تاثیر لیزوزیم روی میکروارگانیزم های گرم مثبت کشته شده با حرارت

خلاصه :
تغییر در واکنش رنگی کننده گرمی که زمانی رخ می دهد که دوکسانان ولچی و استافیلوکوک آلباس گرم مثبت با لیزوزیم کشت می شوند به خاصر برداشت ترکیب اسیدریبونوکلئیک مجموعه گرمی است و تقریبا بواسطه هیدرولیز برخی پیوندهای شکر در پلی ساکاریدهای واقع شده در سطح سلول ایجاد می شود. لیزوزیم ، آنزیم موجود در سفیده تخم مرغ که مواد معلق زنده ریزترکیزه های پوده زی مستعد، مخصوصا ریزترکیزه لیزودکتیکوس ، را می کافند از زمان کشف آن توسط فلکمینگ در ۱۹۲۲ در معرض بررسی های متعدد بوده است . اینها توسط مسروبینوو نوپل ( ۱۹۳۸ ) و تامپسون ( ۱۹۴۵ ) مرور شده اند. این آنزیم یک

پروتئین بنیادی یا پلی پپتید باوزن مولکولی ۲۵۰۰-۱۸۰۰۰ حاوی تقریبا ۱۶% نیتروژن و ۲-۳% سولفور می باشد. جداسازی و تصفیه لیزوزیم اخیرا بهبود یافته با روشی که شامل جذب مستقیم آنزیم از سفیده تخم مرغ طبیعی با بنتونیت می باشد و تا شویش با پیریدین آبکی ۵% مطابق با PHS با اسید سولفوریک دنبال می شود .

نخستین تلاش برای بررسی عملکرد لیزوزیم توسط مپر، پالمر، تامیسون و کوراز ( ۱۹۳۶ ) انجام شد. متاسفانه این نویسندگان از آنزیم تهیه شده از گونه سارسینای پذیرای لیزوزیم سفیده تخم مرغ که دارای خواص مشابه آنزیم دوم است اما احتمالا حاوی سیستم آنزیمی خود …. سارسینا بوده است استفاده می کردند. این آنزیم روی پیوندهای قندی برخی کربوهیدراتهای حاوی قندهای آمین دار تاثیر خاصی دارد بنابراین از پیشنهاد و گفته اصلی هالائور حمایت می

کند . با این وجود این بافته برای لیزوزیم سفیده تخم مرغ بکار نمی رود . اپستین و چاین یک شکنه پلی ساکارید را از اجسام سلولی ریزترکیزه لیزودکتیکوس و باکتری های حساس دیگر که بواسطه لیزوزیم با تولید هگزو سامین استیل N هیدولیز می شود جدا کردند. پلی ساکارید در همه ارگانیزم های حساس نسبت به لیزوزیم یافت شد ، بیشترین مقدار باسیلوس سولتیلیس ، ارگانیزمی که بواسطه لیزوزیم کشته می شد اما کافته نمیشد ، موجود بود. میروهاهنل این

حقیقت را تائید کردند که لیزوزیم یک شکنه کربوهیدرات جدا شده از عصاره های هیدروکسید سدیم ارگانیزم های مستعد را هیدرولیز میکرد. مسیر عملکرد لیزوریم را بر حسب هیدرولیز یک پلی ساکارید در غشای باکتری توضیح می داد. این موکوپلی ساکارید که ظاهرا بطور محکم به غشای باکتری همبسته است ، نخست بواسطه لیزوزیم با جذب آب بعدی بواسطه این ارگانیزم و فروپاشی سلول تجزیه می شود. آنزیم های خودکافت ، فعال بعد از مرگ ارگانیزم ها ، تصور می شد تا حدودی مسئول آشکار کردن مواد معلق باکتری می باشند.

تاثیر لیزوزیم روی باکتری گرم مثبت
ممکن است که خنثی سازی حرارتی سیستمهای آنزیمی خود کافت در توضیح مقاومت سلولهای کشته شده در مقابل کافتندگی کامل بواسطه لیزوزیم نسبت به این حقیقت که پروتئین های سلولی روی حرارت نا محلول می شوند ، از اهمیت بیشتری برخوردار باشد. کافتندگی باکتری بواسطه لیزوزیم بواسطه تبدیل سلولهای گرم مثبت به اشکال گرم منفی مقدم می باشد ، این نیز زمانی رخ می دهد که مواد معلق سلولهای کشته شده با حرارت با لیزوزیم کشت می

شوند . تامپسون و دوبوس نشان دادند که نخستین قدم خود کافت پنوموکوک سخت نوع II ، یعنی تبدیل آن از گرم مثبت به گرم منفی بدون فروپاشی ساختار سلولی ، بواسطه ازادسازی ریبونوکلئوپروتئین و اسیر ریبونوکلئیک انجام می شود. اخیرا هنری و استاسی نشان داده اند که سلولهای مناسب گرم مثبت می تواند بواسطه استخراج با محلول کولیک سدیم در ۶۰ درجه به گرم منفی فرمالدئید رقیق در محلول نمک ۸۵% ، می توانند دوباره با ریبو کلئات منیزیم استخراج شده از همان میکروارگانیزم های دیگر ترکیب شوند تا دوباره گرم مثبت شوند. همچنین نشان داده شد که یک ریبونوکلئوپروتئین طی یک خود کافت نسبتا کوتاه دوکسانان ولچی آزاد شد.

آنزیم هایی از پانکراس و گلبولهای سفید خون بدست آمده اند که سلولهای کشته شده گرم مثبت را به حالت گرم منفی تبدیل می کنند . این آنزیمها معمولا خاصیت هیدرولیز کردن اسید ریبونوکلئیک را دارند. بعلاوه یکی از آنزیم های خود کافت میکروارگانیزم های گرم مثبت که سلول را به اشکال گرم منفی تبدیل می کند نیز این خاصیت را دارد . نتایج اسپانیر و دریباس که در آنها ادعا می شد لیزوزیم سفیده تخم مرغ در مقابل اسید نوکلئیک حاوی یک عملکرد نوکلئوتیدی بود

و خواص ترکیزه کافتی آنزیم را تحت تاثیر قرار میداد ، اهمیت بیشتری بدست می آورند. این نتایج ظاهرا دیگر ارزیابی و بررسی نشده اند ، متاسفانه با ترکیبات آنزیمی ناخالصی بدست آمده بودند که با آزادسازی فسفات غیر آلی هیدرولیز می کردند. در پرتو اطلاعات اخیرتر در مورد ساختار مجموعه گرم مثبت و ماهیت آنزیمهای قادر به تحت تاثیر قرار دادن تبدیل سلولهای گرم مثبت به اشکال گرم منفی ، بررسی واکنشهایی که زمانی اتفاق می افتند که این تغییر بواسطه تاثیر لیزوزیم روی سلولهای کشته بوجود می آید مورد توجه بود .

تهیه آزمایشی لیزوزیم
لیزوزیم طبق روش آلدرتون و دیگران ( ۱۹۴۵ ) از سفیده تخم مرغ جدا می شد. به خاطر کمبود مواد آغاز کننده ، برای شکل دادن آنزیم هیچ تلاشی صورت نگرفت . فعالیت ترکیبات ، همانطور که بواسطه روش گلدزورتی و فلوری نسبت به ریزترکیزه لیزودکتیکوس تعیین شد ، بین ۵۰۰۰ میلی گرم / واحد ۶۰۰۰ بود. محلول آنزیم مورد استفاده حاوی lmg لیزوزیم بود .

تاثیر لیزوزیم روی ارگانیزم های گرم مثبت از بین رفته با حرارت
ترکیب سلولهای از بین رفته با حرارت ، کشت های دوکسانان ولچی بطور ناهوازی در ۲% ماده آبکی پیتن ، گلوکز در ۳۷ درجه رشد می یافتند . سلولها در سانتریفوژ شارپلز بعد از ۱۸ ساعت کشت ، برداشت می شدند. استرپتوکوک فیکالیس و گونه های استافیلوکوک و ریزترکیزه روی ۲% آگار پیتون در بطرهای روکس ۳۷ درجه رشد می یافتند و بعد از ۲۴ ساعت در آب مقطر برداشت می شدند. گونه های استرپتوکوک اروز مورد استفاده . اخیرا از نمونه های بیماری زا انسانی جدا شدند ، ریزترکیزه ها ارگانیزم های پوده زی جدا شده از پوست و هوا بودند.

ارگانیزم های تفکیک شده با آب مقطر شسته می شدند ، در آب مقطر معلق می شدند و در ۸۰ درجه بواسطه حرارت از بین می رفتند . سلولهای از بین رفته ، مخصوصا سلولهای دوکسانان ولچی تهیه شده بواسطه صرفا فرو بردی یک تعلیق باکتری گرم مثبت در حمام آب در ۸۰ درجه برای ۳۰ دقیقه مناسب نبودند. چون نمونه های آزمایشی رنگی وجود درصد متغیری از اشکال گرم منفی را آشکار می کردند.

روشی که در نهایت اتخاذ شد روش استریل کردن ناگهانی دوبوس و مک لود بود که در آن مقدار کمی از مواد معلق باکتری به حجم زیادی آب مقطردر ۸۰ درجه اضافه می شد. بعداز ۳۰ دقیقه در این دما ، مواد معلق سرد می شود ، تفکیک می شودو سلولها در آب مقطر معلق می شوند. این حقیقت که سلولهای گرم مثبت در تعلیق آبی هنگام حرارت داده شدن در ۸۰ درجه به حالت گرم منفی تبدیل می شوند حاکی از این است که ترکیبات مجموعه گرم مثبت می تواند بطور ضعیف پیوسته باشند. معمولا ، مقدار لیزوزیم مورد نیاز برای تبدیل سلولهای گرم مثبت کشته شده با حرارت به حالت گرم منفی بطور قابل توجهی بیشتر از مقدار مورد نیاز برای کافتن مواد معلق زنده ریزترگیزه لیزوریکتیکوس بود. روش نهایتا اتخاذ شده به شرح زیر بود.

موارد معلق سلولهای از بین رفته به محلول لیزوزیم m2/0 تثبیت گر فسفات ۰PHV/ و آب نمک فیزیولوژیکی اضافه شد بطوریکه کدری نهایی به مقدار استاندارد سولفات باریم مک فارلاند ۱۰/۰ نزدیک بود. حجم مشابه مواد معلق سلولی به مجرای کنترل که حاویm 2/0تثبیت گر فسفات PHV/. و آب نمک فیزیولوژیکی بود اضافه شد. تولوش بعنوان محافظ استفاده می شد. چون آن روی فعالیت لیزوزیم تاثیری نداشت . مجراها در ۳۷درجه بهتر کشت می شدند. بعد از دوره های مناسب ، مواد معلق بواسطه این روش تفکیک می شدند و نمونه های آزمایشی رنگی تکرار می گردیدند ، در صد تقریبی سلولهای گرم منفی بطور بصری ارزیابی می شد.

نتایج ( جدول ۱ ) نشان می دهد که همه ارگانیزم های از بین رفته گرم مثبت ، به استثنای مخمر ، بطور کاملتر یا نه چندان کامل گرم منفی می شد. مواد معلق استرپتوکوک فاکالین و استافیلوکوک آروز نیزموجب کرکینه شدن می شدند. تاثیر مشابهی که جذب سطحی آنزیم بواسطه سلولهای باکتری با ساختار کلوئیدیشان نسبت داده شده ، با تعلیق ارگانیزم های زنده مشاهده شده است . اجسام باقیمانده سلولهای گرم منفی بعد از عملکرد لیزوزیم در همه موارد بواسطه تریپسین که روی ارگانیزم های گرم مثبت سالم بدون تاثیر بود ، حل می شدند.

پاتوژنی چون باکتری های پوده زی نسبت به کافتندگی بواسطه لیزوزیم مستعدتر از ارگانیزم های پاتوژنی تلقی می شوند، این مسئله مورد توظه است که سلولهای از بین رفته با حرارت گونه های پاتوژنی استافیلوکوک آروز مانند ریزترکیزه های پوده زی نسبت به عملکرد لیزوزیم مستعد بودند.

PH بهینه برای تاثیر لیزوزیم روی دوکسانان از بین رفته با حرارت ولچی و استافیلوکوک آلباس محلول لیزوزیم در آب فیزویولوژیکی با مقادیر گوناگون PH با محلولهای استات M 2/0 یا فسفات M 2/0 تثبیت می شد. تعلیق شسته و یکسان ارگانیزم های گرم مثبت از بین رفته با حرارت به هر یک از مجراهای زنجیره ها افزوده می شد. بعد از ۷۲-۴۸ ساعت کشت ، تعلیق ها تفکیک می شدندو نمونه های رنگی آماده شده تکرار می شدند نتایج (جدول ۲ ) نشان می دهند که با هر ارگانیزم تبدیل به حالت گرم منفی در PH بهینه بود. این مقدار دقیقا با مقدار (۶۰۲ PH ) تعیین شده با روش مول بعنوان بهینه برای کافتندگی تعلیق های ریزترکیزه لیروز ریکتیکوس بواسطه این آنزیم مطابقت می کند.

تاثیر لیزوزیم روی اسید ریبونوکلئیک
با در نظر گرفتن ادعاهای اسپالیزودریباس که لیزوزیم حاوی نوکلئوتیداز است و با در نظر گرفتن این حقیقت که آنزیم هایی که با اسیدریبوکلئیک هیدرولیز می کنند نیز سلول های مرده را از گرم مثبت به گرم منفی تبدیل می کنند ، ترکیبات لیزوزیم برای فعالیت ریبونوکئاز بررسی شد.
ترکیبات لیزوزیم برای فعالیت هیدرولیزی در مقابل ریبونوکلئات سدیم %۱/۰ در تثبیت گراستاتM 2/0,PH6 , با روش داویدسون و ویموت بررسی شدند . اسید ریبونوکلئیک ته نشین شده با واکنشگر اسیدتری کلرواستیک – استات اورانیل مک فادین بعد از کشت با آنزیم بعد از ۶ ساعت تفکیک شد ، با استات اورانیل %۱۲۵/۰ در اسیدتری کلرواستیک شسته شد و بواسطه روش رنگ سنجی الن برای فسفر کلی تجزیه و تحلیل شد .
جدول ۲ و جدول ۳ در جزوه انگلیسی ص ۲۶۴

رنگها بااستفاده از فیلترهای ۶۰۸ فورد II با نور سنج جذب سطحی اسپکر مقایسه شدند . نتایج ( جدول ۳ ) نشان میدهند که لیزوزیم فعالیت ریبونوکلئازی ندارد .
آزاد سازی شکر کاهنده طی تاثیر لیزوزیم روی سلولهای از بین رفته با حرارت
هرچند در این معین سازی ها تنها افزایش نسبتا کمی در شکر کاهنده بدست آمد ، روش اسکافر – هرتمن تجزیه و تحلیل مورد استفاده توام با شناساگر نشاسته ای گلوکولات اخیرا شرح داده شده . نتایج درست و تجدید پذیری می داد. اصلاح و تغییر سوموگی رضایتبخش نبود چون تغییرات در محلول مسی قلیایی استاندارد طی زمان رخ نداد.

آزمایش های کنترلی نشان دادند که هنگامی که محلول های لیزوزیم یا تعلیق های سلولهای از بین رفته تنها کشت می شدند هیچ آزاد سازی مواد کاهنده ای رخ نمی داد. با این وجود وقتی که تعلیق های سلول های از بین رفته با لیزوزیم کشت می شدند ، مقدار کمی گرم منفی شکر کاهنده ، همانطور که بواسطه آزمایشات زیر نشان داده میشود ، آزاد می شدند ( جدول ۴ ).

استافیلوکوک آلباس سلولهای حاصل از …. لوله روکس کشت بیست وچهار ساعته این ارگانیزم به آب مقطر منتقل می شدند وبواسطه روش ( استریل سازی ناگهانی ) از بین می رفتند . سلولهای شسته شده در آب مقطر به تثبیت گر استات M2/0و PH6 و لیزوزیم افروده می شدند و تعلیق حاصل در حضور تولوئن در ۳۷ درجه کشت می شد. در فواصل مناسب طی تغییر از گرم مثبت به گرم منفی ، نمونه های تعلیق برداشته می شدند و در سرعت بالا تفکیک می شدند تا

زمانیکه شناورها آشکار میشدند و از سلولها رها می شوند . پس شکر کاهنده ۵ml ( همچنین گلوکز ) ( جدول ۴ ) در هر محلول با روش اسکافر- هارتمن تعیین میشد. دوکسانان ولچی .سلولهای حاصل از ۶۰۰ml کشت آبی ۱۸ ساعته جمع می شدند ( سانتریفوژ ) ، با آب مقطر شسته می شدند و بواسطه روش استریل سازی ناگهانی از بین می رفتند. تعلیق سلولها در آب مقطر به لیزوزیم در تثبیت گر استات M2/0و PH6 اضافه شد و در حضور تولوئن در ۳۷ درجه کشت شد. تحلیل هایی برای شکر کاهنده طی تبدیل از گرم مثبت به گرم منفی ؛ همانطور که بالا شرح داده شد ، انجام شد ونتایج ثبت شده در جدول بدست آمد.
تاثیر لیزوزیم روی کربوهیدراتهای استافیلوکوک لیمویی ودوکسانان ولچی خاص

کربوهیدراتهای مورد استفاده ، ترکیبات ناخالص جداشده بواسطه روشهایی بودند که در مورد استافیلوکوک ، ترکیبات رنگی گرمی ارگانیزم را از بین نمی بردند و از مورد دوکسانان ولچی ساختار سلولی را از بین نمی بردند ، هر چند واکنش گرمی منفی می شد. بنابراین پلی ساکارید بعنوان ترکیبات سطحی سلولهای باکتری تلقی می شوند.

کربوهیدرات حاصل از استافیلوکوک سیتروز (B9) .از چندین روش مورد بررسی برای جداسازی پلی ساکارید ، یعنی استخراج با هیدروکسید سدیم N5./0 در ۶۰ درجه ، اسید هیدروکلریک N 6./0 در ۱۰۰ درجه برای ۳۰ دقیقه ، کولیک سدیم ۲/۰ در ۶۰ درجه و آب مقطر در ۱۰۰ برای ۵ ساعت ، دریافت شد که آخرین روش بهترین نتایج را می داد. این روش به شرح زیر بود :

رشد از بطرهای روکس یک کشت ۴۸ ساعته استافیلوکوک سیتروز در آب مقطر برداشته میشد. این تعلیق از طریق پشم شیشه تصفیه می شد و سپس تفکیک می گردید . سلولها دوبار با آب مقطر شسته می شدند ، در آب مقطر معلق می شدند و برای ۵ ساعت در ۱۰۰ درجه گرم می شدند ، سرد می شدند و تفکیک می شدند . اسید استیک به شناور افزوده می شدتا ۵/۳ PH حاصل شود ورسوب حاصل بعد از ۲ ساعت برداشته می شد. استات سدیم در صافی حل می شدو پلی ساکارید ناخالص با افزودن اتانول ته نشین شد.