چکیده

کارهای اولیه انجامشده بر روی مقاومت حاصل از پوشـش پروتئینـی علیـه ویـروسهـای گیـاهی در دهـه هشـتاد میلادی سبب شناسایی مکانیسم خاموشی RNA در گیاهان شده است. این مکانیسـم دفـاعی بـا حضـور آر. ان. ای دو رشتهای (dsRNA)در سلول گیاهی شروع میشود. پروتئینی به نام Dicer این مولکولهای دو رشتهای را بـرش داده و سبب ایجاد قطعات کوتاه دو رشتهای به نام (siRNA) Small interfering RNA و (miRNA) microRNA مـی-شود. این قطعـات کوتـاه بـا پـروتئین Argonaute سـبب تشـکیل سیسـتم RNA-induced silencing complex (RISC) شده و درنهایت RNA ویروسی هدف توسط این سیستم برش خورده و غیرفعال میشود. ویروسهای گیـاهی برای آلوده سازی میزبان خود، مکانیسمهای سرکوبکننده سیستم خاموشی RNA را در خود ایجاد کـردهانـد. بعضـی ویروسها با سیستم خاموشی ژن به رقابت میپردازند و برخی دیگر باعث غیرفعال شدن پروتئینهـای دخیـل در ایـن سیستم میشوند. روشهای مختلفی برای القای خاموشی RNA به کار گرفتـهشـده اسـت کـه کارآمـدترین آن ایجـاد ساختارهای سنجاق سری با استفاده از توالیهای تکرارشونده است. بیشتر کارهای انجامشده در رابطـه بـا مقـاومسـازی گیاهان در برابر ویروسها بوده است ولی برخی مطالعات انجامشده قابلیت کاربرد این روش را برای مقاومسـازی نسـبت به دیگر بیمارگرها و حتی آفات نیز نشان داده است.

کلمات کلیدی: خاموشی RNA، مقاومت گیاهان، مکانیسم خاموشی

مقدمه

پاتوژنهای گیاهی بیماریهای زیادی را در گیاهان ایجاد میکنند و باعـث خسـارت قابـلتوجـه ای در محصـولات کشاورزی میشوند. درگذشته، روشهای سنتی برای مبارزه با این بیمارگرها مانند حفاظت تقـاطعی مورداسـتفاده قـرار میگرفت. کارهای اولیه انجامشده بر روی مقاومت حاصـل از پـروتئین پوششـی((CP ویـروسهـا در سـال ۱۹۸۶ نـوع جدیدی از مقاومت منشأ گرفته از بیمارگرهای گیاهی را معرفی کرد و در ادامه آن روشهای مختلفـی بـرای مهندسـی گیاهان مقاوم بهسرعت توسعه یافت. این روشها بر اساس نوع مولکولهای دخیل در مکانیسم آنها به دو گروه تقسـیم میشوند: مقاومت حاصل از پروتئینها و مقاومت حاصـل از مولکـولهـای .RNA باوجودآنکـه مکانیسـم مقاومـتهـای حاصل از پروتئین هنوز بهخوبی مشخص نیست، نـوع دیگـر، مقاومـت حاصـل از RNA، بـهطـور وسـیعی موردبررسـی قرارگرفتهاند و در حال حاضر به یکی از قدرتمندترین ابزارها برای مهندسی گیاهان مقاوم تبدیلشدهاندDuan, et al.,] .[2012 خاموشی RNA، که با نام خاموشی ژن نیز شناخته میشوند، نوعی مکانیسمی دفـاعی مـیباشـد کـه قـادر بـه

شناسایی توالی خاصی بر روی RNA و تجزیهی آن است، این مکانیسم در تمام موجـودات یوکـاریوت ماننـد گیاهـان، حیوانات، قارچها و نماتدها یافت میشود. در یوکاریوتها خاموشی RNA نقش حساسی را در ثبـات ژنـوم و پاسـخ بـه تنشهای محیطی از طریق کنترل بیان ژن، ایفا میکند. خاموشی RNA بخـش عمـدهای از مطالعـات بیولوژیـک را از زمان کشف آن در سال ۱۹۹۰ تابهحال به خود اختصاص داده است. در گیاهان، خاموشی RNA را میتوان به دو بخش “خاموشی ژن پس از رونویسی”((PTGS و “خاموشی ژن در زمان رونویسـی”((TGS تقسـیم کـرد. سیسـتم PTGS، mRNA هایی با توالی خاص را هدف قرار داده و با تجزیهی آنها از ترجمه ژن جلوگیری میکند، درصورتیکـه TGS با متیله کردن ناحیه خاصی از توالی پروموتور از رونویسی ژن جلوگیری میکند. هر دو سیستم بهعنوان مکانیسم اصلی گیاهان در مقابله با ویروسها شناخته میشوند. این مکانیسمهای خاموشـی ژن بـهنوبـه خـود مـیتوانـد باعـث توسـعه روشهای امیدبخشی در کنترل ویروسهای گیاهی شوند، البته مطالعـات انجـامشـده نشـان داده اسـت کـه عـلاوه بـر ویروسها توانایی کنترل بیمارگرهای دیگری نظیر قارچها و نماتدها را نیز دارد.[Zhou, 2012]

مکانیسم خاموشی RNA

ویژگی بارز سیستم خاموشی RNA، وجود dsRNA یا RNA هایی با ساختار ثانویه است. این نوع از مولکولهـای RNA برای سلولهای یوکاریوتی بسیار غیرعادی هستند. چندین مسیر برای تشکیل چنین مولکولهـایی وجـود دارد. بهطور مثال در ویروسهای ssRNA ، فرم تکثیری((RF در سلول بهصورت دو رشتهای به وجود میآید. البتـه سـاختار تکرشتهای این ویروسها نیز باعث به وجود آمدن ساختارهای ثانویه دو رشتهای میشود. ژنوم ویـروسهـای dsRNA بهصورت طبیعی دو رشتهای است، ساختار ثانویه دو رشتهای ویروئیدها((RNA نیـز بـه عنـوانی هـدفی بـرای سیسـتم خاموشی ژن عمل میکند. ویروسهای DNA نیز تولید mRNA مینمایند کهاحتمالاً ایجاد ساختار ثانویه مینماینـد. (pri-miRNA) primary-miRNA که از رونویسی ژنوم خود گیاه حاصل میشود، بـا ایجـاد سـاختار سـاقه و حلقـه (stem & loops)و جفـت شـدن نـاقص بازهـا، dsRNA را فـراهم مـیکنـد.[Hull, 2013] بعـد از تشـکیل چنـین ساختارهای دو رشتهای،این مولکولها به قطعات کوچک دو رشتهای، ۲۱-۲۵جفت بازی، برش میخورند. برش توسـط پروتئینــی از جــنس انــدوریبونوکلئاز (RNase III)III بــه نــام DICER انجــام مــیشــود. ایــن آنــزیم در جــانوران، (DCR)Dicer و در گیاهان، (DCL)Dicer-like نام دارد. این قطعات کوچک RNA دو رشتهای بنا به مسیری که از آن شکلگرفتهاند RNA های کوچک مداخلهگر((siRNA یا میکرو (miRNA)RNA نامیده میشوند. dsRNA هایی که siRNA از آنها حاصل میشوند منشأ خارج سلولی دارند. بهبیاندیگر اگر dsRNA اولیه منشأ خارج سلولی داشته باشد dsRNA های حاصل از برش DCL، RNA کوچک مداخلهگر((siRNA و اگر منشأ درونسلولی داشته باشد بـه آن miRNA گفته میشود. انتهای ۳‘ این قطعات بهمنظور جلوگیری از تجزیه توسط آنزیم HEN1 متیله میشـود. در ادامهی مسیر دو رشته RNA در قطعات siRNA و miRNA از هم جدا میشوند تا “رشته راهنما” و “رشته کمکـی” شکل گیرد. وظیفه رشته راهنما هدایت سیستم به سمت RNA هدفی است که توالی مکمل آن را دارد، و رشته کمکی نیز بعد از جدا شدن از بین میرود. رشته راهنمـا بـه پـروتئین Argonaute متصـل مـیشـود و سـاختار “کمـپلکس خاموشــی القاشــده توســط “RNA یــا RISC را بــه وجــود مــیآورد. هســته سیســتم RISC را پروتئینــی از خــانواده (AGO) Argonaute شکل میدهد. وظیفهی پروتئین AGO بـرش mRNA هـدف اسـت. دو زیـر خـانواده از ایـن

پروتئینها به نامهای AGO و PIWI وجود دارد ، که در گیاهان فقط نوع AGO یافت میشود. تمامی این پروتئینهـا دارای سه دامنه عملگر به نامهای PAZ، MID و PIWI هستند. دامنه PAZ در انتهای آمینی دو نوکلئونیـد اضـافه در miRNA و siRNA را شناسایی کرده و به آن متصل میشود. MID و PIWI به انتهای RNA 5 تـک رشـته متصـل میشوند. دامنه PIWI نقش اندونوکلئازی دارد و باعث برش RNA هدف میشود. در آخر نیز این سیستم باهدف قـرار دادن RNA های ویروسی و تجزیه آن توسط AGO و یا با اتصال miRNA و siRNA به mRNA هـدف و درنتیجـه جلوگیری از ترجمه آن باعث خاموشی ژن بیگانه در سلول میشودFilipowicz, et al., 2005, Hull , 2009, Hull, ] .[2013, Hutvagner, et al., 2008, van Regenmortel, et al., 2009, Wang, et al., 2012