SHSP و مقاومت به تنش گرما در گياهان

خلاصه:
SHSP (Small heat shock protein) به طور گسترده اي در سلولهاي پروكاريوت و يوكاريوت در مواجهه با گرما توليد مي شود به خاطر تنوع و فراواني غيرعادي در گياهان پيشنهاد مي شود كه SHSP اهميت ويژه اي دارند(علاوه بر تنش گرمايي، SHSP در گياهان تحت ساير تنش ها و در مراحل نهايي نمو توليد مي شود بيان ژن SHSP و تجمع پروتئين به هنگام مواجهه با تنشهاي محيطي ما را متوجه اين فرضيه مي كند كه اين پروتئين ها يك نقش مهم در مقاومت به تنش بازي مي كند وظيفه SDSPها همانند يك كاپرون (Chapron) مولكولي به وسيله سنجشهاي invitro و onvivo تأئيد مي گردد.

مقدمه:
در مواجهه با تنش گرما هر دوي سلولهاي پروكاريوت و يوكاريوت يك گروه پروتئيني با وزن مولكولي ۱۵ تا ۴۲ كيلو دالتون (KDa) كه پروئينهاي Small heat shock (SHSP) ناميده مي شود توليد مي گردند. در گياهان به علت توليد زياد و فراواني غيرعادي SHSP ممكن است نيازشان را به سازش هر سريعتر به تغييرات محيطي مثل دما، نور، رطوبت منعكس سازند.

SHSPها بر اساس توالي DNA، تعيين موقعيت درون سلولي به ۶ Class مرتب مي شوند. SHSPها معمولاً در بافتهاي رويشي تحت شرايط نرمال كشف نشده اند اما مي توان به وسيلة تنشهاي محيطي و محرك رشد و نمو به وجود آيند. رابطة بين سنتز SHSPها و پاسخ به تنش منتهي به اين فرضيه شد كه SHSPها سلولها را از آسيب اثرات استرس محافظت مي نمايند. مدارك قوي مبني بر اين است كه SHSPها همانند يك كاپرون مولكولي از اتصال ناقص سوبستراي پروتئين ها جلوگيري گردد و از آن طريق از تجمع برگشت ناپذير آنها جلوگيري مي كند بنابراين موجب اتصال درست سوبسترا مي گردد. اين Review داده هاي فيزيولوژيكي و مولكولي را در مورد SHSP گياهان را بررسي كرده است.

 

كلاسهاي SHSP و ساختمان آنها:
SHSP ها پروتئينهايي با وزن مولكولي ۱۵ تا ۴۲ كيلو دالتون اند كه روي الكتروفورز ژل پلي اكريلاميد (PAGE) مشخص مي گردند. اغلب اين پروتئينها، پروتئينهاي غالبي اند كه در مواجه با گرما توليد مي گردند. Scharf و همكاران SHSP را به طور كامل در Avabidapsis thaliana كه پيش مي رود تحقيقات به مرور زمان در اين گياه را تحقيق كرده و متوجه شدند ژنوم Avabidopsis محتوي ۱۹ Fream خواننده مي باشد كه پروتئينهاي وابسته به SHSPها را رمز مي كند.

به طور كلي SHSPها به وسيلة ژنهاي هسته به رمز درآمده و به ۶ كلاس تقسيم مي شوند كه ۳ كلاس اين SHSP ها شامل (CI، CII و CIII) كه در سيتوزدل يا در هسته مي باشند ۳ تاي ديگر در پلاستيدها، شبكه آندوپلاسمي و ميتوكندري مي باشند در ساير اندامكها نيز SHSPها به طور منحصر بفرد ظاهر مي شود. كلاسهاي I و II (CI و CII كه در ستوردل با هسته اند) به طور معمول به وسيلة چند ژن خويشاوند (multigene familie) به رمز درمي آيد. SHSPهاي موجود در يك كلاس داراي توالي از اسيدهاي آمينه مشترك مي باشند و برعكس SHSPهاي از كلاسهاي مختلف داراي توالي مشابه پائيني اند. SHSPهاي واقع در يك كلاس به طور بالايي در بين گونه هاي مختلف گياهي متفاوت اند با اين وجود همكه SHSPها مشتركاً از ۹۰ آمينواسيد ماكربوكسيل انتهايي كه دامنة آلفاكريستالين -crystallin donain (ACD)] [يا دامنة تنش گرمايي ناميده يم شود استفاده مي كنند كه شامل پروتئينهاي -crystallin عدسكهاي چشم جانداران مهره دار نيز مي بوشد. ACD، SHSPها را از ساير پروتئينهاي كوچكي مكه به وسيلة گرما به وجود مي آيد مشخص مي كند. ACD را مي توان به دو زيربخش I و II به وسيلة بخش آبدوست كه طولش متغير است تقسيم كرد اين دو بخش -sandwich و –-Sheet antiparallel ناميده مي شوند. دامنة آمينهاي انتهايي بين كلاسها واقعاً متفاوت اند كه از اين آمينهاي انتهايي براي تعيين محل SHSPها استفاده مي شود كه يك متيونين در آمينهاي انتهايي SHSP هايي كه محل ساخت آن در اندامك پلاستيد است وجود دارد. پيشنهاد شده كه اين دامنة غني از متيونين داراي شكل سه بعدي بوده كه باقيماندة آبدوست دارد ممكن است در اتصال سوبسترا دخالت داشته باشد. در SHSPهاي گياهان Phosphorylate آنها بررسي نشده بود تا اينكهخ اخيراً مشاهده شد كه دو شكل M-8/23 Zm Hsp (با نام قديمي ۲۲HSP) از ذرات مي توانند Phosphorylate شوند اين دو شكل M-8/23 Zm Hsp از اتصال متناوب با دو باقيماندة متفاوت در اسيدهاي آمينه بدست آمدند كه ۵۷ كيلو دالتون در وزن مولكولي فرق داشتند. شكلهاي Phosphorylate به ترتيب ۳۶% و ۳۵% اتصال نرمال را مشابه ۲۲HSP دارند.

توليد HSP گياهي:
تحت شرايط نرمال اغلب SHSPها را در بافتهاي رويشي نمي توان يافت اما به سرعت در واكنش به گرما توليد مي شوند افزايش دما تا حدود ۱۵-۱۰ بالاتر از دماي مناسب رشد كه معمولاً در دامنة غيركشنده است موجب واكنش به تنش گرمايي مي شود. ميزان تجمع SHSP وابسته به دما و طول مدت استرس است بعد از تنش گرمايي SHSP مقدارش ثابت مانده و يك نيمة عمر ۵۰-۳۰ ساعت دارد. پيشنهاد شده كه SHSP ها ممكن است براي بازيابي و بهبودي گياه مهم باشد فقط تنش گرمايي، بيان ژن SHSP را تحريك نمي كند گاهي اوقات تجمع SHSP در واكنش به تنش اسمزي است. در آفتابگردان ژنهاي (CI)6/17Ha HSP و CII9/17 Ha HSP به وسيلة تنش آب به وجود مي آينمد و مقادير mRNA به طور مثبت وابسته به درجة دهيدراسيون است. با افزايش دهيدراسيون مقدار mRNA براي سنتز SHSP افزايش مي يابد در آفتابگردان در تحت تنش به يكسان بودن HSDP در ساقه ها و ريشه هاي پي برده شد مانيتول و ABA مي توانند موجب تحريك بيان ژن CII9/17 Ha HSP در كشت invitro وانهالها شود.

SHSP سيتوزولي كه هومولوگ با CI6/17Ha HSP و CII9/17 Ha HSP مي باشند به طور تركيبي در تجديد حباب گياه Craterostigma plantagineum تجمع مي يابند اما نه در كالوس خشك به حالت مقاوم است (مگر اينكه با ABA با مشاء خارجي تيمار شود.

مقادير SHSP در گياهان C.plantagineum در واكنش به خشكي افزايش مي يابد. بنابراين پيشنهاد مي گردد SHSP در مقاومت به خشكي مهم اند و در اين زمينه مكانيسم وابسته به ABA واسطه مي شود. رمز كردن ژنها براي توليد SHSP ها كه در واكنش به تنش اسمزي تحريك مي شود انجام گيرد كه در اينجا SHSPهاي سيتوزولي CII-7/17At HSP و CII6/17At HSP در A.thaliana (كه A6/17 At HSP و II7/17 At HSP ناميده مي شوند) و نيز

CII17QS HSP كه در دالانهاي Cork-oak وجود دارند توليد مي گردند. در مقابل با CI-17QS HSP، پروتئينهاي SHSP سيتوزولي CII در A.thaliana در مقادير بالاي تنش اسمزي يافت نشد.

در زيرمجموعة SHSPها، SHSPهايي كه به وسيلة تنش Oxidative تحريك و توليد مي گردند كه شامل ۲ نوع سيتوزولي (Class I و Class II)، SHSP ميتوكندري و SHSP كلروپلاست مي باشند. برخي ژنهاي SHSP به وسيلة تنش سرما heatymetal ازن (۳O)، اشعة uv، اشعه تحريك مي شوند. مشاهدات نشان مي دهد كه SHSPها ممكن است با تنش هاي غير زنده (abiotic) همبستگي داشته باشد. در غياب تنش هاي محيطي سنتز SHSPها در گياهان محدود به مراحل نمو نظير embryogenesis،جوانه زني، نمو گروه و بلوغ ميوه مي گردد.

Embryogenesis شامل ۳ مرحله است. وقتي دانه ها در ميانه مرحلة بلوغ اند يك افزايش ABA مشاهده مي شود كه باعث به خواب رفتن (dormant) آنها مي گردد در اواخر مرحلة بلوغ پروتئينهاي زياد سنتز و ذخيره مي شوند و با بلوغ دانه به dehyation مقاوم CII7/17 At HSP شروع به افزايش كرده و در مرحلة آخر بلوغ فراوان اند. در نخود و آفتابگردان هر دوي SHSPهاي كلاسهاي I و II در طول ذخيره شدن سنتز يافته و در دانه هاي بالغ افزايش مي يابند. به دليل سنتز SHSPها در طول بلوغ بذر پيشنهاد مي شود كه SHSPها ممكن است براي حفاظت سلولي در مقابل خشكي مهم باشد اين فرضيه به وسيلة رابطة كاهش مقادير SHSP با فنوتيپهاي غيرمقاوم به خشكي تائيد مي گردد.

در بذرهاي موتانت abi 3-6 (غيرمقاوم به خشكي) ژن ماركر خاموش و تجمع CI4/17At HSP، CI6/17At HSP و CII7/17At HSP متوقف مي شود. ژنهاي SHSP تحت كنترل HSF (Heat Shock transcription Factor) مي باشند. در شرايط تنش وظايف HSF به طور بالايي حفظ شده. تحت شرايط نرمال HSF در وضعيت مخفي (Latent) مي باشد اما در هنگام تنش گرمايي HSF به وسيلة تريمريزاسيون (trimerization) فعال مي شود. عامل حساس به تنش گرمايي (HSE) [heat sheck – responsive element] شامل ۱۳ اتصال و تكرارهاي معكوس شدة يك توالي –BP5 مي باشد مثل nGAAn.

در گياهان مهمترين بخش HSE، توالي ۳-aGAAg-5 است در كوچكترين ۳ واحدي منجر به تشكيل ۳-nGAAn nTCn nGAAn5 شده كه براي محدود كردن يا اتصال HSF كافي است به وسيلة استفاده از سيستمهاي هومولوگ و هترولوگ هر دوي مكانيسم هاي وابسته به HSE و غيروابسته به HSE در طول نمود در توليد SHSP دخالت دارند. HSE مصنوعي (سنتز شده) مي تواند باعث تنظيم نموي شده و ويروس موزائيك گل كلم (CAMU) را در تنباكر، تحريك كند.

مطالعات Promoter ها نشان مي دهد كه يك منشاء نظير HSE براي فعاليت نسخه برداري در اواخر مرحلة embryogenesis لازم است تا بذر را به خشكي سازگار سازد اين فعاليت شايد به واسطة اتصال با HSP انجام گيرد زيرا جهش در HSE توانايي اتصال به HSF را كاهش داده و در نتيجه فعاليت Promoter در طول نمو كاهش يافته است به هر حال نزديك به مرحلة embryogenesis فعاليت مؤثري به جهت جهش در اتصال با HSF انجام نمي گيرد. پيشنهاد مي شود كه ساير پروتئينهاي فعال كنندة ناقل كه ويژه بذراند مسئول تنظيم اند.

CI6/17 Ha HSP تنها ژن SHSP است كه به تنش گرمايي واكنش نداده اما به تنظيم نموي (افزايشي) واكنش مي دهد. Promoter CI6/17Ha HSP محتوي يك HSE ناقص است كه در فعاليت نموي CI6/17 Ha HSP شركت دارد اما HSE به تنهايي براي تحريك كامل ۶/۱۷Ha HSP ناكافي است.

HSF و ساير فاكتور داراي فعاليت ترانسي مترادف امكان دارد در تنظيم كردن در طول خشك شدن بذر در طي اتصال و الحاق HSE و نيز اين عناصر CIS توأمان باشند يكي از فاكتورهاي فعال ساز ترانس چنين تعريف شده كه زمان خروج عامل نسخه برداري Abi 3 را تنظيم مي كند كه اين فاكتور در تنظيم ژنهاي خاص بذر دخالت دارد جهش در Abi 3 بيان و تجمع CI4/17At HSP و CI6/17At HSP و CII7/17 At HSP در بذور Arabidopsis متأثر مي سازد بيشتر شواهد مستقيم برروي تحقيقات فعاليت پروموتر ۶/۱۷Ha HSP از جنينهاي آفتابگرداني كه با Abi 3 در Arabidopsis و LPHSFA1 در گياه گوجه فرنگي هم بيان هستند بدست آمده است. آناليز ظهور موقتي نشان مي دهد كه ABI 3 و HSF در پروموتر ۶/۱۷Ha HSP جنينها به صورت مترادف عمل مي كنند. فعاليت وابسته به ABI 3 نياز به دامنة

عملي از ابتدا و از انتهاي HSE و HSF دارد محدوده هاي انتهايي آميني و كربوكسيلي به ترتيب ABI 3 و HSF در نحوه هم عملكردي با ABI 3 اهميت دارد كه به تنهايي خود به نظر نمي رسد عمل مهمي داشته باشد اما در طي همكاري با HSF در طي اتصال HSF به HSE افزايشي به چشم مي خورد. ABI 3 و HSF مي توانند با يكديگر برهمكنش داشته باشد و ABI 3 مي توانند در نقش يك همكار نسخه برداري به وسيلة الحاق غيرمستقيم به DNA نقش ايفا كند.

تنظيم، توليد SHSP گياهي به وسيلة اصلاح ژنتيك:
در مواجهه با تنش گرمايي گياه براي حفظ فعاليت سلولي در برابر دماي بالا برنامة جديد زودگذري در فعاليت سلولي خود به وجود مي آورد كه شامل توقف سنتز پروتئين هاي معمولي و آغاز سنتز HSP مي باشد به هنگام تنش گرمايي برخي SHSP مي توانند تا ۱% مجموع پروتئينهاي ريشه و برگ برسند. در غياب تنش توليد SHSP به طور كامل در برخي مراحل نموي توليد مي گردند پيشنهاد شده كه توليد و تجمع SHSPها با مقاومت به تنش بستگي دارد و پذيرفته شده كه تغيير مقادير HSP ممكن است بر مقاومت به تنش مؤثر باشد به هر حال گزارشهاي كاربردي كمي در مورد افزايش مقاومت به استرس از طريق اصلاح ژنتيك در توليد SHSP هاي گياهي بدست آمده است (جدول ۲)

ديده شده كه توليد HSPها از طريق HSF در گياهان تراريختة Arabidopsis طوري تنظيم شده كه به طور دائمي At HS F1 يا At HSF3 بيان شود. بيان دائمي ژن شيمري -glucuronidase (Gus) At HSF1 باعث شده كه تحت شرايط عادي هم واكنش به heat shock (تنش گرمايي) متوقف نشده و تجمع HSPها ادامه پيدا كرده بنابراين گياه تراريخته مقاومت به گرما انتقال داده يم شود زيرا SHSPها و HSPV به طور دائمي توليد مي شود. در سيستمهاي هترولوگوس مقاومت گرمايي باكتري در E-Coli افزايش يافته كه اينكار به وسيلة پيوند با پروتئين –CI Gus9/16 OS HSP (موجود در برنج نوتركيب) انجام مي گيرد ژن ۵/۱۷CS HSP موجود در

شاه بلوط مقاومت باكتريايي در E-Coil را تحت تنش سرما و گرما افزايش داده است. در هويج كه به طور ژنتيكي اصلاح شده و در آن ژن CI7/17DS HSP بيان شده باعث افزايش مقاومت به گرما شده به علاوه گياهاني كه تعريف شده در آن CI7/17DC HSP در anti Sense سازگاري كمتري با تنش گرمايي دارند. مقادير پروتئين
CI7/17DC HSP و هومولگوگ آن CI9/17DC HSP در گياهان وحشي و گياهان با توليد بالا گمتر بود اين داده آزمايشگاهي از اين موضوع حمايت مي كند كه CI7/17 DC HSP ممكن است نقش مهمي را در مقاومت گرمايي بازي مي كند. به هر حال افزايش مقاومت به گرما جلوتر از سنتز مقدار زيادي mRNA و پروتئين CI7/17 DC HSP نبود.

افزايش مقاومت به گرما به نظر مي رسد كه در نتيجة كاهش كلي HSP به ويژه SHSP در CI7/17 Anti Sence DV HSP در گياهان ترار ريخته باشد اين مشاهدات پيشنهاد مي كند كه مي كند كه SHSPها شايد وظايف ديگري غير از مقاومت به تنش داشته باشد در گياه تراريخته Arabidopsis كه ژن
CII7/17At HSP به طور دائمي فعال است و تجمع mRNA و پروتئين

CII7/17At HSP تحت شرايط رشد عادي هم انجام مي گيرد در اين گياهان اين پروتئين متفاوت به خشكي و شوري را افزايش داده ولي مقاومت به تنش گرايي افزايش نيافته است در بذرها كه به طور طبيعي اين ماده (۷/۱۷ At HSP) جمع مي شود مقاومت به از دست دهي آب (خشكي) بدست مي آيد. شايد وظايف
CII7/17At HSP مثل يك كاپرون مولكولي (پروتئيني كه باعث سنتز پروتئينهاي ديگر مي شود در زمان اتصال به ريبوزوم) به هنگام مراجعه با تنش اسمزي در گياهان با توليد بالا باشند و در طول بلوغ بذر باشند كه اين موضوع به وسيلة سنجش in Vitro تأئيد مي گردد در مقابل گزارش شده كه SHSPهاي ذخيره شده در بذر آفتابگردان براي تنباكو كافي نبوده تا مقاومت به تنش آب را داشته باشد تنشهاي اسمزي و گرمايي هميشه با تنشهاي اكسيداتيو همراه هستند. اثرات بد تنشهاي گوناگون محيطي در كمترين حالت با افزايش توليد انواع اكسيژن غيرفعال شده (ROS*) شامل –۲O، ۲O2H، OH* واسطه مي گردد

–۲O به ۲O تغيير نكرده و ۲O2H در حضور يك super oxide تغيير نمي كند. در حقيقت ۲O2H و –۲O مي توانند واكنش دهند تا يك راديكال هيدروكسيل (OOH) كه اغلب oxidant قوي است توليد كند كه اغلب به ماكرو مولكولها حمله كرده و به غشاء آسيب رسانده و به DNA نيز آسيب رسانده كه اين در سنتز پروتئين و پايداري پروتئين اثر گذاشته و منتهي به اختلال متابوليكي و مرگ سلول مي گردد. نقش SHSPها در مقاومت به تنش گرمايي اين است كه در واكنش به

۲O2H افزايش مي يابند (جدول ۱) كلروپلاست محلهاي مهمي براي توليد ROS تحت هر دو تنش اسمزي و گرما و شرايط غيرتنش هستند به طور قابل توجهي SHSPها كه در كلروپلاست هستند ممكن است در مقاومت به تنش اكسيداتيو دخالت داشته باشد. ساختار منحصر بفرد helix amphipatic غني از متيونين كه موجود در SHSPهاي كلروپلاست مي باشد و توانايي تغيير ساختاري اجازه مي دهد كه به هنگام مواجه با تيمار oxidant با تنش اكسيداتيو مقابله كند.
P-3/25 At HSP در Arabidopsis مقاومت به تركيب گرما و نور زياد را اهدا مي كند كه موجب تنش اكسيداتيو مي شود تنش اكسيداتيو باعث القاء SHSP در

ميتوكندري و سيتوزول مي گردد پيشنهاد مي شود كه SHSP ممكن است همچنين باعث مقاومت اكسيداتيو گردد. در گياهان انتقال الكترون ميتوكندري به وسيلة SHSP حفاظت مي شود (به هنگام تنش شوري) اين اثر مشابه با آنتي اكسيدانهاي آسكوربات، گلوتاتيونين، توكوفرول و به خوبي آنزيم كاتالاز و سوپراكسيد حفظ مي گردد.