مقدمه

امروزه آنزیمهای میکروبی در بسیاری از کاربردهای صنعتی مورد استفاده قرار میگیرند و تقاضا برای آنزیمهای پایدارتر و فعالتر به سرعت در حال افزایش است .(۱) آنزیمهای سلولازی عضوی از خانواده گلیکوزید هیدرولازها بوده و عمل هیدرولیز پیوندهای ۱-و۴ گلیکوزیدی را در سلولز که به عنوان فراوانترین و تجدید-پذیرترین پلیمر طبیعی شناخته میشود، به عهده دارند. آنزیمهای سلولازی توسط تمام گیاهان، بسیاری از قارچها، برخی از باکتریها و تعداد کمی از حیوانات تولید میشوند (۲) اما قارچهای رشتهای و به ویژه قارچ تریکودرما به علت ظرفیت زیاد تولید پروتئین خارج سلولی منابع ترجیحی برای تولید صنعتی سلولاز به شمار میروند .(۳) سلولازها گستره وسیعی از کاربرد در فناوری زیستی از جمله داروسازی، صنایع غذایی، صنایع پالپ و کاغذ، نساجی، شوینده، نانوایی و تغذیه دام و طیور دارند و از لحاظ تبدیل سلولز به فرآوردههای مفیدی همچون سوخت زیستی اتانول، پروتئینهای تک یاخته۱ و ترکیبات شیمیایی نظیر اسیدهای آلی، گلیسرول، پلیمرهای پلاستیکی و محصولات ارزشمند دیگر به خوبی شناخته شدهاند .(۴) آنزیمهای سلولازی به صورت کمپلکسی از سه گروه آنزیمی متشکل از اندو ۱ و ۴ گلوکاناز، اگزوگلوکاناز و بتا ۱ و ۴ گلوکوزیداز میباشند که به طور تعاونی با یکدیگر پیوندهای ۱- و ۴ گلیکوزیدی را در سلولز هیدرولیز می کنند .(۵) اندوگلوکانازها که به نام کربوکسی متیل سلولازها نیز معروفند، به طور تصادفی پیوندهای – گلیکوزیدی درون مولکولی را در زنجیره سلولزی میشکنند و منجر به کاهش سریع در درجه پلیمریزاسیون آن میشوند. اندازهگیری فعالیت

۱- Single cell proteins

۵۶۷

T. harzianum

اندوگلوکاناز با استفاده از سوبسترای کربوکسی متیل سلولز، سنجش CMCase نام میگیرد .(۶) از آنجا که به طور معمول مقدار آنزیم تولیدی سویههای وحشی کم است، برنامه بهبود سویهها با فرض افزایش عملکرد آنزیمها و کاهش هزینه تولید آنها انجام میگیرد .(۷) تاکنون روشهای متعددی همچون استفاده از موتاسیون-های شیمیایی، پرتو فرابنفش و نیز ترکیب عوامل جهشزا برای دستیابی به سویههای با توان بیشتولید آنزیم به کار رفته است .(۳) پرتو گاما نیز به عنوان ابزار القای تغییرات ژنتیکی به طور موفقی در بسیاری از مطالعات به کار گرفته شده است. استفاده از پرتوهای یونیزه کننده نظیر گاما در مقایسه با عوامل جهشزای شیمیایی مزایای بسیاری دارد. این پرتوها به سرعت در بافتها نفوذ نموده و بسته به نرخ دز به کار رفته، ترکیبات متعددی حاصل میکنند .(۸) بر اساس گزارشات، اثرات جهشزایی پرتو گاما از مواد شیمیایی نظیر اتیل متان سولفونات بیشتر است. پرتو گاما از امواج الکترومغناطیسی با طول موج بسیار کوتاه است که طول موج آن از ۱ تا ۰/۰۱ آنگستروم تغییر میکند ولی در مقابل فرکانس آن بسیار بالاست. جرم آن در مقیاس اتمی صفر، سرعت آن برابر سرعت نور و فاقد بار الکتریکی میباشد. انرژی اشعه گاما از ۱۰ کیلو الکترون ولت تا ۱۰ مگا الکترون ولت متغیر است. پرتوتابی با اشعه گاما سبب تغییر ساختمان شیمیایی مولکولهای ماده وراثتی (DNA) میشود که نتیجه آن جهش ژن یا شکستن کروموزوم و ترتیب مجدد بازهای آلی خواهد بود .(۹) پژوهش حاضر در جهت کاربرد صلح آمیز فناوری هستهای، با هدف ایجاد تنوع در ذخیره ژنتیکی قارچ تریکودرمای بومی و دستیابی به ژنوتیپهای جدید با توان فعالیت اندوگلوکانازی بیشتر با استفاده از القای موتاسیون با پرتو گاما در گونه قارچیT. harzianum انجام گرفته است.

روش کار

میکروارگانیسم سوسپانسیون نمونههای خاک جمعآوری شده از اطراف ریشه در مزارع کشت محصولات مختلف به محیط

کشتPDA1 انتقال داده شد. کلنیهای حاصل پس از تهیه تک اسپور (به منظور خالصسازی)، با استفاده از کلید شناسایی قارچهای ناقص و بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و اونتوژنز کنیدیومها شناسایی و جدایه-
های متعلق به گونه جهت اجرای تحقیق انتخاب گردید.

تعیین دز اپتیمم و پرتوتابی نمونهها ابتدا سوسپانسیون اسپوری از کشتهای هفت روزه قارچ تریکودرما، تهیه و غلظت آن با استفاده از لام

هموسایتومتر در(۱۰ ۷ (spore/ml تنظیم گردید. به منظور تعیین دز مناسب، عملیات پرتوتابی سوسپانسیون اسپور در نه دامنه دز ۴۰۰ -۳۵۰ -۳۰۰ -۲۵۰ -۲۰۰ -۱۵۰ -۵۰ -۰ و ۴۵۰ گری (هریک سه تکرار) در قالب طرحکاملاً تصادفی با استفاده از دستگاه گاماسل با چشمه کبالت ۶۰، اکتیویته ۲۵۰۰ کوری و نرخ دز ۰/۲۳

۱- Potato dextrose agar

۵۶۸

گری در ثانیه مستقر در مرکز تحقیقات کشاورزی، صنعتی و پزشکی هستهای کرج انجام شد. بعد از تعیین محدوده مناسب پرتوتابی، سوسپانسیون اسپوری با غلظت ۱۰ ۷ (spore/ml) از کشت های هفت روزه قارچ تریکودرما بر روی محیط کشت PDA تهیه شد و تحت پرتوتابی در دز اپتیمم قرار گرفت.

شرایط کشت و تولید آنزیم

پس از گذشت یک هفته از کشت جدایههای قارچ تریکودرما بر روی محیط (MYGA1) شامل عصاره مالت (۵ g l)، عصاره مخمر (۲/۵ g l)، گلوکز (۱۰ g l) و آگار (۱۵ g l)، با اضافه کردن محلول سیلین استریل g/l) (NaCl 9 اسپورها از سطح پلیت جمعآوری و تراکم اسپورها در (۱۰۷ spore/ml) تنظیم شد. یک میلیلیتر از سوسپانسیون اسپور تهیه شده به ۵۰ میلیلیتر محیط کشت مندلز با (۱۰) pH=4/8 که شامل ۱۰ g/l گلوکز به عنوان منبع کربنی بود، اضافه گردید. محیطهای کشت، سپس به مدت ۲۴ ساعت در شیکر انکوباتور (دمای & 28 و ۱۸۰ دور در دقیقه) قرار گرفت و پس از رشد کامل میسلیوم به مدت ۷ دقیقه، سانتریفیوژ ( (۴۵۰۰ rpm و مایع فوقانی آنها دور ریخته شد. بعد از شستشوی توده میسلیوم با محلول سیلین، تلقیح محیط کشت تخمیری تریکودرما۲ (محیط کشت تولید آنزیم) شامل عناصر معدنی مندلز (۱۰) و ۵ گرم در لیتر (PASC3) به عنوان القا کننده تولید آنزیم با میسلیوم انجام و محیطهای کشت در همان شرایط قبل گرمخانهگذاری گردید. پس از گذشت ۴۸ ساعت، محیطهای کشت به مدت ۷ دقیقه سانتریفیوژ (۴۵۰۰ rpm) شد و مایع فوقانی به منظور اندازهگیری غلظت پروتئین و فعالیت آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت.

اندازهگیری غلظت پروتئین خارج سلولی و سنجش آنزیمی