عنوان آزمايش :
۱- جمع آوري و نگهداري نمونه هاي خاك
۲ – تهيه لام هاي دفن شده در خاك
آشنايي با روش نمونه برداري، نگهداري و تهيه لام از خاك

ميكرو بيولوژي و شيمي خاك حايز اهميت مي باشند كه بر اساس اصول صحيح جمع آوري و نگهداري كرده و آزمايش مورد نظر را انجام مي دهيم نكته مهم اينكه خاك از جمله محيطهايي است كه حتي در يك محدوده معين ويژگيها و شرايط آن از نظر فيزيكي- بيولوژيك و شيميايي با همديگر فرق دارند.

مثلاً در يك محدوده خاص مثل بلندي تپه در مقايسه با ارتفاع كم ويژگيهاي متفاوت مي باشد و حتي در يك باغچه كه به آن كود داده مي شود جاهايي كه كود بيشتري دريافت كرده و يا كمتري دريافت كرده شرايط متفاوتي دارد، بنابراين تهيه اين نمونه ها يا به منظور انجام آزمايشهايي ميكرولوژي انجام مي شود و يا آزمايشهاي شيميايي كه اين دو تفاوتي كوچك از نظر جمع اوري و نگهداري دارند.

براي نمونه برداري و جمع آوري از دستگاههاي نمونه بردار خاصي آگلر استفاده مي شود كه غالباً نوعي لوله نمونه برداري است كه طول و قطر مشخص دارد و جنس آن عموماً فلزي مي باشد و ويژگي كه دارند روي سطح آنها مدرج شده است كه به منظور اندازه گيري از عمق مورد استفاده قرار مي گيرد كه به شكل عمودي بر روي نقطه اي كه براي برداشت نمونه مشخص شده است قرار گرفته است و با فشار دادن دست يا فشارمكانيكي در خالك فرورفته تا عمق مورد نظر ازخاك پر مي شوند و بعد محتويات آنها با يك ظرف ترجيحاً استريل يا يك كيسه پلاستيكي منتقل مي شوند.

مرحله دوم نگهداري نمونه ها مي باشد كه اگر مجبور به نگهداري شويم بايستي نمونه هاي جمع آوري شده در شرايطي كه از نظر دما و رطوبت تشابه زيادي با زمان برداشت نمونه دارند نگهداري شوند كه مثلاً در مورد نمونه هاي ميكروبي دماي مشابه دماي برداشت نمونه مناسب بوده كه فعاليت ميكرو لرگانسيم ها را كند مي كند در مورد آزمايشهاي شيميايي روشهايي مانند منجمد كردن و خشك كردن براي نگهداري مورد نظر مي باشد .

مرحله انجام آزمايش:
براي شروع كار ابتدا يك نقطه مناسب را براي برداشت نمونه در نظر مي گيريم و در مرحله اول بايد يك برچسب تهيه كرده و مشخصات دقيق محل برداشت نمونه را روي آن برچسب مي نويسيم يعني اينكه اگر براي برداشت مجدد نياز باشد بايستي بتوانيم نمونه برداري را عيناً تكرار كنيم كه بتدريج فناوريهاي جديد مثل GPS نيز مورد استفاده قرار مي گيرد در درجه دوم مشخصات ظاهري خاك را بايستي يادداشت كنيم كه شامل: نوع دانه بندي خاك- پستي و يا بلندي – خشكي و ديگر مشخصات و بعد از مدتي كه مراجعه كرديم متوجه تغييرات آن شويم معمولاً اين برچسبها حاوي تاريخ، شرايط اقليمي، نام نمونه بردار و هر اطلاعات ديگري كه لازم بوده و به تفسير نتايج آزمايش كمك كند مي باشد.

انجام آزمايش:
پس از تحويل گرفتن وسايل مورد نياز شامل يك كيسه نايلون تميز و دماسنج و تيغه محل نمونه برداري پشت آزمايشگاه كنار درخت بزرگ زبان گنجشك و قسمت شمال غربي آن تعيين گرديد و ضمن مراجعه در محل با استفاده از لوله مخصوص كه براي نمونه برداري پيش بيني شده بود با فشار مكانيكي در محل مورد نظر اقدام به نمونه برداري و تخليه آن داخلا يك پلاستيكي گرديد البته قبلاً با استفاده از دما سنج مخصوص و با فرو كردن آن در داخل و ايست چند دقيقه اي درجه حرارت خاك تعيين گرديد سپس درجه حرارت هوا نيز اندازه گيري و بود. پس از ثبت مشخصات شامل ۱- نام نمونه بردار: علي اكبر نوروزي ۲- ساعت ۱۵/۱۵ روز دوشنبه ۳/۱۲/۸۴ ۳- مكان: آموزشكده محيط زيست پشت آزمايشگاه ميكرولوژي جنب درخت بزرگ زبان گنجشك و قسمت شمالي آن ۴- درجه حرارت هوا ۵- درجه حرارت خاك ۶- شرايط اقليمي : هوا مرطوب و پس از حدود ده ساعت بارندگي متناوب

در مرحله بعد از تحويل گرفتن يك عدد بوكال ( وسيله قراردادن خاك و لام ها و تماس آنها با همديگر به منظور ايجاد تماس مناسب محيط كشت با خاك) و ۶ عدد لام يا اسلايد كه با استفاده از ميكروفيلم آنها را به هم چسباند هو نفوذ ناپذيري آن را تضمين مي كنيم كه يك طرف آنها را با سواپ كه قبلاً با استفاده از محيط كشت نوترينت براث (NB) آغشته مي كنيم ( در شرايط استريل)

پس از آماده كردن سه عدد اسلايد دو طرفه كه يك طرف آن آغشته به محيط كشت NB مي باشد آنها را با فاصله در داخل بوكال قرار مي دهيم و سپس با استفاده از قاشقك ميان آنها را با آرامي با خاك پر مي نماييم و درب بوكال را بسته و در دماي گرما گذاري مي كنيم كه اگر شرايط دماي اطاق اين باشد مطلوب است در غير اينصورت آن را داخل انكوباتور به مدت دو هفته قرار مي دهيم تا ميكروارگانيم ها روي آن رشد كند.

عنوان آزمايش:
الف) شمارش باكتريهاي هتروتروف هوازي خاك به روش Plate count
هدف: آشنايي با روش كلاسيك شمارش باكتريهاي زنده
تاريخ: ۱۰/۱۲/۸۴

انجام آزمايش:
باكتريها غالبترين جمعيت ميكروارگانيم هاي خاك را تشكيل مي دهند و در خاكهاي معمولي بين عدد در هر گرم خاك موجود مي باشند در خاكهاي فاضلاب و لجن فعال يا كشاورزي يا كود دهي بالا با ميكروبي بالايي دارند.
استفاده از رفتهاي متوالي و كشت در پليت به روش pour plate مي باشد خاك بدليل اينكه داراي باكتريهاي زيادي مي باشد قابل كشت بصورت مستقيم نمي باشد لذا ابتدا سوسپانيون را تهيه و با استفاده از مايع مناسب كه آسيبي به سلولها نرساند ماده جامد را وارد آن مي كنيم و با استفاده از روشهاي مكانيكي آن را به هم مي زنيم يا با استفاده از دستگاهي بنام shaker كه با دور مشخص ( مثلاً ۲۰۰۰RPM يادويست دور در دقيقه ) به مدت ده دقيقه كه سلولها به هم چسبيده جدا و معلق شوند البته اين روش علاوه بر خاك در مواد غذايي نيز مورد استفاده دارد . روش مناسب دقيق سازي تهيه وقتهاي متوالي است كه مايع مناسب براي آن سرم فيزيولوژيك يا آب مقطر مي باشد.

دقت (خاك) سرم فيزيولوژيك
كه به ازاي هر رقت يك پليت خالي استريل در نظر مي گيريم البته صحيح آن ۳ دست براي هر لوله مي باشد كه به شرح ذيل مي باشد كه اين عمل با استفاده از پييت مدرج استريل و يا رعايت شرايط سترون صورت مي گيرد
پس از تلقيح نمونه ههاي رقيق شده بر روي هر يك از پليت هاي استريل بر روي هر پليت محيط كشت كه قبلاً آماده كرده ايم ( N.A) ريخته و آن را با حركات ۸ مانند زيگزاگي به هم مي زنيم تا كاملاً مخلوط شوند پس آنها را با ثبت مسخصات گروه در دماي به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در داخل انكوباتور گرما گذاري مي كنيم.
ب) عنوان آزمايش: تعيين PH و در صد رطوبت خاك براي اندازه گيري PH ابتدا ۵ گرم از خاك را در داخل استوانه مدرج ( مزور) كه آب مقطر در داخل آن ريخته شده است و به داخل بشر مي ريزيم البته آب مقطر بايستي به آرامي روي خاك ريخته شود و با استفاده از ميله شيشه اي به هم مي زنيم و مي گذاريم تا كاملاً ته نشين شود و بعد با استفاده از PH متر آن را اندازه مي گيريم البته الكترود آن بيايستي به ته تشر بچسبد.

PH=7027
براي اندازه گيري رطوبت خاك ۱۰۰g خاك را داخل يك بشر مناسب كه قبلاً وزن شده است اندازه مي گيريم :
X= وزن خاك+ وزن بشر
پس نمونه را با بشر به مدت ۲۴ ساعت در دماي قرار مي دهيم و پس ازخارج كردن آن را وزن مي كنيم
درصد رطوبت خاك= ۱۰۰ رطوبت خاك = وزن بشر با خاك – X
عنوان آزمايش: ۱- مشاهده لام هاي دفن شده در خاك
۲- شمارش و تعيين تعداد باكتريهاي هتروتروف هوازي در خاك