستگاههاي جمع‌آوري براي اطمينان از اين كه آيا آنها نمايندة منطقه هستند و آيا نيازهاي يك پروژه خاص را كه براي آن انتخاب شده‌اند تأمين مي‌كنند، به زحمتش مي‌ارزد.