كنترل برگردان استنباط كمبود رطوبت در نيكوتيانا تاباكوم

واحد علوم گياهي و گياه‌شناسي و مركز بيولوژي سلول‌هاي گياهي دانشگاه كاليفرنيا
ريورسايد ـ امريكا
چكيده
تاثير كمبود رطوبت طولاني مدت در برگردان (ترجمه) mRNA از نظر كميتي در برگ‌هاي راسي و پايه‌اي همه گياهان تنباكو (نيكوتيانا تاباكوم) مورد تجزيه و تحليل قرار گرفت. سطح پلي‌زوم (پلي‌ريبوزوم) (شش ريبوزوم با بيشتر در mRNA) به صورت مشخص تحت شرايط آبياري خوب در برگ‌هاي راسي بيشتر از برگ‌هاي پايه‌اي بود. كمبود رطوبت هم در برگ‌هاي جوان و هم برگ‌هاي پيرتر موجب يك كاهش فزاينده در سطوح پلي‌زوم‌ها همراه با افزايش در مونوزوم‌هاي A.S مي‌شود و اين مساله نشانه شروع كاهش يافته برگردان است.

عليرغم كاهش كلي در شكل‌گيري پلي‌زوم‌ در ۱۴۴ ساعت پس از كمبود آب، mRNA پروتئين انتقال اسيد ليپيد مشهور، مربوط به كمبود آب، با مقدار زيادي از پلي‌زوم‌ها و محتويات LTP افزايش يافته همراه مي‌شود. mRNAي اسموتين، نسخه ديگر استنباط كم رطوبتي نيز در خلال كم رطوبتي طولاني مدت با

پلي‌زوم‌هاي بزرگ همراه مي‌باشد. در مقابل، mRNAهايي كه به كدگذاري پروتئين‌هاي بدون استرس مي‌پردازند، پروتئين‌هايي مثل ريبولوز بيس فسفات كربوكسيل/زير واحدهاي كوچك (rbcS) را اكسيژنه كرده و فاكتور آغاز كننده اكاريوتيك (elF4A)‌۴A را كه از نظر فراواني كاهش داده و به سمت پلي‌زوم‌هاي كوچك و تركيبات غيرپلي‌زومي متمايل مي‌كند و مشخص مي‌شود كه شروع برگردان (ترجمه) ‌اين mRNAها بوسيله كمبود رطوبت مورد آسيب قرار مي‌گيرد. اين نتايج نشان مي‌دهد كه تنظيم برگردان يك وسيله پاسخ تنظيم رطوبت بوده و تناوب برگردان mRNAهاي مستقل در برگ‌هاي با سن مختلف، متمايز و مشخص مي‌باشد.

واژگان كليدي: پلي‌زوم‌ها، سنتز پروتئيني، ريبوزوم‌ها، تنباكو، برگردان و استرس كمبود رطوبت
مقدمه
پاسخ گياهان پيچيده به استرس كمبود رطوبت بستگي به شدت (كاهش در پتانسيل آب). دوره استرس، اندام تجزيه و تحليل شده و سن آن دارد. تغييرات در فشردگي ژن كه ممكن است همانند سطح بعد از نسخه‌برداري در سطح نسخه‌برداري تنظيم شده باشد، پاسخ برجسته و معلومي به استرس كمبود رطوبت گياه مي‌باشد. با اين وجود، مكانيزم‌هايي كه در تنظيم فرآيندهاي پس از نسخه‌برداري در پاسخ به استرس كمبود رطوبت دخيل هستند، هنوز مشخص و روشن نشده‌اند.

روابط خاص در الگوهاي سنتز پروتئيني برگ در پاسخ به استرس كمبود رطوبت در گياهان بالاتر رخ مي‌دهد. بسياري از مطالعات صورت گرفته، mRNAهاي خاصي را شناسايي و معرفي كرده‌اند كه پروتئين‌هايي را كه در اثر استرس كمبود رطوبت انباشته مي‌شوند، را كدگذاري مي‌كنند. انباشته شدن تعدادي از اين mRNAها و پروتئين‌هايي كه نياز به استنباط كمبود رطوبت دارند، موجب افزايش محتويات اسيد آبسيسيك (ABA) مي‌شود. فقط در مورد تعداد كمي از ژن‌ها شاهد نمايش مستقيم تنظيم نسخه‌برداري تحريك كمبود رطوبت هستيم.

به عنوان مثال، انباشته شده mRNAي le16،‌ باعث كدگذاري پروتئين انتقال ليپيد مشهور (LTP) در گوجه مي‌شود كه در سطخ نسخه‌برداري و در پاسخ به افزايش سطح ABA در گوجه‌فرنگي تحريك مي‌شود. در مقابل، در نسخه‌برداري هستك ريبولوز، بيس فسفات كربوكسيل/زيربخش‌هاي كوچك ژن‌هاي (rbcS) اكسيژنه مي‌شوند و انباشتگي به حالت پيوسته mRNAي (rbcS) در پاسخ به كمبود رطوبت، آسيب مي‌بيند. تعدادي از اجزاي DNAي عمل كننده سيس براي نسخه‌برداري ارتقاء يافته ژنها تحت شرايط كمبود رطوبت مشخص و تعيين شده‌اند. علاوه بر مدولاسيون نسخه‌برداري، مكانيزم‌هاي پس از نسخه‌برداري كه ثبات mRNA، برگردان mRNA و برگشت پروتئين را تعيين مي‌كنند نيز ممكن است به تنظيم انباشتگي پروتئين تحريك شده بوسيله كمبود آب كمك كند.

در برگ‌هاي جدا شده از گوجه‌فرنگي، محتويات mRNA(ي) دو ژن نيازمند به ABA و le25 و l-1 آن، بوسيله نسخه‌برداري همانند وقايع بعد از نسخه‌برداري تنظيم مي‌گردد. در برگ‌هاي تنباكو (نيكوتيانا تاباكوم) هم كمبود رطوبت و هم كاربرد ABA‌، باعث تحريك انباشتگي mRNA اسموتين (osm) مي‌شود، گرچه پروتئين osm در برگ‌ها نامشخص بودند. اينكه آيا اين تنظيم در سطح برگردان يا پس از برگردان روي داده است، هنوز مشخص نشده است. نهايتاًٌ اينكه مدارك تنظيم برگردان mRNA در طول خشك‌شدگي و آب‌پوشيس مجدد در خزه مقاوم در برابر خشكيدگي «تورتولا ودوراليس» مشاهده شد.

گزارش‌هاي قبلي نشان داده بودند كه كمبود رطوبت موجب كاهش مشخص در سنتز پروتئيني در نهان‌دانگان مي‌شود. همانطور كه به صورت كاهش موثر در سطوح پلي‌زوم به صورت با مدرك مشخص مي‌باشد. چندين استرس غير زنده شامل محروميت از اكسيژن و گرما، موجب كاهش در سطح سنتز پروتئيئني شده و در برگردان انتخابي يك زيرمجموعه از mRNAها تاثير بگذارد. چون سنتز پروتئين‌هاي تحريك شده بوسيله استرس تحت شرايط كم رطوبتي صورت مي‌گيرد، آن هم علي‌رغم كاهش در سنتز پروتئين.

ما اينطور درنظر مي‌گيريم كه برگردان متفاوت mRNAها ممكن است يك تركيب يا جز از پاسخ استرس باشد. در اينجا ما نشان مي‌دهد كه استرس كمبود رطوبت گياهان تنباكوي رشد كرده گلخانه هم باعث تنظيم در سطوح پلي‌زوم‌ها مي‌شود. تجزيه و تحليل دو mRNAي تحريك شده بوسيله استرس و دو mRNAي تحريك شده توسط استرس مشخص كرد كه استرس كم‌رطوبتي موجب تغييراتي در همكاري mRNAهاي مستقل با پلي‌زوم‌ها مي‌شود. علاوه بر اين تاثير كمبود رطوبت بر وضعيت برگردان در برگ‌هاي با سن مختلف كاملاً آشكار بود.

مواد و روش‌ها
درمان كمبود رطوبت
بذرهاي تنباكو (نيكوتيانا تاباكوم و سيكونزين ۳۸) به مدت ۳ هفته در دماي ۲۴ درجه سانتيگراد با يك دوره نوري ۵/۱۳ ساعته در ۲۰۰μm.ls-1m-2 در يك محفظه رشد، شروع به جوانه‌زدن مي‌كند. نهال‌ها را به ظروف ۸ ليتري در گلخانه منتقل مي‌كنند و آنها را در دماي حدود ۲۶ درجه سانتيگراد نگهداري مي‌كنند (طول روز ۱۲ الي ۱۴ ساعت). زماني كه گياهان در هفته‌هاي ۱۲ تا ۱۳ داراي تعداد برگ ۸ الي ۱۰ عددي از برگ‌هاي كاملاً باز و غيرپير شدند، آبياري قطع مي‌شود.

برگ‌هاي بالايي (راسي) كاملاً باز شد و هفت يا هشت جفت برگ (پايه‌اي كه آنها را هم از بالا به پايين به حساب مي‌آوريم) را بعد از ۴۸٫۸۲٫۹۶٫۱۴۴ ساعت و بعد از ۹۰۰ ساعت پس از قطع آب مي‌چشيم. محتوي آب نسبي (RWC) را با استفاده از برش‌هاي دايره‌اي شكلي كه به قطر ۱ سانتيمتر از هر برگ بريده‌ايم، را تعيين مي‌كنيم. همانطور كه قبلاً توضيح داده داده‌ايم، RWC=[(FW-DW)/(TW-DW)*100]، در حالي كه FW عبارت است از وزن تازه، DW وزن خشك، TW وزن برش خورده برگ پس از ۲۴ ساعت شناور بودن در آب. محتويات ABA با استفاده از روش اندازه‌گيري ايمني راديويي ABA به صورت رقابتي تعيين مي‌شود. همانطور كه توسط آقايان «بري و بيچي» توضيح داده شد.

نمونه‌هاي بافت‌ها را در نيتروژن مايع، منجمد كرده و در دماي ۸۰- درجه سانتيگراد براي آناليز RNA، پروتئين و پلي‌زوم بعدي نگهداري مي‌كنند. آزمايشات را حداقل سه مرتبه مورد تكرار قرار مي‌دهند.

جداسازي RNA كل، پلي‌زوم‌ها و RNA پلي‌زومي
با استفاده از كيت كوچك گياهي RN آسان، RNA سلولي كل (۳۰μg) از برگ‌هاي ۱/۰گرمي راس يا ۴/۰ گرمي پايه‌اي جداسازي شد. مقدار RNA با اندازه‌گيري مقدار جذب در ۲۶۰nm تعيين گرديد. براي آناليزهاي پلي‌زوم، برگ‌ها را در يك پودر نرم قرار داد و آن را در نيتروژن مايع قرار دادند و يك ميلي‌ليتر از نمونه حجمي سلول بسته‌بندي شده در يك ميلي‌ليتر از بافر تقطير، هيدراته كردند (۲۰۰ ميلي‌مول تريس با pH=9، ۲۰۰ ميلي‌مول KCI)، ۳۶ ميلي‌مول MgCl2، ۲۵ ميلي‌مول اتيلن گليكول ـ بيس (بتا آمينو اتيل اتر)-N، N، N’ و N’ تترااستيك اسيد (EGTA) و ۱۰۰ ميكرومول و ۲ تا مركاپتو اتانول، ۵۰ ميكرومول mL-1 سيكلوهگزيميد، ۵۰ ميكروگرم mL-1 كلرآنفيكول، ۱% (v/v) تريتول ۱۰۰-x، ۱% (v/v) بريج ۳۵، ۱% (v/v) توين-۴۰، ۱% (v/v) 40-NP.

بعد از برطرف كردن ضايعات سلولي بوسيله سانتيريفيوژ كردن در g×۱۴۰۰۰ به مدت ۲ دقيقه در دماي ۴ درجه سانتيگراد، ۷۵۰ ميكروليتر از شناور به داخل ۵/۴ ميلي‌متر (۲۰ تا ۶۰% w/v) گراديان نيشكر بارگذاري شده و به مدت ۹۰ دقيقه در دماي ۴ درجه سانتيگراد در g×۲۷۵۰۰۰ سانتريفيوژ شد.

چگالي عدسي (OD) نمونه‌ها با يك نمايشگر ۵-UA و تقسيم كننده شيب ۱۸۵ مورد اندازه‌گيري قرار گرفت و ميزان جذب را از طريق نيشكر در nm254 با يك رقم داخلي ms124 را نشان داد. اطلاعات مقدار جذب به صورت الكترونيكي و با استفاده از يك كارت تحصيل اطلاعات سازگار ۸-DAS به دستگاه خروجي كامل كننده اطلاعات واحد نمايشگر ۵-UA متصل شده و ثبت مي‌گردد. جزئيات مربوط به نرم‌افزار و سخت‌افزار اين سيستم در صورت درخواست در دسترس مي‌باشد.

سطوح پلي‌زومي بوسيله محاسبه سطح پروفيل پلي‌زوم بعد از كم كردن خط مبناي شيب OD تعيين مي‌گردد (ميزان جذب يك شيب بار شده با بافر تقطير μl750)، سطح هر پروفيل پلي‌زوم، نسبت به يك مقدار مساوي كه براي اختلالات در نمونه مورد بارگذاري درنظر گرفته بود، به صورت نرمال درمي‌آيد. سطوح مونوزوم‌ها (s80ريبوزوم و يك ريبوزوم در هر نسخه) و پلي‌زوم‌هاي بزرگ (۶ ريبوزوم يا بيشتر در هر نسخه)‌ با محاسبه ارتباطي محدوده‌هاي پيك تعيين شدند. محدوده‌هاي مرتبط با تقسيمات مونوزومي و پلي‌زومي بزرگ به عنوان درصدي از محدوده كل تحت پروفيل گزارش مي‌شوند.

مرز پايين‌تري مربوط به s40 پيك زير واحد و مرز بالاتري قسمت تحتاني و كف شيب بود. براي اندازه‌گيري بارگذاري پلي‌زوم، mRNAهاي مستقل شيب‌هاي نيشكر به ۱۳ لوله (۴۰۰ ميكروليتري) با يك تقسيم كننده شيب تقسيم مي‌شود. با افزودن ۸۰ ميكروليتر از TES [250 ميلي‌مول Tris با pH=8، ۲۵۰ ميلي‌مول اسيد

اتيلن دي آمين تترا استيك (EDTA)، ۵% (v/v) سديم دو دسيل سولفات (SDS)]، RNA از هر تقسيم جدا مي‌شود. استخراج پروتئين با يك حجم مساوي از فنل: كلروفرم، الكل ايزواميل به نسبت‌هاي (۲۵:۲۴:۱) و جداسازي جسم از محلول ۳۲۰ ميكروليتري فاز آبكي با اضافه كردن از حجم ۳ مول استات سديم با pH=5/2 و ۲ حجم از اتانول ۹۹/۹۹% در دماي ۲- درجه سانتيگراد در طول شب صورت مي‌گيرد. RNAها را با اتانول ۷۰% شسته و در ۳۰ ميكروليتر از (نمونه‌هاي برگ راسي) يا ۱۰ ميكروليتر (از نمونه برگ‌هاي پايه‌اي) از ۱/۰% (v/v) دي اتيل پيروكربنات (DEPC)‌ فرآوري شده با آب، حل مي‌كنيم.