روش نور مرئی و فلورسانس

جذب و بازتابش متعاقب نور توسط نمونه های ارگانیک و غیر ارگانیک اساسا ناشی از پدیده های فیزیکی همچون فلورسانس و فسفرسانس است. گسیل نور طی فرایند فلورسانس به جهت تاخیر نسبتا کوتاه مدت بین جذب و گسیل فوتون که معمولا کمتر از یک میکروثانیه است، تقریبا همزمان با جذب نور تحریک صورت می گیرد.

شرح

جذب و بازتابش متعاقب نور توسط نمونه های ارگانیک و غیر ارگانیک اساسا ناشی از پدیده های فیزیکی همچون فلورسانس و فسفرسانس است. گسیل نور طی فرایند فلورسانس به جهت تاخیر نسبتا کوتاه مدت بین جذب و گسیل فوتون که معمولا کمتر از یک میکروثانیه است، تقریبا همزمان با جذب نور تحریک صورت می گیرد.

دانشمند انگلیسی سر جورج جی. استاکس برای نخستین بار در سال ۱۸۵۲ با مشاهده گسیل نور قرمز از فلوریت بر اثر تحریک توسط نور ماوراء بنفش این واژه را تعریف کرد. استاکس چنین بیان کرد که گسیل فلورسانس همواره در طول موج بلندتری نسبت به نور برانگیختگی اتفاق می افتد. تحقیقات و بررسیهای اولیه در قرن نوزدهم نشان دادند که بسیاری از نمونه ها( شامل کانیها، کریستالها، رزینها، روغن، کلروفیل، ویتامینها و ترکیبات غیر آلی) زمانی نور فلورسانس از خود گسیل می کنند که در معرض تابش نور ماوراء بنفش قرار بگیرد. هرچند، از دهه ۱۹۳۰ به بعد بود که کاربرد فلوروکرومها در تحقییقات بیولوژیکی به منظور نشان دار کردن بافتها، باکتری و سایر پاتوژنها رواج یافت. برخی از انواع این نشانها بسیار خاص بوده و همزمان با پیشرفت میکروسکوپ فلورسانس گسترش یافتند.

تکنیک میکروسکوپ فلورسانس از مهمترین ابزارهای کاربردی در علوم بیولوژیکی و بیوپزشکی و نیز علوم مواد به شمار می آید چراکه این میکروسکوپها مزایایی را دارند که در سایر شیوه های کنتراست با استفاده از میکروسکوپهای سنتی نوری دیده نمی شود. کاربرد یک آرایه از فلورسانسها امکان شناسایی سلولها و بافتهای سلولی فوق العاده کوچک را با ویژگیهای بسیار خاص در میان ترکیبات غیر فلورسانسی میسر می سازد. در واقع، میکروسکوپ فلورسانس قابلیت آشکارسازی تک مولکولها را دارد.

البته با استفاده از برچسب فلورسانس چندگانه ، ردیابهای مختلف قادر اند به طور همزمان چندین مولکول هدف را شناسایی کنند. هرچندمیکروسکوپ فلورسانس نمی تواند تفکیک پذیری فضایی را در کمتر از حد پراش نمونه ها فراهم کند ، با این وجود آشکارسازی مولکولهای فلورسانس در پایینتر از چنین حدی به سهولت امکان پذیر است.

پدیده خود فلورسانس در بسیاری از نمونه های متنوع، زمانی که در معرض تابش قرار می گیرند ،دیده می شود. پدیده ای که به طور گسترده در زمینه های مختلفی همچون گیاه شناسی، سنگ شناسی و صنایع مربوط به نیمه رساناهابه کاربرده می شود. در مقابل، مطالعه بافتهای حیوانی و پاتوژنها غالبا با نور های فوق العاده کم و روشن و نیز خود فلورسانس نامعین بسیار دشوار است.هرچند در مطالعات اخیر از فلورو کرومها

( که به آن فلوروفور نیز گفته می شود) نیز استفاده می شود که توسط طول موجهای خاصی از نور تابشی تحریک شده و نور های با شدت معین ساتع می کنند. فلوروکرومها که به طیفهای مرئی و مادون مرئی متصل می شود ، غالبا بازده کوانتومی بالایی دارند( نسبت جذب فوتون به گسیل) . کاربرد میکروسکوپ فلورسانس همگام با پیشرفتهای بیولوژیکی ،به دلیل ایجاد فلوروفورهای ترکیبی جدید با شدتهای برانگیختگی و گسیل مشخص که به حالت طبیعی بوجود می آیند، رشد گسترده ای پیدا کرده است.

اصول برانگیختگی و گسیل
از عملکردهای اصلی یک میکروسکوپ فلورسانس، روشن سازی نمونه ها با باند طول موجی خاص و مطلوب ودر مرحله بعد جداسازی فلورسانس گسیلیده بسیار ضعیف از نور تحریک است. در یک میکروسکوپ با ساختار مناسب ، تنها نور گسیلی است که می بایست به چشم و یا آشکارساز برسد. در ضمن معمولا تاریکی پس زمینه حدود آشکار سازی را کنترل می کند، و نور تحریک عموما چند صد هزار تا یک میلیون بار از نور فلورسانس گسیلیده روشنتر است.

در شکل ۱ نمای نیم رخی از یک سیستم اپی فلورسانس مدرن در میکروسکوپ فلورسانس عبوری و انعکاسی نشان داده شده است. در یک انتهای سیستم روشنایی عمودی در قسمت مرکزی دستگاه ،منبع نوری و در انتهای دیگربرجک مکعبی فیلتر قرار گرفته است. این دستگاه از یک میکروسکوپ نوری انعکاسی پایه تشکیل شده که در ان طول موج نور بازتابی طولانی تر از نور تحریک است. ایجاد سیستمهای روشنایی فلورسانس درمیکروسکوپ فلورسانس نور بازتابی به نام Johan S. Ploemثبت شده است.

در سیستم روشنایی عمودی فلورسانس ، نور با طول موج خاص ( ویا باند طول موجی مشخص) غالبا در طیف ماوراء بنفش و یا ناحیه آبی یا سبز طیف مرئی ، با عبور نور چند طیفی از لامپ و یا سایر منابع از یک فیلتر تحریک با طول موج انتخابی ایجاد می گردد. طول موجهایی که از فیلتر تحریک عبور می کنند ، از سطح یک آینه دو رنگ نما (که دیکروییک نیز نامیده می شود) و یا شکافنده پرتو منعکس می شونند.

چنانچه نمونه ها فلوئورسان باشند و از خو نور ساتع کنند، این نور توسط عدسی جمع شده و با بازتابش از سطح آینه دو رنگ نما به سطح فیلتر مانع( گسیل) برخورد کرده و فیلتر می شود. این فیلتر در واقع مانع از عبور طول موجهای تحریک ناخواسته می گردد. لازم به ذکر است که فلورسانس تنها شیوه در میکروسکوپ نوری است که طی آن نمونه ها، پس از تحریک ، از خود نور ساتع می کنند. نور ساتع شده مجددا در تمامی جهات بدون توجه به جهت منبع نور تحریک تابیده می شود.

میکروسکوپ اپی-فلورسانس از جمله پر قدرتترین تکنیکهای میکرسکوپی نوین به شمار می آید. دراین میکروسکوپ سیستم روشنایی عمودی انعکاسی بین تیوبهای دید و محفظه رو دماغی (nosepiece)عدسی شیئی قرار گرفته است. نور تحریک ابتدا از عدسی شیئی میکروسکوپ گذشته ( که در اینجا به عنوان یک کندانسور(عدسی محدب) عمل می کند)

و به نمونه می تابد، در نهایت نور فلورسانس گسیل شده با استفاده از همان عدسی دریافت می شود. این نوع سیستم روشنایی دارای مزایای بسیاری است از جمله آنکه عدسی شیئی میکروسکوپ در ابتدا به عنوان یک کندانسور(عدسی محدب) و در مرحله بعد به عنوان یک جمع کننده نور ایجاد کننده تصویر عمل می کند. از سوی دیگر، به عنوان یک سیستم واحد، عدسی شیئی/کندانسور همواره انطباق کاملی دارند. قسمت اعظم نور تحریکی که به نمونه می رسد بدون رخداد هیچ گونه بر همکنشی از نمونه ها گذشته و از عدسی دور می شود ، و سپس ناحیه روشن شده توسط عدسی چشمی دیده می شود( دراغلب موارد) . در نهایت، این روش امکان ترکیب و یا تناوب سازی بین مشاهده نور فلورانس انعکاسی و نیزدریافت تصاویر دیجیتالی را میسر می سازد

.

همانطور که در شکل ۱ نشان داده شده است، سیستم روشنایی عمودی نور انعکاسی از یک محفظه لامپ arc-discharge در قسمت عقب ( که معمولا جیوه ای و یا زنونی است) تشکیل شده است. نور تحریک باگسیلش در راستای سیستم روشنایی عمود بر محور نوری میکروسکوپ از لنزهای جمع کننده و یک دریچه دیافراگم با قابلیت تنظیم و در نهایت یک دیافراگم زمینه (به شکل ۱ رجوع کنید) عبور می کند

. این نور سپس به فیلتر تحریک رسیده و در آنجا باند طول موجی مطلوب انتخاب و از عبور طول موجهای ناخواسته جلوگیری میشود. طول موجهای انتخاب شده ،پس از عبور از فیلتر تحریک، به آینه شکافنده اشعه دورنگ نما رسیده که به عنوان یک صافی تداخل ،طول موجهای کوتاه را بازتاب و طول موجهای بلند را عبور می دهد.

این آینه شکافنده اشعه دو رنگ نما نسبت به نور تحریک ورودی با زاویه ۴۵ درجه قرار گرفته و نور را بازاویه ۹۰ درجه مستقیما به سمت عدسی شیئی و درنهایت نمونه منعکس می سازد. گسیل نور فلورسانس که توسط نمونه در معرض نور قرار گرفته ایجاد می شود ،بوسیله عدسی شیئی جمع شده و در نهایت توسط عدسی چشمی تصویر ایجاد شده دیده می شود. از آنجا که نور گسیل شده در مقایسه با نور تحریک طول موج بلندتری دارد ،این نور قادر است تا از آینه دورنگ نما و تیوبهای مشاهده و یا آشکارساز الکترونیکی عبور نماید.

اکثر نور تحریک متفرق شده که به آینه دو رنگ نما می رسد، به عقب به سمت منبع نور بازتابیده می شود، هرچند که مقدار ناچیزی ازآن غالبا عبورو توسط پوشش داخلی آینه جذب می گردد. پیش از انکه نور فلورسانس عبوری به عدسی شیئی و یا آشکار ساز برسد، ابتدا می بایست از فیلتر مانع عبور نماید. این فیلتر از عبور نور تحریک باقی مانده جلوگیری کرده و نورهای گسیلی با طول موج بلندتر را عبور می دهد.

در اغلب سسیستمهای نور انعکاسی، همانطور که در شکل ۲ نشان داده شده است،فیلتر تحریک ،آینه دورنگ نما و نیز فیلتر مانع روی هم یک بلوک نوری را تشکیل می دهد( که غالبا مکعبی شکل است) میکروسکوپهای نوری نوین قادربه جا سازی ۴ تا ۶ مکعب فلورسانس (معمولا بر روی یک رولور گردان و از طریق یک مکانیسم لغزنده؛ شکل ۱) اند و این ویژگی امکان جایگذاری سریع فیلترهای تحریک و مانع و نیز آینه های دورنگ نما را فراهم می سازد.

طراحی سیستم روشنایی عمودی می بایست به گونه ای باشد که امکان تنظیم میکروسکوپ برای روشنایی کهلر را میسر ساخته ویک دریچه روشنایی رادر میدان دید ایجاد نماید. از سوی دیگر، لنزهای چگالنده اصلاح شده در سیستم نوری می بایست به گونه ای باشد که مشخص کند تصویر دریچه دیافراگم با روزنه عقب عدسی شیئی فوکوس توام است. در منابع نورمربوط به میکروسکوپهای نوین ، تصویر دریچه زمینه از پیش تنظیم شده با نمونه فوکوس شده ونیز سطح دیافراگم عدسی چشمی ثابت توام است.

محفظه لامپ منبع نور معمولا ازیک فیلتر مانع نور مادون قرمز تشکیل شده است. محفظه لامپ می بایست به گونه ای باشد که طول موجهای ماوراءبنفش را که بسیار مضر هستند از خود ساتع نکند و مجهز به سوییچی باشد که اگر محفظه طی عملیات به طوراشتباه باز شد ، لامپ به طور اتوماتیک خاموش شود. استحکام این محفظه ها می بایست در حدی باشد که مقاومت کافی را در برابر انفجارهای احتمالی ( لامپ arc-discharge) داشته باشد.

در محفظه های لامپ جدید ، سوکت لامپ مجهز به دکمه های قابل تنظیمی است که امکان تمرکز تصویر لامپ قوسی را در روزنه عقبی عدسی شیئی ( در سیستم روشنایی کوهلر، این صفحات توام هستند) فراهم می سازد. در نقاطی از مسیر نور، معمولا نزدیک به محفظه لامپ و در قسمت جلویی فیلتر تحریک ، برای ممانعت کامل از عبور نور تحریک زمانی که نمونه توسط آشکارساز دیده نمی شود و تصویری از ان نیز به دست نمی آید ،وجود یک شاتر می تواند مفید وکمک کننده باشد. علاوه براین برای انکه کاربر بتواند شدت نور تحریک را کاهش دهد ، می بایست تدارکاتی برای فیلترهای چگالی خنثی ( بر روی یک چرخ،رولور و یا لغزنده) در نظر گرفته شود.

جابجایی استوک
انرژی ارتعاشی زمانی تلف می شود که الکترنها از حالت برانگیخته به حالت عادی باز می گردد. در نتیجه اتلاف انرژی ، طیف گسیلی یک فلوروفور برانگیخته معمولا در مقایسه با طیف جذب یا تحریک به طول موجهای بلندتر تغییر می یابد (توجه داشته باشید که طول موج به طور معکوس به انرژی تابشی تغییر می یابد) که این پدیده قانون استوک یا جابجایی استوک نامیده می شود. با افزایش مقدار جابجایی استوک ، با استفاده از ترکیبات فیلتر فلورسانس ، جداسازی نور تحریک از نور گسیلی تسهیل می گردد.

پیک شدت نور گسیلی (یا جذب ) فلوروفور معمولا کمتر از طول موج و بزرگی پیک تحریک است و منحنی طیفی نور گسیلی غالبا تصویر اینه ای(یا نزدیک به آن) است ازمنحنی تحریک، با این تفاوت که طول موجهای آن بلندتراست. همانطور که در شکل ۳ برای Alexa Fluor 555 آمده است، این سیستم یک ردیاب مفید است که نور را در ناحیه زرد-سبز جذب نموده و نورهای گسیلی به رنگ زرد-نارنجی را ایجاد می کند. برای افزایش شدت نور فلورسانس به حداکثر میزان، یک فلوفور( که معمولا رنگ نامیده می شود)معمولا در طول موجهایی نزدیک به پیک منحنی تحریک برانگیخته و وسیعترین محدوده ممکن از طول موجهای گسیلی را که شامل پیک گسیل می گردد ،ایجاد می کند. انتخاب طول موجهای تحریک و گسیلی معمولا براساس فیلترهای تداخل صورت می گیرد(شکل ۲).گذشته ازاین، واکنش طیفی یک سیستم نوری میکروسکوپی معمولا به فاکتورهایی همچون بازدهی انتقالی شیشه ای( به دلیل وجود پوششهای ضد انعکاس) ، تعداد لنزها و اجزای آینه ای و نیز سرعت عکس العمل سیستم اشکارساز بستگی دارد.

جداسازی و آشکارسازی موثر طول موجهای تحریک و گسیلی در میکروسکوپهای فلورسانس با انتخاب مناسب فیلترهایی که برای عبور و یا ممانعت از عبورباندهای طول موجی خاص در طیف ماوراء بنفش،مرئی،و زیر قرمز نزدیک مورد استفاده قرار می گیرد، انجام می شود

. منابع نور عمودی فلورسانس با هدف کنترل نور تحریک با جوف گذاری فیلترهای با قابلیت تعویض آسان ( متعادل کننده های چگالی خنثی و نیز تحریک تداخل ) در مسیر نور به سمت نمونه و مجددا در مسیر بین نمونه و تیوبهای مشاهده و یا سیستمهای آشکارساز دوربینی طراحی شده است. شاید مهمترین فاکتور در نورهای گسیلی فلورسانس با شدت نسبتا پایین ان است که منبع نوری که برای تحریک مورد استفاده قرار می گیرد،از روشنایی کافی برخوردار باشد تا بدین ترتیب شدت نور گسیلی به حد ماکزیمم رسیده و فلوروکرومها از خواص جذبی و بازده ای کوانتومی گسیلی کافی برخوردار باشد.