ازمایشگاه

آنس ( فليدوپلاتين ) : كه به دو نوع مي باشد نوك تيز و حلقه اي كه براي انواع كشت ها در محيط هاي مختلف به كار مي رود .
پيست اتوماتيك : پيستي بسيار حساس و دقيق مي باشد كه داراي تنظيمي در قسمت فوقاني خود مي باشد كه مي تواند از ۱ سي سي تا ۱۰۰۰ سي سي تنظيم شود . اين دستگاه داراي قسمت هاي پلاستيكي مي باشد كه براي برداشتن مواد از آنها استفاده مي شود و يكبار مصرف مي باشند . اين اجزاي پلاستيكي سر سمپلر مي باشند .
فور : دستگاهي براي استريل كردن
انكوباتور ( گرم خانه ) : كه بعد از كشت برخي محيط ها را براي اينكه در محيط مناسب خود قرار گيرند در آن قرار مي دهند . دماي آن قابل تنظيم بوده همچنين مي توان زمان را نيز براي آن تعريف نمود .
اتوكلاو : دستگاهي شبيه به يك زود پز بزرگ مي باشد كه براي استريل كردن از آن استفاده مي شود.

استريليزاسيون :
روندي است كه در طي آن همه اشكال ميكروبي را اعم از اشكال فعال و اسپورها را از بين مي بريم و آن ابزار و يا آن ماده مورد استفاده را عاري از هر گونه ميكروب مي كند .
استريليزاسيون به دو صورت خشك و رطوبي انجام مي شود .
Stril: ( Dry – wet – filter )
روش هاي كشت باكتري :
هدف از كشت باكتري :
۱- باكتري را بتوانيم جدا ايزوله كنيم ( خالص كنيم ) مثلا حيواني كه مبتلا است ( بيمار است ) مي توانيم عوامل بيماريزا را از او جدا كنيم و با شناسايي عوامل بيماريزا پي به ماهيت بيماري ببريم .
۲- از كشت باكتريايي كمك مي گيريم براي درمان بيماري ( تست آنتي بيوگرام ) كه در اين تست ها باكتري خالص شده را در اختيار داريم . مي توانيم داروهاي متعدد را روي آن آزمايش كنيم و به هر كدام از داروها جواب داد در مورد انسان و يا دام استفاده كنيم .

۳- تهيه واكسن ها : كشت هاي خالص را بدست مي آوريم بعد آنتي ژنهاي آن باكتري ها را جدا مي كنيم و از آنها واكسن تهيه مي كنيم .
محيط هاي كشت :
الف : محيط كشت مايع : (Broth) آبگوشت ، مثال انواع محلولهاي قندي مثل گلوكزبرات .
ب : محيط هاي جامد : Agar :
يك پلي ساكاريد است . پلي ساكاريد كمپلكسي است كه باكتري ها مي توانند آن را تجزيه كنند . ( سفت كننده است ) . ما به طور معمولي محيط هاي جامد را داخل پليت تهيه مي كنيم ( يك تعدادي داخل لوله ) محيط هاي مايع هميشه داخل لوله تهيه مي شوند .
ج : حالت نيمه جامد :
آگار را به ميزان كم دارد حالت ژل مانند . از اين محيط ها عمدتا جهت بررسي فاكتور حركت در باكتريها استفاده مي كنيم و در لوله هم تهيه مي شوند .
روش هاي كشت :
۱- روش شعاعي :

۲- روش كشت T:

۳- روش كشت ممتد :

۴-كشت يك چهارم (۴/۱)

روش هاي كشت در لوله :

نوترينت آگار زرد رنگ طلايي مي باشد .
چهار محيط را ما در اين آزمايش كشت داديم .
۱- در يك پليت كه زرد رنگ بود ( نوترينت آگار ) از محيط e3 كشت داديم .
۲- در مايع قندي كه قرمز روشن بود از محيط e1 كشت داديم .
۳- در SIM كه زرد روشن بود از محيط e3 كشت داديم .
۴- در TSI كه نارنجي رنگ بود از محيط e2 كشت داديم .

رنگ آميزي باكتريها :
Whole colony : اشكال كلوني :
Pnctiform: Circular:

☼☼☼☼☼☼ ЖЖЖЖ
Filamentus: ☼☼☼☼☼☼ Rhizoid: ǼĦĦΨΨ Ivregular :
☼☼☼☼☼☼

Flat: Elevation: (شكل جانبي , چقدر بالا رفته) Raised:

Convex: Pulvinate: Umbonate:

Smooth: صاف Roaph: خشن Drycorn powdery: حالت پودري
Sarface appearance: جنس
انواع رنگ آميزي :
۱- ساده
۲- تفريقي
در حالت تفريقي از دو رنگ مي توان استفاده نمود كه حالت كنتراست داشته باشند . اما در رنگ آميزي ساده از يك رنگ استفاده مي شود .
هدف ما از رنگ آميزي تشخيص گران مثبت يا گران منفي بودن باكتري است .
رنگ آميزي ساده را با متيلن بلو انجام داديم .

نتايج آزمايش كشت باكتري :
كشت در پليت به صورت كلوني تك ديده مي شود . در مايع كشت بسيار عالي و به رنگ نارنجي در آمده است . سطح مورب به صورت خوب كشت شده و رنگ آن زرد تيره ( رنگ روغن مايع ) شده است كه قبلا قرمز آجري بود . در SIM مسير فرو رفتن آنس به صورت ابر مانند مي باشد .
Plate : Raised & Circular & Smooth

تهيه اسمير ميكروبي و رنگ آميزي آن :
در واقع ما در اين تكنيك باكتريهايي را كه مي خواهيم در زير ميكروسكوپ با اهداف مختلفي بررسي كنيم ابتدا بايستي كه يك گسترش را از آنها تهيه كنيم به اين صورت كه بايد يك لايه نازكي از اين جمعيت باكتريايي تهيه كنيم بعدا اينها را تثبيت مي كنيم روي لام و پس از رنگ آميزي زير

ميكروسكوپ بررسي مي كنيم . براي شروع كار از يك لام تميز استفاده مي كنيم . ابتدا از آب مقطر يك مقدار بر مي داريم خيلي كم روي لام مي گذاريم بعد نوك آنس را آغشته مي كنيم و در داخل لام كاملا پخش مي كنيم بعد در فضاي آزمايشگاه بايد خشك شده و براي تثبيت از روي شعله رد مي كنيم . تا مدتي كه دست را نسوزاند . مايع را نيز بعد از استريل كردن آنس در محيط مايع فرو مي بريم و بعد يك يا دو بار در محيط فرو مي بريم و بعد روي لام جديد مي ريزيم .

رنگ آميزي گرم :
در روش رنگ آميزي گرم ما از سه رنگ استفاده مي كنيم كه ۲ تا از اين رنگها نقش مستقيم در اين رنگ آميزي دارند و براساس اينكه باكتري ها چه رنگي را به خودشان خواهند گرفت مي توان آنها را بعدا دسته بندي كنيم به گرم + و گرم _ اي روش براي اولين بار در سال ۱۸۸۴ توسط كريستين گرند ابدا‌ء شد و به مرور زمان يك سري تغييراتي در آن به وجود آمد ولي به طور كلي اساس كار تفاوت چنداني نمي كرد .
اساس كار:
ما ابتدا از يك رنگي استفاده مي كنيم بنام رنگ اوليه Primary stain كه با اين رنگ آميزي هر دو گروه رنگ خواهند گرفت .
از يك تركيب رنگ بر استفاده مي كنيم ( De colorization agent ) .
رنگي كه باعث ايجاد كنتراست مي شود . (Coanterstain)
كه در مرحله آخر اجرامي كه به وسيله عامل رنگ بر رنگشان را از دست داده اند به اين رنگ آغشته مي شوند . له كه آبي است .
رنگ بر اتيل الكل ۹۵% است .
رنگ آخر سافرانين يا فوشين است . (قرمز رنگ).
براي اينكه مراحل از يادمان نرود مي توانيم همواره دو كلمه كلاس و كلاف را به خاطر داشته باشيم .
اينكه چرا يكسري از باكتريها رنگ اوليه را به خود جذب مي كنند و آن را موقع استفاده از رنگ بر از دست نمي دهند و برعكس يك سري ديگر رنگشان را به راحتي از دست مي دهند بنا به يك سري اعتقادات بر مي گردد به تركيب شيميايي غشاء باكتريها . ولي شواهدي نيز وجود دارد كه تركيب

غشاء نمي تواند چندان در اين امر دخيل باشد . به طور مثال مخمرها كه جزء باكتريها اصلا حساب نمي شوند و ساختار ديواره سلولي آنها نيز كاملا متفاوت از باكتريهاست . ولي در رنگ آميزي گرم به صورت گرم + ديده مي شوند لذا عقيده بر اين است كه بيشتر منافذي كه در غشاء وجود دارند و قابليت نفوذپذيري اين منافذ و يكسري پديده هاي فيزيكي در اين نحوه رنگ آميزي دخيل هستند .
۱٫ در سطح خارجي باكتريهاي گرم + قشري از نمك منيزيم ريبونوكلئيك وجود دارد كه با رنگ كريستال ويوله و لوگول تركيب پايدار ايجاد ميكند و در اثر مواد بي رنگ كننده نيز اين رنگها از باكتري ها خارج نمي شوند و اين در حالي است كه باكتريهاي گرم منفي فاقد اين ويژگي هستند .

۲٫ PH ايزو الكتريكي براي باكتريهاي گرم + پايين تر از باكتريهاي گرم _ است روي اين اصل باكتريهاي گرم + در حدود ۱۰۰ برابر بيشتر از گرم منفي ها كريستال ويوله و يد را جذب مي كنند و به راحتي هم اين رنگ را از دست مي دهند .
۳٫ گفته مي شود كه كريستال ويوله و يد در داخل باكتريها با هم تركيب شده و مولكول درشتي را به وجود مي آورند ه اين مولكول نمي تواند از جدار گرم + ها خارج شود در حالي كه در گرم _ به راحتي مي تواند رنگ از طريق ديواره خارج گردد .
۴٫ بخش اعظم Cell wall گرم _ ها از ليپوپروتئين است و تحت تاثير ماه رنگ بر الكل و استون چربي هاي آن حل شده و كمپلكس رنگي خارج مي شود .
تذكر مهم :
اگر مدت زمان استفاده از رنگ بر طولاني شود باكتريهاي گرم+ به صورت گرم _ ديده خواهند شد . وهمچنين اگر براي تهيه لام از باكتريهاي پير و مرده استفاده شود كه اينها قدرت نگهداري رنگ را ندارد بنابراين به رنگ گرم _ در مي آيند .

روش كار:
ابتدا يك اسمير ميكروبي تهيه مي كنيم ، آن را خشك و بعد Fix مي كنيم و بعد آماده مي شود براي رنگ كردن . سطح اسمير را با كريستال ويوله مي پوشانيم يك دقيقه صبر مي كنيم . با يك پيست حاوي آب مقطر اضافي رنگ را مي شوييم بعد روي آن لوگول مي ريزيم و يك دقيقه صبر مي كنيم . بعد از اين كار اضافي اين را با آب شستشو مي دهيم . بعد از اين مرحله از رنگ بر استفاده مي كنيم . بايد دقت شود استفاده از اتيل الكل بيش از حد طولاني نشود . نهايتا روي آن سافرانين يا فوشين مي ريزيم و ۴۵ ثانيه صبر مي كنيم و اضافي آنرا مي شو

گرم + به رنگ آبي تا بنفش ( كه مال كريستال ويوله است )
گرم _ به رنگ قرمز ( كه مال سافرانين يا فوشين مي باشد )
كلاس : ك, كريستال ويوله . ل , لوگول . ا, اتيل الكل . س , سافرانين .
كلاف : ‌ ك, كريستال ويوله . ل , لوگول . ا, اتيل الكل . ف , فوشين .
موارد مورد مشاهده شده :
سرئوس :
باسيل بوده و گرم + مي باشد .
اورئوس :
كوكسي بوده و گرم + مي باشد .
ليسترا مونو سايتراژنز:
به شكل باسيل هاي بسيار كوچك بوده و گرم + مي باشد .
ايكولاي :
به شكل باسيل كوتاه بوده و گرم _ است .
نكته : ما در رنگ آميزي مرحله آخر از فوشين استفاده كرديم .
پس : اورئوس فقط كوكسي اي كولاي فقط گرم _

رنگ آميزي اسپور :
يك سري از باكتريها مي توانند ايجاد آندسپور كنند كه اين آندسپور در مقابل شرايط محيطي مي تواند در مقابل خشكي مقاومت زيادي داشته باشد . از آنجايي كه ساختار پوششي اسپور به نحوي است كه رنگ در شرايط عادي نمي تواند وارد آن شود بنابراين از يك روش خاصي براي اين

رنگ آميزي استفاده مي كنيم . به دين صورت كه ما ابتدا از رنگ ( مالاشيت گرين ) سبز مالاشيت و جهت تسهيل ورود اين رنگ به داخل اسپور آن را حرارت مي دهيم . حرارت دادن نبايد به نحوي باشد كه موجب تبخير و يا جوشيدن رنگمان شود . براي حرارت دادن مي توانيم از هات پليت استفاده كنيم ولي بايد دقت كنيم كه حرارت تا حد جوش نرسد . ۲ الي ۳ دقيقه به آن حرارت مي دهيم , بعد خنك مي كنيم زير آب شستشو مي دهيم و سپس ب روي آن سافرانين اضافه مي كنيم به مدت حدودا ۳۰ تا ۴۰ بعد رنگ اضافه را شستشو مي دهيم و بعد خشك مي كنيم و با

ميكروسكوپ ۱۰۰ بررسي مي كنيم . در اين روش رنگ آميزي اسپورها به رنگ سبز و فرم هاي ديگر سلول باكتري به رنگ قرمز خواهند شد .
در همان روز محيط SS Agar تهيه كرديم به دين صورت كه در داخل۲۰۰ گرم آب مقطر ۱۲ گرم آگار اضافه كرده و به مدت ۱۵ دقيقه در اتوكلاو مي گذاريم .
رنگ آميزي كپسول : ( رنگ آميزي منفي )
براي رنگ آميزي كپسول از Nigrosin استفاده مي كنيم . طريقه درست كردن نيگروزين بدين صورت است كه ۵/۰ گرم از ماده خشك نيگروزين را در ۱۰۰ سي سي آب مقطر حل مي كنيم .
روش كار:
يك لام تميز انتخاب مي كنيم در قسمت انتهايي قطره كوچكي از نيگروزين را مي گذاريم با استفاده از لوپ ( آنس حلقه ) يك مقدار از كلوني را برداشته و در داخل رنگ حل مي كنيم . با لام ديگر پخش مي كنيم و بعد خشك مي شود .

محيط هاي كشت SIM و TSI را تهيه مي كنيم . ( SIM حالت ژلوز دارد TSI حالت جامد دارد .) به دين صورت كه براي SIM 6 گرم در ۲۰۰ سي سي آب مقطر كه قهوه اي رنگ مي شود . و براي TSI 65 گرم در يك ليتر حل مي كنيم كه قرمز رنگ است . سپس آنها را در داخل لوله آزمايش انتقال مي دهيم بعد روي آنها پنبه غير هيدروفيل مي گذاريم سپس لوله ها را در داخل يك بشر مي گذاريم ( يا ظرف ديگر ) اتوكلاو مي كنيم (۱۲۱ درجه ۱۵ بار ۱۵ دقيقه ) .
در مورد SIM به حالت قائم مي گذاريم تا سفت شود . ولي در مورد TSI جا لوله را كج ( مورب ) مي گذاريم .

Agr + آب مقطر Hot plate داخل لوله آزمايش پنبه غير هيدروفيل

بشر اتوكلاو .

از لحاظ تركيب محيط كشت را ۴ قسمت مي كنيم .
۱٫ غني كننده .
۲٫ مغذي ( عمومي ) .
۳٫ انتخابي .
۴٫ افتراقي .
غني كننده عمدتا مواقعي استفاده مي شود كه ما بخواهيم باكتريهايي راكشت بدهيم كه يا تعدادشان كم است و يا اينكه در رقابت با ساير باكتريها رشدشان بسيار كم يا اينكه مهار مي شود .
محيط كشت مغذي ( عمومي ) تركيبشان به صورتي است كه همه باكتريها و يا به عبارتي اكثريت باكتريها مي توانند در آنها رشد بكنند و خود محيط ماهيتا نمي تواند حالت انتخابي براي يكسري از باكتريها باشد . مگر اينكه فاكتورهاي ديگري را مثل دما مدت انكوباسيون و هوازي يا بي هوازي بودن به آنها اعمال شود .

محيط هاي كشت انتخابي داراي تركيباتي هستند كه براي يكسري از باكتريها تشويق كننده و براي برخي ديگر خاصيت مهار كنندگي دارد و اين مي تواند يك حالت انتخابي را به وجود بياورد .
محيط كشت افتراقي را بر اساس خصوصيات بيوشيميايي باكتريها تقسيم مي كنند به اين معني كه با توجه به تفاوت هايي كه در رابطه با اعمال بيوشيميايي باكتريها بر روي محيط كشت انجام مي دهند و متعاقبا متابوليتهايي را آزاد مي كنند بر اين اساس مي توانيم باكتريها را از هم ديگر تخريب كنيم عمدتا اين محيط ها جهت تفريق باكتريهاي هم خانواده استفاده مي شوند . محيط نوترينت آگار يا مغذي كه جزء دسته دوم حساب مي شود و همه باكتريها ( اكثريت ) مي توانند در آن رشد كنند . ( زرد روشن مي باشد ) .

محيط دوم بلاد آگار كه قرمز خون دار بوده و محيطي عمومي است و به آن مقداري خون و فيبرينه اضافه مي كنند ( خوني كه فيبرينش گرفته شده ) تا قابليت ليز شدن گلبولهاي قرمز توسط باكتريها بررسي شود اين محيط طوري است كه ح

ساس ترين باكتري ها هم در آن قابليت رشد پيدا مي كنند . ( رب مانند و همه مات هستند ) .
محيط Mac con key Agar : محيط انتخابي براي آنتروباكترياسه هستند چرا كه حاوي يكسري مواد مانند املاح صفراوي و كريستال ويوله بوده كه اين تركيبات به گرم مثبت ها اجازه رشد نمي دهند همچنين گرم منفي ها كه جزو آنتروباكترياسه نيستند در اين محيط نمي توانند رشد كنند اين محيط در درجه دوم يك محيط افتراقي هم به حساب مي آيد و مي توان توانايي باكتريها براي تخمير قند لاكتوز در آن را بررسي نمود زماني كه باكتريها بتوانند لاكتوز موجود در خون را تخمير كنند توليد يكسري متابوليتهاي اسيدي را مي كنند كه اين متابوليتهاي اسيدي در حضور معرف رنگي بنام قرمز خنثي به رنگ قرمز در مي آيند .

پس باكتريهايي كه لاكتوز مثبت هستند كلوني هايشان به رنگ قرمز ديده خواهد شد . ( شبيه مربا و قرمز روشن ) .
E.coli , kleb +
Sal , prot _
EMB ائوزين متيلن بلو آگار :
اين محيط داراي رنگ متيلن بلو است كه جزو رنگهاي آنيليني است و يك حالت انتخابي براي آنتروباكترياسه دارد و گرم + ها نمي توانند در آن رشد بكنند . همچنين داراي ويژگي خاص براي تشخيص اي كولاي است طوري كه كلوني هاي اي كولاي در EMB به رنگ سبز جلاي فلزي در مي آيد . قرمز تيره ولي شفاف است .
محيط SS Agar ( Sallmonella,shigella Agar ) :
اين يك محيط انتخابي براي سالمونلا و شيگلا است . اولا با داشتن املاح صفراوي و سديم تيوسولفيدها به گرم + ها و گرم _ هايي كه خارج آنتروباكترها هستند اجازه رشد نمي دهند .

همچنين داراي تركيباتي هستند كه براي سالمونلا و شيگلا مشوق رشد به حساب مي آيد مثل سيترات البته لازم به ذكر است كه به غير از سالمونلا و شيگلا ساير باكتريهاي خانواده آنتروباكترياسه مي توانند در اين محيط رشد بكنند همچنين در اين محيط تركيبات آهن دار هم وجود دارد كه از اين طريق مي توانيم توليد گاز SH2 را توسط باكتري بررسي كنيم در اين صورت كه تركيبات آهن دار با SH2 تركيب و توليد سولفيد آهن را مي كند كه رنگش سياه است و مي توان آن را در مركز كلوني ها مشاهده كنيم ( سالمونلا ) .

B.A Steph
‌N.A اورئوس
MCA اي كولاي
SSA كلپسيا
EMB سالمونلا
مرور نتايج جلسه قبل :
Steph را كمي قارچ زده بود و قرمز رنگ بود .
اورئوس داراي سطح صاف و موم رنگ بود .
سالمونلا صورتي روشن و داراي سطح صاف بود .
كلپسيا صورتي فسفري ( شب تاب ) و نقطه اي بود .
كشت در چهار محيط جديد :
• آگار اوره
• گلوكز برات ( محلول گلوكز )
• SIM
• TSI
TSI : Triple suger Iron agar
در تركيب آن سه قند استفاده شده است : گلوكز ، لاكتوز ، ساكاروز .

هدف اين است كه بتوانيم قابليت تخمير قند توسط باكتري در محيط هوازي و بي هوازي را بررسي كنيم ، چرا كه از آنجايي كه قبلا اشاره شد در صورت رشد باكتري و تخمير قند باعث مي شود كه رنگ محيط از حالت قرمز به حالت زرد در بيايد همچنين به علت دارا بودن آهن مي توانيم توليد SH2 را بررسي كنيم كه در بصورت توليد SH2 رنگ سياه ايجاد مي شود . در كنار اينها ميتوانيم فاكتور توليد گاز را هم توسط باكتري بررسي كنيم اگر گاز + باشد ايجاد يكسري حبابهايي را در داخل محيط كشت مي كند و گاهي وقتها توليد گاز به حدي است كه حتي محيط كشت را از جاي خود بلند مي كند در اين محيط از رنگ فنول رد استفاده مي

شود كه در PH حدود ۸ به رنگ قرمز و در PH هاي كمتر از ۶ به رنگ زرد ديده مي شود .
SIM : SH2 Indd Motility
در اين محيط سه فاكتور حركت ، توليد گاز SH2 و توليد متابوليت ايندول بررسي مي شود . به لحاظ اينكه يك محيط نيمه جامد است بنابراين به راحتي مي شود رد پاي باكتري را در آن رد يابي كرد . همچنين در صورت توليد گاز SH2 محيط به رنگ سياه در خواهد آمد . ايندول هم در بصورتي توليد مي شود كه باكتري داراي آنزيم تريپتوفاناز باشد و بتواند از اسيد آمينه تريپتوفان ايجاد ايندول را بكند كه باز با استفاده از يك آزمايش تكميلي مي توانيم وجود و توليد ايندول را توسط باكتري بررسي كنيم .
Glc Broth فنيل رد ( قرمز ) زرد رنگ
دو فاكتور بررسي مي شود :
۱٫ تخمير گلوگز
۲٫ توليد گاز
اوره آگار به صورت مورب ساخته مي شود براي بررسي قابليت تجزيه اوره توسط باكتري از اين محيط استفاده مي شود . باكتريهايي كه داراي آنزيم اوره آز هستند مي توانند اوره را تجزيه كنند . باكتريهايي مثل پروتئوس كه قدرت رشد و تكثير بالايي دارند مي توانند كه سريعا در اين محيط رشد كرده و اوره را تجزيه بكنند . در اين محيط از معرف فنول رد استفاده مي شود كه در PH هاي بالاتر از ۸ به رنگ صورتي پر رنگ در مي آيد . يعني اگر باكتري اوره آز + باشد باعث تغيير رنگ به حالت صورتي پر رنگ خواهد شد .
براي بررسي نتايج ۲۴ الي ۴۸ ساعت در دماي ۳۷ درجه سانتيگراد داخل انكوباتور كافي است .

در TSI و SIM مي توان اي كولاي ، كلبسيلا ، و سالمونلا را كشت نمود . در اوره آگار كلبسيلا و سالمونلا . در گلوكز برات استاف و اي كولاي .
مواردي كه ما كشت داديم با بررسي بعد كشت به صورت زير بود .

در محيط SIM در دو لوله مجزا اي كولاي و كلبسيلا بود كه هر دو به رنگ زرد در آمده بودند .
در محيط TSI در دو لوله مجزا اي كولاي و سالمونلا بود كه اي كولاي به رنگ زرد و سالمونلا به رنگ ارغواني در آمده بود .
در محيط اوره آگار كلبسيلا بود كه به رنگ زرد نارنجي در آمده بود . ( اگر اوره منفي باشد رنگ خودش مي شود اگر اوره مثبت باشد به رنگ قرمز در مي آيد . )
در محيط گلوكوز برات استاف بود كه به صورت كپسولي در داخل مايع زرد رنگي ديده مي شد . همچنين جمع شدن گاز در لوله نيز مشهود بود .
حالتهاي مختلف رشد باكتري :
Black—— sh2 yellow——- اسيدي Red———قليايي
توليد يا عدم توليد ايندول يك فاكتور تفريقي است . عده اي مي توانند ( با استفاده از آنزيم تريپ توفان ) عده اي نه .

Trp—-Indole, ammonia & Pyrovic Acid
Indole + kovacs reagent ——- Red color شناسايي ايندول
kovacs reagent = HCL & دي متيل آمينو بنز آلدهيد & آميل الكل
كواكسي زرد روشن است در صورتي كه در محيط ايندول باشد يك قسمت قرمز رنگ ديده مي شود . ( ايندول + ) .