بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها

خلاصه :
کریپتوسپوریدیایی انسان ها یک بیماری روده ای است که معمولاً به علت عفونت در cryptosporidium hominis یا c-parvum به وجود می آید . این بیماری بیشتر از راه دهان – مدفوعی منتقل می شود (آب یا غذا) و اثر اجتماعی – اقتصادی عمده ای در جهان دارد .

عامل اصلی در پیشگیری ، مراقبت و کنترل کریپتوسپوریدیایی ، تشخیص و ویژگی ژنتیکی گونه های عمده و گوناگونی جمعیت ( که ژنوتیپ یا subgenotye هم خوانده می شود ) کریپتوسپوریدیای منتقل شده به انسان است به خصوص اینکه در حال حاضر هیچ شیمی درمانی موثر ضد کریپتوسپوریدیا یا واکسنی وجود ندارد . در این تحقیق ، ما با استفاده از

دومین جدا کننده رونویسی داخلی (ITS-2) DNA ریبوزومی هسته ای به عنوان نشانه ژنتیکی ، روش بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) واکنش زنجیره ی پلیمری جفت شده را برای تشخیص سرایت c-parvum, Cryptosporidium hominis یا c.meleagridis بنا کردیم . یک ارزیابی از منحنی ، تغییر پذیرهای داخلی کوچکتر از %۱٫۵ و تغییر پذیری های معیاری

داخلی کوچکتر از %۳٫۵ را معلوم کرد . c.parvum , Cryptosporidium hominis و c.meleagridis با استفاده از ۱۴۳ نمونه DNA ی انگل های کریپتوسپوریدیم که از استرالیایی های مبتلا به کریپتوسپوریدیا گرفته شده به ترتیب در سال های ۲,۴۴,۹۷ کشف شدند . منحنی های ذوبی که با حداکثر دمای c°۳۳/۰ ± ۴۷/۷۲ درجه و c°۴۵/۰ ± ۱۹/۷۴ درجه سانتی گراد (

نمودار۱) ، c°۳۲/۰ ± ۱۷/۷۲ (نمودار ۲) و c°۰۳/۰ ± ۳۳/۷۳ (نمودار۳) مشخص می شوند به طور ژنتیکی به ترتیب به عنوان c.hominis c.parvum , و c.meleagridis شناخته می شوند . در نتیجه ، بررسی ذوب PCR جفت شده ی ITS-2 باعث تشخیص c.hominis c.parvum , و c.meleagridis شد . این راه مناسب ترین راه برای آزمایش سریع تعداد زیادی از نمونه های DNA ی انگلی کریپتوسپوریدیم است و اگر چه کیفی است نسبت به بررسی الکتروفورتیک به طور قابل توجهی زمان کمتری برای اجرا می گیرد و مزیت افزوده ذخیره ی اطلاعات و قابلیت آنالیز در سیلیکو را نیز دارا می باشد . این روش ابزار مناسبی برای بررسی همه گیری و شیوع کریپتوسپوریدیا را در اختیار می گذارد و قابل اجرا برای انواع دیگر کریپتوسپوریدیا به جز آن هایی که در این جا بررسی شد ، می باشد .

 

۱٫ مقدمه :
کریپتوسپوریدیای انسانی معمولاً یک بیماری روده ای است که توسط انواع کریپتوسپوریدیا ایجاد می شود و به وسیله راه های دهانی – مدفوعی منتقل می شود [۱] . این بیماری به طور ناگهانی اتفاق می افتد [۲و۳] اما عموماً به دوران کودکی – مراکز مراقبت مربوط می شود و از استخرهای شنا یا آب های نوشیدنی منابع سرایت می کند . [۴-۹] . بحث دوم که

مهم است ، این است که انگل های اولیه Cryptosporidium در مقابل مواد ضد عفونی کننده مثل کلر که عموماً برای پاکسازی آب استفاده می شود ، مقاوم هستند [۱۰-۱۲] . شیوع های از راه آب که از کشورهای توسعه یافته مثل آمریکا و کانادا گزارش شده اند و قابل توجه ترین آن که در سال ۱۹۹۳ در Milwaukee اتفاق افتاد منجر به ۵۰۰۰ مورد تایید شده و بیش از ۴۰۰،۰۰۰ مورد مشکوک به کریپتوسپوریدیا شد [۴و۵و۱۳و۱۴] . به علت حالت جهندگی انگل ها در آب و محیط [۱۵] ، هزینه نسبتاً بالا و دسترسی محدود به ترکیبات شیمیایی یا

رژیم های درمانی یا واکسیناسیون در انسان ها و دیگر حیوانات [۱۶-۲۰] و اثر اجتماعی – اقتصادی آن ( مخصوصاٌ در جوامع انسانی که در آن ایدز / HIV شایع است ) . کریپتوسپوریدیا توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) به عنوان یک عامل بیماری زا که کیفیت آب را نشان می دهد ، رده بندی شد [۱۲] . تشخیص قاطع کریپتوسپوریدیا در انسان ها که شامل شناسایی و تشریح خصوصیات انواع کریپتوسپوریدیا است ، عامل اصلی در کنترل این بیماری و فهمیدن عواقب همه گیری آن است . محدودیت های قابل توجهی با بکارگیری روش های سنتی ، میکروسکوپی ، بیوشیمیایی و سرم خونی برای تشخیص قاطع وجود داشته اند به طوری که ابزارهای ژنتیکی – مولکولی پیشرفته شناسایی و توسعه یافته اند [۲۲] . با

استفاده از این ابزارها در حال حاضر ، بیش از ۱۸ نوع کریپتوسپوریدیا و تعداد زیادی ژنوتیپ شناخته شده است [۶و۲۳و۲۴] که c.hominis و c.parvum نوع غالب آن ها هستند و در انسان ها پر اهمیت ترین هستند ( به جز تعداد معدودی ، بقیه انواع هم اغلب به این دسته تعلق دارند ) ( مثل [۲۶-۲۸] ) . ابزارهایی که بر مبنای وواکنش زنجیره ی پلیمری (DCR) هستند به طور گسترده ای به کار گرفته شده اند ، چون حساسیت آنها گسترش خاصی از مکان ژنتیکی را از مقدار ناچیزی از مواد انگلی مجازی دارد [۲۹] . مکان های مختلف که شامل واحد تبعی کوچکی [۶۶۷] از فضاگیرهای RNA ریبوزومی هسته ای و DNA ی ریبوزومی (rDNA) ، پروتئین چسبناک مربوط به ترومبوسپونوین (trop) ، پروتئین شوک حرارتی

(hsp70) 70KDa و ژن های پروتئین دیواره انگلی کریپتوسپوریدیا (cowp) می شود ، برای شناسایی و اختلاف بین انواع کریپتوسپوریدیا و متغییرهای ژنتیکی ( ژنوتیپ و ژنوتیپ وابسته) به کار گرفته می شوند [۲۲] . اخیراً ، PCR جفت با روش های پویش جهشی الکتروفوز ترکیب شده با زنجیره ی DNA ، برای این هدف به کار گرفته می شوند [۳۰-۳۱] . برای مثال ، برای غلبه بر محدودیت هایی که در آنالیز تغییر پذیری متوالی در حین فرآورده های PCR وجود داشت پولیمر فسیم ( چند ریختی بودن ) ترکیبی تک استانداردی (sscp) ، برای نمایش مستقیم

اختلاف ژنتیکی در hsp70 , SSU و دومین فضاگیر داخلی رونویسی (ITS – ۲) هسته ای rDNA ی c.hominis و c.parvum معین شدند [۳۰-۳۶] . مزیت های این روش های الکتروفورزی (مثل خاص بودن ، حساسیت و قابلیت تکثیر کم و زیاد ) از میان نتایجی که از مقایسه مستقیم یک روش SSCP با تعدادی از روش های مختلف مولکولی که برای توصیف ویژگی های ژنتیکی یک نوع کریپتوسپوریدیای انتخاب شده بدست آمد ، اثبات شد [۳۷] . اگرچه این روش بسیار مفید و موثر است ولی آنالیز الکتروفورزی ، در بعضی موارد ، می تواند وقت گیر باشد

.
به علت نیاز افزوده به تشخیص با بازده بالا و بررسی ژنتیکی عامل بیماری و نیز جا به جایی اطلاعات ، بررسی ذخیره سازی در سیلیکو ، توجه قابل ملاحظه ای روی ارزیابی و گسترش روش های مرور جهش وجود داشته است که به مشخصه های ذوب امپلیکن ها و آنالیز الکتروفورزی گریزی وابسته است . این روش که خصوصاً برای آنالیز منحنی ذوب با تکنیک بالا (HRM) و منحنی ذوب مبتنی بر RCR به کار می رود ( مثال [۳۸-۴۱] ) و به طور قابل توجهی زمان مورد نیاز برای آزمایش را کاهش می دهد ، می تواند به سرعت بالای آشکارسازی

جهش برای امپلیکن های کوچک ( معمولاً bp100 تا ۲۵۰) برسد [۴۲ تا ۴۵] و منجر به نتایج کیفی و کمی شود . [۳۸و۴۶-۴۹] . در این تحقیق ، روش کاربردی آنالیز منحنی ذوب PCR جفت شده ارزیابی و بنا شد ، ITC – ۲ به عنوان ژنتیک ساز برای آشکارسازی نوع غالب کریپتوسپوریدیای سرایت شده به انسان به کار گرفته شد و در مورد دلایل این روش تشخیصی- مولکولی بحث شد .
۲- مواد و روش ها

۲٫۱ نمونه ها و جداسازی DNA ژنومی
نمونه های مدفوعی (۱۴۳ =n) از بیماران مبتلا به کریپتوسپوریدیا از استرالیا جمع آوری شدند . تشخیص کوپرولوجیکی کریپتوسپوریدیا بر اساس آشکارسازی انگل ها با استفاده از روش لکه دار کردن اصلاح شده ذیل – نیلسن ایجاد شده [۵۰] . DNA ژنومی همان طور که توسط مورگان و دیگران توصیف شده از نمونه های مدفوعی استخراج شد [۵۱] . در اصل ، نمونه های مدفوعی فردی در محلول نمک بافر فسفات (PBS) معلق بودند (۱:۴) . سوسپانسیون ( محلول ) یکدست و یکنواخت شده و lµ۲۰ از آن بیرون کشیده شد و به lµ۸۰ از (pvpp) (sigma) پلی پیرولیدرن پلی دینل %۱۰ معلق در H2O اضافه شد . بعد از اضافه شدن PVPP ، نمونه ها برای ۱۰ دقیقه در دمای c°۱۰۰ حرارت دیدند و سپس برای ۳۰ ثانیه در kg

۱۰،۰۰۰ سانتریفیوژ شدند . بعد از سانتریفیوژ ، هر یک از ذرات شناور به یک لوله جدید منتقل شد و کل DNA با استفاده از mini-column (Qiagen,copro-kit,Germany) براساس دستورالعمل سازنده جداسازی شد . نمونه های DNA ژنومی قبلاً براساس PCR ترتیب دهی شده با SSCP لوسی با SSU یا ژن گلیکو پرتئین KDa60 (gp60) به انواع مختلف طبقه بندی شد [۳۰ و ۳۱] .

 

۲٫۲ . توسعه آنزیمی و آنالیز منحنی ذوب :
ناحیه ی ITS-2 ( bp440 450 ، شامل توالی جانبی ) PCR ای بود که با استفاده از پریمرهای AP58SF (مستقیم : ۵′-ATC TCT CAA GCG AAA TAG CAG TAA-3′) و APITS-2R
(معکوس: ۵′-CCC ATT GAT AAA CGG ATT TCC-3′) از نمونه های DNA ژنومی فردی تقویت شد و خصوصاً به ترتیب برای ۵٫۸۵ زنجیره های ITS-2 rDNA ی محدوده ای از انواع کریپتوسپوردیا ( اعداد افزایشی AF093012 , AF093008 , AF015774 , AF015773 ) طراحی شده اند [۵۲ و ۵۳] .

با این طراحی ، همان طور که با مقایسه بین آنالیز سیلیکو در مقابل همه ی اطلاعات متوالی در دسترس در پایگاه داده جاری نشان داده شده ، هر یک از پریمرها برای نوع کریپتوسپوردیا معین بود ( به وسیله Gen Bank) . PCR در حجم lµ۲۵ شامل pmol 25 از هر پریمر ، mµ۲۰۰ از ۳٫۰mM , dNTP از mgcl2 ، lu پلیمر Gotaq ، (با بارگذاری رنگدار) (peomega) و mµ۸ از رنگینه اضافه شده (Invitrogen) SYTO9 ، با شرایط سیکل گرمایی زیر انجام شد : c°۹۴ ، ۵ دقیقه (تقلیب اولیه) ، با ۴۰ سیکل c°۹۴ و ۳۰ ثانیه ادامه پیدا می کند (تقلیب) ، c°۵۳/۳۰ ثانیه (بازپخت) و c°۶۸/s30 (انبساط) ، با انبساط نهایی در c°۶۸ برای ۱۰ دقیقه در یک چرخاننده گرمایی ادامه می یابد ( . . . ، Rotor-Gen ، پیکربندی HO65 ، Corbett Rescarch Pty Ltd ) .

و SYTO چون مانع PCR نمی شود و به علت پایداری افزوده اش و عملکرد آن در مقایسه با سایر رنگینه ها ، به عنوان رنگینه استفاده شد [۵۴ و ۵۵] . اندازه گیری های نوری در کانال بسته ( با استفاده از فیلتر دیجیتال ، با تحریک در nm479 و آشکارسازی در nm510 ) در انتهای هر مرحله انبساط ثبت شدند . تقریباً ng5-10 از DNA نوری به هر PCR اضافه شدند ؛ نمونه هایی بدون قالب DNA ای به عنوان کنترل های منفی در هر اجرای PCR وجود داشتند . کم ترین مقدار قالب های ژنومی که ۲ ITS – می تواند از آن ها تقویت شود و سپس روی ژل agarose نمایان شود حدود pg 1 تا ۲ تخمین زده شود (مثلا ً حدودا ً هم ارز ۴ انگل )(نشان داده نشده است) . برای آزمایش کردن ویژگی cPCp 19 نمونه ی DNA ی کنترلی نیاز است که شامل DNA از مدفوع یا خون انسانی که سابقه عفونت انگلی نداشته باشد و DNA از باکتری Lactobacillus acidophilvs , Escherichiacoli و L. gasseri ، مخمر

saaharomyces cerevisiae ، انگل های تک یا خته ای Giardia duodenalis و Entamoeba histolytica ؛ و کرم های انگلی S.mansoni ، Schistosoma japonicum ، Hymenolepis nana ، Taenia saginata ، T. solivan (کرم های پهن ) ، Ascaris sp ، Ancylostoma duodenale ، Necator americanus ، Strogyloides stercoralis ، oesophagostomum bifurcum ، Trichuris trichiura ( Nematoda) می شود که با این روش تقویت در ارتباطند . در ادامه ی PCR ، آنالیز منحنی ذوب امپلیکن ها که به وسیله افزایش دما از ℃۶۵ به ℃۸۰ با شیب متغیر افزایشی که از ۰٫۲ شروع می شود در چرخاننده گرمایی هدایت می شوند (Rotor – Gene 6000) با تغییرات دما تغییرات در فلورانس ضبط شده و رسم می شود . آنالیز HRM با استفاده از نرم افزار ۱٫۷٫۲۷ Rotor- Gene با متعادل سازی ناحیه های بین ℃۱۵/۶۵ – ۶۵/۶۵ و ℃۵۰/۷۹ – ۰۰/۸۰ و متوسط آستانه اطمینان حدود %۹۰ انجام شد .

 

۲٫۳ الکتروفورز ژل agarose ، پلی مرفی ترکیب یک طرفه (SSCP) و توالی DNA
شدت و کیفیت امپلیکن ها با استفاده از mM 65 از Tris-HCL T ، mM 27 از اسید برمیک ، mM 1 از اسید تترااستیک دیامین اتیلن (EDTA) ، (TBE) PH9 به عنوان بافر و یک استوانه bp100 به عنوان اندازه ساز ، روی برمید اتیدم %۱٫۵ (w/v) که باژل های agarose بی رنگ شده ، آزمایش و بررسی شوند .

آنالیز SSCP غیر ایزوتوپی براساس روش B انجام شد (۵۶) . امپلیکن های ITS-2 انتخاب شوند از روی ستون های کوچک پاک شده (wizard PCR prep) و در lμ ۳۰ از شسته می شوند و سپس به ترتیب دهی خودکار مرتبط می شوند (BigDge chemistry , Applied Biosystems) و در هر دو مسیر ، از همان پریمرهایی که برای PCR استفاده شد (به طور جداگانه) استفاده می شود . علامت های توالی نوکلئوتیدی وقتی با جستجوهای تشابه پایگاه داده غیر زائد GenBank در ارتباط بود بدست آمد .
(NCBI Basic BLASTN ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BIAST )

 

۳- نتایج . ۳٫۱۰ : ویژگی پریمزها و شرایطPCR و امپلیکن ها
ویژگی مجموعه ایستر AP58SF – APITS – ۲R و شرایط PCR برای توسعه محدوده ی ITS-2 با به کارگیری نمونه های مختلف DNA از خون یا مدفوع انسان (بدون اثری از عفونت انگلی) و نمونه های از محدوده ی ارگانیسم های پروکاریوتیک (باکتری) یا ایوکاریوتیک (مخمر ، تک یا فتگان ، trematodes ، cestodes و کرم های انگلی) و مراحل پیشرفته ای که در مجراهای روده ای یا مدفوع انسان اتفاق می افتد ، بنا شده است . کمترین مقدار DNA ژنومی c-parvum که با استفاده از مجموعه پریمز و به وسیله PCR قابل تقویت است ، در ۱تا ۲ صفحه تخمین زده شده بود که با تحقیق قبلی که با استفاده از منطقه ی کوتاهتری از ITS( به طور مشخص PITS-2 ؛ با میانجی گری ] ۳۳[ . انجام شد سازگار بود . سپس ، ویژگی امپلیکن

هایی که از نمونه های DNA ی ژنومی سوا شده ، استخراج شده اند و نمایانگر انگل های مجزا شده از c.hominis (3n=) و c-parvum (3n=) هستند ، بررسی شد . در ژل های agarose نوار دوتایی (حدود ۴۴۰ و bp 450) و نوار تکی (حدود bp450) مرتبا ً و به ترتیب c.hominis و c-parvum را نشان دادند . برچسب های زنجیره (> bp 200) با استفاده از

پریمزهای AP58SF یا APITS – ۲R از بین همه ی امپلیکن های ITS-2 (مستقیما ً) معین شدند و مقایسه زنجیره اطلاعات با آن ها در پایگاه داده جاری (AJ539190، Aj 539200، AJ539216، AJ539217، AFO93011، AFO93012) هویت مشخص هر امپلیکن را تایید کرد .

۳٫۲ . تشخیص تغییر پذیری های سنجش داخلی و سنجش میانی
با اثبات ویژگی ها، امپلیکن ها و شرایط PCR ، گام بعدی شناسای شخصیت ذوب امپلیکن های ITS-2 از c.hominis یا c-parvum بود . امپلیکن هایی که نشان دهنده نمونه های DNA ی کنترلی مرجع c.hominis (3 n= ؛ کدهای ch1 ، ch2 ، ch3 ) و c-parvum (3n= ؛ کدهای cp1 ، cp2 ، cp3 ) بودند ، در ابتدا برای برقراری سازگاری (تکرارپذیری) منحنی های ذوب برای نمونه ها در طول یک اجرا و در طول کل اجراها به کار گرفته شدند . (در پنج روز مختلف انجام شد .) ارزیابی دقیق تغییر پذیری های سنجش داخلی و سنجش میانی (کوواریانس) با محاسبه ی میانگین و کوواریانس دمای ذوب در طول ۱۰ تکرار از هر یک از سه نمونه در یک اجرا و در طول پنج اجرا ، انجام شد . برای منحنی ۱ (c.hominis) ، ضریب های سنجش

داخلی تغییر (واریانس) برای اولین نقطه ای اوج ذوب ۰٫۰۴ (ch1) ، ۰٫۰۸ (ch2) ، ۰٫۰۵(ch3) و برای دومین نقطه ذوب ۰٫۰۶ (ch1) ، ۰٫۱۰ (ch2) ، ۰٫۰۹ (ch3) بودند . برای منحنی ۲ (c-parvum ) ، ضرایب سنجش داخلی تغییر (واریانس) ، ۰٫۱۱ (cp1) ، ۰٫۰۱ (cp2) 0.02(cp3) بودند . برای منحنی ۱ (c.hominis) ، ضرایب های سنجش میانی تغییر (واریانس) ، ۰٫۱۴ (ch1) ، ۰٫۱۶ (ch2) ، ۰٫۱۵ (ch3) برای اولین نقطه ذوب و برای دومین نقطه اوج ذوب ،۰٫۲۵ (ch1) ، ۰٫۱۶ (ch2) ، ۰٫۱۲ (ch3) بودند . برای منحنی ۲ (c-parvum) ، ضرایب های سنجش میانی تغییر (واریانس) ، ۰٫۳۲ (cp1) ، ۰٫۲۲ (cp2) 0.19(cp3) بودند .
شکل ۱٫ منحنی های معرف در آنالیز منحنی ذوب امپلیکن های ITS-2 برای c.hominis (قرمز)،

c-parvum (آبی) یا c.meleagridis (سیاه) (بالایی) ، و منحنی های هنجار شده (نرمال شده) از همان اطلاعات (در پایین) .
جدول ۱ . نتایج بدست آمده از DNA ژنومی از کریپتوسپوریدیای مجزا شده از انسان های مبتلا به کریپتوسپوریدیا به وسیله آنالیز منحنی ذوب جفت شده با PCR امپلیکن ITS-2 ، و تعدادی نمونه با منحنی خاص .

بنابراین ، ارزیابی های گسترده تغییرپذیری های سنجش داخلی ومیانی را به ترتیب <%1.5 و %۳٫۵ نشان داد . ۳٫۳ دسته بندی نمونه ها بر مبنای آنالیز منحنی ذوب : در ادامه ، همه ی نمونه های آزمایشی DNA ی کریپتوسپوریدیا مربوط به آنالیز منحنی ذوب متصل به PCR بودند ( شکل ۱ . cf) . دسته بندی خاص نمونه ها (جدول ۱) با نتایجی که قبلا ً به وسیله ترتیب دهی جفت شده با SSCP ی SSU بدست آمده ، مطابقت داشت .] ۳۰،۳۱[ . در این تحقیق ، منحنی های ذوب به وسیله ی نقطه ی اوج های ℃۰٫۳۳± ۷۲٫۴۷ و ℃۰٫۴۵ ±

۷۴٫۱۹ (منحنی ۱) ، ℃۰٫۳۲ ± ۷۲٫۱۷ (منحنی ۲) و ℃۰٫۰۳ ± ۷۳٫۳۳ (منحنی ۳) مشخص شدند (جدول ۱) . امپلیکن هایی که از نمونه های منتخب برای نمایش منحنی ۱ (کدهای ۱۰ ch ، ۴۸ ch ، ۶۹ ch ، ۹۳ ch ، ۹۴ ch ) ، منحنی ۲ ( کدهای (۱cp ، ۲۳cp ، ۲۴cp ، ۷۵cp ، ۱۰۰cp ) ، و منحنی ۳ ( کد ۸۹ cm ) بودند ، به صورت تکه ای زنجیره ای ، و بر مبنای مقایسه با زنجیره های منتخب از پایگاه داده جاری (اعداد در دسترس AFO93012 ، AJ539190، AJ 539200، AJ539217، AJ539216 ، AFO93011، AFO381167) بودند ؛]

۳۳،۵۳،۵۷[ ، به ترتیب برای نمایش c.hominis ، c-parvum و c.meleagridisنشان داده شده اند . وجود دو نقطه ی اوج در منحنی ۲ ، به دلیل وجود دو گونه زنجیره اندازه ITS-2 (اختلاف در حدود bp 10) در امپلیکن ها خارج شده از c.hominis بود ؛ وجود دو نوع غالب توالی سازگار با یافته های مطالعه الکتروفورزی قبلی بود . ] ۳۳[

برای هر یک از سه نوع کریپتوسپوریدیا ، منحنی فلورانس نرمال شده از آنالیز HRM (شکل ۱ ، پایینی) ، که در آن کاهش تندی در فلوئورنس ثبت شد ، با منحنی ذوب مربوط به آن سازگار بود (شکل ۱ ، بالایی) .

۴٫ مباحث و نکات پایانی :
۱ اندازه ی امپلیکن های ITS-2 (bp 450 -440) استفاده شده در آنالیزهای کنونی بزرگتر از آن هایی بودند که معمولا ً برای آنالیز منحنی ذوب استفاده می شدند ، بنابراین کاهش احتمالی ظرفیت آشکارسازی جهش وجود داشت ولی با این حال ، هویت مشخص و تفکیک نمونه ها به دست آمد .