الکتروفورز
به سبب اینکه ماکرومولکول های زیستی مانند دی‌ان‌ای و پروتئین ها باردار هستند می‌توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی بنام الکتروفورز استفاده می‌شود. روش های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول ها اعم از اسید های نوکلئیک یا پروتئین ها ابداع شده است.

الکتروفورز ژل
از یک محیط نیمه جامد (ژل) به عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی‌اکریل آمید ( PAGE) و الکتروفورز ژل آگارز تقسیم می‌شود. الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالائی بوده و برای تفکیک پروتئین ها و اسید های نوکلئیک به کار گرفته می‌شود. به منظور بررسی پروتئین ها با استفاده از PAGE، به سبب

اینکه پروتئین ها دارای بار مختلف هستند، معمولاً برای اینکه تفکیک فقط براساس وزن مولکولی انجام شود به بافر ماده شیمیائی SDS (سدیم دو دسیل سولفات ) اضافه می‌شود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی می‌باشد. این ماده باعث واسرشت شدن پروتئین ها شده و به آنها متصل می‌شود. به ازای هر دو اسید آمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می‌شود که باعث القاء بارمنفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می‌شود. هر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می‌نماید. برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده می‌شود. تهیه ژل

مزبور به مراتب سریعتر وآسانتر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می‌گیرد. معمولاً برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگ‌تر از ۵۰۰ جفت باز) در صورتیکه هدف صرفاً بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته‌ای و قطعات DNA تک رشته‌ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می‌شود. قدرت تفکیک ژل های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آنها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به اندازه ۱۰۰ جفت باز از آگاروز ۳% و برای قطعات حدود ۲۰۰۰ جفت باز از آگارز ۸/۰ % استفاده می‌شود. در صورتیکه نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته‌ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا

فرمامید در ژل هم‌زمان با الکتروفورز استفاده می‌شود. به این نوع ژل ها، ژل واسرشت کننده می‌گویند. چنین ژل هائی پیچ و تاب های اسید های نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول ها فقط براساس طول و نه ساختار دوم انجام می‌شود. در این ژل ها مولکول های کوچک‌تر در مقایسه با مولکول های بزرگ‌تر سریعتر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌کنند. از روش PAGE برای بررسی جهش‌ها و تعیین توالی دی‌ان‌ای استفاده می‌شود.

تاريخچه ي الکتروفورز دو بعدی
الكتروفورز روشي است كه در آن نمونه هايي که بار الکتريکي دارند، تحت تأثير يك ميدان الكتريكي از ميان شبکه اي متخلخل حركت مي کنند و از يکديگر جدا مي شوند. سير تکوين وتکامل اين روش در جداسازي پروتئينها ارتباط تنگاتنگي با تلاشهاي انجام شده در بررسي پروتئينهاي سرم دارد.
در سال۱۹۳۷، “Tiselius” روشي براي جداسازي الكتروفورتيك پروتئينهاي سرم ابداع کرد. انگيزه اصلي براي طراحي اين روش، كه بعدها به الکتروفورز منطقه اي ” Zone Electrophoresis” مشهور شد، مشكلاتي بود كه درحين بررسي پروتئينهاي سرم وجود داشت. “Tiselius” براي اولين بار فراكشن هاي آلفا ، بتا، و گاما را در سرم تشريح و نام گزاري كرد. وي به خاطر تحقيق بر روي الكتروفورز و آناليز جذبي، بخصوص اكتشافاتي كه ماهيت پيچيده ي پروتئينهاي سرم را مشخص مي كرد، جايزه ي نوبل شيمي را در سال ۱۹۴۸ از آن خود کرد.
نقطه ي عطف در توسعة الكتروفورز در دهه هاي ۴۰ و ۵۰ زماني روي

داد كه علاوه بر الكتروفورز منطقه اي دو روش ديگر نيز ظهور كردند: ايزوالكتروفوكوسينگ “, IEFIsoelectrofocusing” و ايزوتاكوفورزيز ” Isotachophoresis”. بنابراين در آن زمان امكان انجام آناليزهاي جداسازي الكتروفورتيك سه گانه بر روي مخلوطهاي پروتئيني يا بصورت جدا يا در تركيب با همديگر بوجود آمد.
اولين تجارب در جداسازي توسط الکتروفورز دوبعدي به کارهاي Smithies و Poulik در سال ۱۹۵۶ باز مي گردد که با بکار بردنِ ترکيبي از الکتروفورز بر روي کاغذ و بر روي ژل نشاسته پروتئين هاي سرم را جداو تفکيک کردند.

پيشرفتهاي بعدي در فناوري الکتروفورز، نظير استفاده از پلي آکريل آميد و استفاده از شيبهاي غلظتي پلي آکريل آميد، به سرعت در جداسازي هاي دو بعدي به کار گرفته شد. به خصوص استفاده از”IEF” در جداسازي دو بعدي اين امر را امکان پذير ساخت که جداسازي بُعد اول بر پايه خصوصيات بار الکتريکي پروتين ها صورت پذيرد. در سال ۱۹۷۰ الكتروفورز ژل پلي آكريل آميد به همراه سديم دو دسيل سولفات ” Sodium Dodecylsulfate-Polyacrylamide Gel

Electrophoresis, SDS-PAGE” توسط “Laemmli” معرفي شد. ترکيب “IEF” با “SDS-PAGE” در بُعد دوم منجر به ابداع روشي گشت که پروتئين ها را بر پايه دوعامل متفاوت يعني بار الکتريکي و جرم مولکولي از يکديگر جدا مي ساخت. اين روش برای انواع متفاوتي از نمونه ها با خواص حل پذيری متفاوت انطباق يافت؛ بدين معني که استفاده از اوره و دترجنت های غيريونی در “IEF”، امکان محلول سازي نمونه هاي متفاوت را فراهم نمود. بدين ترتيب تا سال ۱۹۷۵ يک سيستم

الکتروفورز دوبعدي تکامل يافت که مي توانست برای آناليز مخلوط های پروتئينی بدست آمده از کلِ يک سلول يا بافت ها بکار گرفته شود. براساس اين پيشرفتها “O’Farrell” درسال ۱۹۷۵ روش الکتروفورز دوبعدي را که برای جداسازی پروتئينهای “E.coli” بهينه شده بود، گزارش کرد. او در اين روش از ايزوالکتروفوکوسينگ در ژلهای پلی آکريل آميد استوانه ای که حاوی ۸% اوره و ۲% “NP40″ بود، در ترکيب با”SDS-PAGE” ناپيوسته ي”Laemmli” استفاده کرد.
ترکيب جداسازی بر پايه بارالکتريکی (نقطه ايزوالکتريک ياpI) وجداسازی براساس اندازه (جرم مولکولی نسبی يا Mr ) باعث مي شود که پروتئين های نمونه در پهنای ژلِ دوبعدی توزيع شوند. اين شگرد اساس پيشرفت و تکامل الکتروفورز دوبعدي را در ۳۰ سال بعدی تشکيل داد به طوری که تا کنون هزاران مقاله با استفاده از آن انتشار يافته است.
۳- روشهاي آماده سازي نمونه
قدم اول در آماده سازي نمونه, استخراج پروتئين ها از منبع مورد نظر است. ممکن است استخراج پروتئين ها مستقيما” توسط بافر محلول سازي “Solubilization buffer” صورت پذيرد. ممکن است اين عمل توسط روش هاي متلاشي ساختن سلولها “Cell disruption” و بافتها انجام شود و

 

سپس پروتئين هاي استخراج شده در بافر محلول سازي کاملا” حل شوند. براي استخراج كامل پروتئينهاي داخل سلولي، سلول بايد کاملا” متلاشي شود. انتخاب روش متلاشي سازي بستگي به اين دارد كه نمونه از چه منبع بيولوژيکي, از سلول, بافت جامد و يا از منابع ديگري, بدست آمده باشد. بعد از استخراج, اين نمونه ها بايد براي انجام الکتروفورز دوبعدي آماده شوند. منظور از آماده سازي نمونه, محلول ساختن حداکثر پروتئين هاي موجود و حفظ حلاليت آنها در حين روند الکتروفورز دو بعدي است.

هيچ روش منفردی را نمی توان بصورت عمومی برای آماده سازی نمونه هايی که توسط الکتروفورز دو بعدي مورد بررسی قرار مي گيرند, معرفي کرد. در واقع ماهيت متفاوت نمونه ها امکان بکار گيري روشي يکسان را در آماده ساختن آنها براي الکتروفورز دو بعدي منتفي مي سازد. از طرفي ديگر، روش بکار گرفته شده در هر تجربه اي به هدف طراحي شده نيز بستگي دارد. براي مثال, ممکن است هدف از انجام الکتروفورز دوبعدي دستيابي به پروتئينهايي با ويژگي هاي خاص باشد يا ممکن است دستيابي به نقشه کامل از پروتينهاي نمونه از اهميت بيشتري برخوردار باشد, در هر

يک از اين موارد استراتژي هاي انتخابي کاملا” متفاوت خواهند بود. در بهينه ساختن استراتژي آماده سازي نمونه بايد از نتايج موردنظر, انتظاري مشخص داشت؛ بايد براي ما مشخص باشد که نشان دادن نمونه بطور كامل مهمتر است يا بدست آوردن يك الگوي تكرارپذير.
اضافه تر کردن مراحل آماده سازي نمونه مي تواند كيفيت نتيجه نهايي را بهتر کند, اما اين امر به قيمت از دست دادن گروهي از پروتئينها تمام مي شود. به هرحال, اين تناقص و نسبت معکوس بين كيفيت نمونه بهبود يافته و نمونه سازي كامل پروتئينها بايد کاملا”درنظر گرفته شود.
در هر صورت, خطوط راهنماي کلي براي آماده سازي نمونه وجود دارد که با پي گيري آنها مي توان قدمهاي نخست را در اين راه به درستي برداشت و سپس با تجربه بهترين نتيجه را بدست آورد
۳-۱ رهنمودهاي کلي در آماده سازي نمونه براي الکتروفورز دو بعدي
روش بکار گرفته شده در آماده سازي نمونه بايد علاوه بر کارآمد بودن, قابليت تکرارپذيري نيز داشته باشد. اين امر رمز انجام موفقيت آميز الكتروفورز دوبعدي است. در روش بکار گرفته شده ممکن است از بافري ساده براي محلول سازي يا از مخلوطي پيچيده حاوي عوامل كائوتروپيک “Chaotropic reagents”، دترجنت ها “Detergents” و عوامل احياء كننده استفاده شود. در هر حال بهينه کردن روش آماده سازي نمونه بصورت تجربي صورت مي پذيرد و براي دستيابي به اين مهم می توان برخی رهنمودهاي کلي را در آماده سازي نمونه درنظرگرفت:
به حداقل رساندن مراحل آماده سازي نمونه. افزايش در مراحل آماده سازي نمونه ممكن است كيفيت نتيجه نهايي را بهبود بخشد, اما اين امر ممكن است با هزينه احتمالي از دست دادن پروتئينها همراه باشد .

به حداقل رساندن تغييرات پروتئينی ناشي از عوامل داخلي و خارجي. چنين تغييراتي مي توانند سبب ظهور نقاطي مصنوعی در نمايه ي ژل الکتروفورز دو بعدي شوند. براي مثال نمونه هايی که حاوی اوره هستند نبايد حرارت داده شوند چون تخريب حرارتی اوره ايجاد ايزوسيانات مي نمايد. ايزوسيانات حاصل می تواند با کارباميله کردن “Carbamilation” پروتئين ها سبب هتروژنی قابل ملاحظه ای در بار الکتريکی شود و ايجاد نقاط غير واقعي در نمايه الکتروفورز دو بعدي نمايد.
علاوه بر اين پروتئازهای موجود در نمونه ها با تخريب آنزيماتيک پروتئينها به سهولت ايجاد نقاط غير واقعی می نمايند. به همين دليل نمونه ها بايد حدالامکان درکمترين حد ممکن دستکاری شوند و در تمام طول مدت کار خنک نگهداری شوند. معجون هاي وقفه دهنده ي پروتئازی “Protease

inhibitors cocktails” را می توان به نمونه اضافه کرد، اما اين نکته را بايد درنظر گرفت که چنين موادی نيز ممکن است سبب هتروژنی در بار الکتريکی پروتئينها و در نتيجه ظهور نقاط غير واقعی شوند.

• محلول ساختن همه ي انواع پروتئينها, از جمله پروتئينهاي آبگريز به شكلي تكرارپذير. برخي پروتئينها بطور طبيعي به صورت كمپلكسهايي در غشاء هستند. يا برخي ها در كمپلكسهايي با اسيدنوكلئيك پيدا مي شوند. برخي ديگر ايجاد توده هاي “Aggregates” غيراختصاصي متفاوتي مي كنند. روش محلول سازي بايد طوري تمامي باندهاي غيركوالان در كمپلكسها و توده هاي پروتئيني را تخريب کند كه محلولي از پلي پپتيدهاي منفرد ايجاد شود.
در غير اين صورت, كمپلكسهاي پروتئيني نقاط جديدي را در نمايه دوبعدي ايجاد مي نمايند كه همزمان منجر به كاهش شدت نقاط مربوط به پلي پپتيدهاي منفرد تشکيل دهنده اشان مي شوند. كارآمد بودن بستگي به انتخاب روش محلول سازي دارد . انتخاب دترجنت ها و تركيب بافر محلول سازي بسيار پر اهميت است. اگر هريك از اين مراحل بهينه نشوند، ممكن است جداسازي ناقص انجام شده و بهرحال اطلاعات پر اهميتي از دست داده شوند.

• ممانعت از توده شدن پروتئينها در حين محلول سازي و در طي مراحل بعدي الکتروفورز و جلوگيري از رسوب کردن پروتئين ها و ازبين رفتن حلاليت آنها در حين ايزوالكتروفوكوسينگ.

• خارج ساختن اسيدهاي نوكلئيك و ديگر مولكولهاي تداخل كننده نظير ليپيدها, پلي ساکاريدها, و نمکها که در ايزوالكتروفوكوسينگ اختلال ايجاد مي نمايند.

• تمام موادي كه مي توانند ذراتي را تشكيل دهند بايد با اولتراسانتريفوژ خارج كرد. قطعات جامد و ليپيدها بايد از محلول خارج شوند چراكه مي توانند منافذ ژل را مسدود كنند .

• حذف پروتئينهايي با فراواني بالا که ديگر پروتئين هاي مورد نظر در نمونه را تحت پوشش خود قرار مي دهند. مثلا” حذف آلبومين يا ايمونوگلوبولين ها از پلاسما در بررسي ديگر پروتئينهاي موجود در پلاسما. اين کار موجب دستيابي به پروتئينهاي موردنظر درسطوح قابل اندازه گيري مي گردد.
۳-۲- انواع نمونه ها

روش هاي آماده سازي مطلوب براي تمونه هاي بدست آمده از منابع متفاوت اختلاف فاحشي با يکديگر دارند. اين امر به خاطر ماهيت و ساختار اين منابع است. در اين قسمت به انواع نمونه هاي مورد استفاده مي پردازيم.
۳-۲-۱- نمونه هاي محلول
نمونه هاي محلول و مايع نظير سرم, پلاسما, ادرار, مايع نخاعي و عصاره هاي مايع سلولها و بافت ها را مي توان اغلب با کمترين دستکاري توسط الکتروفورز دو بعدي بررسي کرد. نمونه هايي نظير پلاسما و سرم که داراي غلظت پروتئيني نسبتا” زيادي هستند را مي توان مستقيما” بعد از رقيق کردن با بافر محلول کننده ي مناسب توسط الکتروفورز دو بعدي آناليز کرد. با اين حال فراواني بالاي پروتئينهايي چون آلبومين و ايمونوگلوبين ها باعث مخدوش شدن بسياري از اجزاي اقليت در نمايه ي الکتروفورز دو بعدي مي گردد. با خارج کردن اين پروتئينها از محلول مي توان بر اين مشکل غلبه کرد، اما هميشه احتمال خارج کردن غير اختصاصي ديگر اجزاي پروتئيني نيز وجود دارد.
ممکن است نمونه هاي محلول داراي غلظت هاي نسبتا” کم پروتئيني بوده و يا حاوي غلظت هاي بالا از نمک هايي باشند که قادر به اختلال درجداسازي پروتئين ها درحين “IEF” باشند. چنين نمونه هايي را مي شود قبل از الکتروفورز دو بعدي با دياليز يا کروماتوگرافي, نمکزدايي کرد, سپس اين نمونه ها نياز به تغليظ شدن دارند که توسط روشهايي چون ليوفيليزاسيون، دياليز درمقابل پلي اتيلن گلايکول، يا رسوب دادن توسط اسيد تري کلرواستيک “Trichloroacetic acid, TCA” با استن انجام پذيرد.
رسوب دادن توسط “استن-TCA” براي غيرفعال کردن پروتئازها, خارج ساختن محتويات تداخل کننده، و براي غني ساختن پروتئينهاي بسيار قليايي، نظير پروتئينهاي ريبوزومي، در محلول ليز شده ي سلولي بسيار مفيد است.
۳-۲-۲- نمونه هاي بافتي

نمونه هاي بافتي جامد معمولا” درحضور بافر محلول کننده از هم مي پاشند. بهترين روش، خرد کردن بافت درحالي است که در دماي نيتروژن مايع يخ زده است. نمونه هاي بافتي کوچک که در پوششهاي آلومينيومي قرار داشته و در نيتروژن مايع يخ زده اند را مي توان با قراردادن ميان دو بلوک خنک يا با استفاده از هاون در زير نيتروژن مايع خرد کرد. قطعات بافتي بزرگ را مي توان با هموژنيزه کردن در بافر محلول کننده و با استفاده از هموژنايزرهايي با تيغه چرخان آماده کرد، اما بايد افزايش دما در اين وضعيت به حداقل رسانيده شود.
يک مشکل خاص در آناليز نمونه هاي بافتي ماهيت ناهمگون اين نمونه ها است. انواع مختلف سلولي ممکن است در نمونه هاي بافتي موجود باشد و در نمونه هاي بيمار ممکن است امکان جمع آوري جداگانه قسمت هاي سالم و بيمار بافت وجود نداشته باشد. روشهاي مختلفي براي مبارزه با اين مشکل بکارگرفته شده است. با استفاده از گزينش مثبت يا منفي و معمولا” بر اساس يک روش ايمونوافينيتي، امکان غني ساختن جمعيت خاصي از سلولها وجود دارد. اين سلولها را مي توان مستقيما” تحت بررسي با الکتروفورز دو بعدي قرارداد، يا مي توان با کشت کوتاه مدت قبل از الکتروفورز دو بعدي تعداد آنها را افزايش داد.
روش ديگر جداساختن ميکروسکوپي”Microdissection” براي بدست آوردن جمعيت سلولي خالص از يک قطعه بافتي است. استفاده از
“,LCMLaser capture microdessection” داراي جاذبه ي خاصي است. در اين روش، گزينش سلولي با فعال ساختن يک ورقه ي انتقال دهنده که در تماس با قطعه ي بافتي قرار داده شده است، صورت مي پذيرد. با کمک ميکروسکوپ معکوس “Scraper” ناحيه ي مورد نظر انتخاب مي شود. ناحيه اي از ورقه که با ليزر هدف گيري شده است به بافت زير خود اتصال مي يابد و اين

سلولها از بافت هاي اطراف جدا مي گردند. اين روش به سهولت براي آناليز اسيدهاي نوکلئيک بخاطر دردسترس بودن “, PCR Polymerase Chain Reaction” قابل استفاده است، چراکه “PCR” مقادير کم مواد موجود در چنين نمونه اي را تقويت و زياد مي نمايد. در دسترس نبودن روشي قابل مقايسه با “PCR” براي افزايش دادن پروتئينها، چالش اصلي در “LCM” براي جداسازي سلولها براي بررسي پروتئوم است.
۳-۲-۳- سلولها
براي برداشت سلولهايي كه در محيط آزمايشگاه به صورت سوسپانسيون رشد داده مي شوند يا نمونه هاي سلولي موجود در گردش خون، مثل لنفوسيتها و اريتروسيتها، موثرترين روش سانتريفوژ کردن است. چنين نمونه هايي پس از سانتريفوژ توسط بافر فسفات سالين “PBS” شستشو د

اده مي شوند و سرانجام در بافر محلول کننده حل مي شوند.
در مورد سلولهايي كه در محيط هاي جامد كشت داده مي شوند، بايد در وحلة اول سلولها را از محيط جامد جدا کرد. براي اين منظور ابتدا لاية سلولها توسط “PBS” يا يك محلول ايزوتونيك حاوي

سوكروز شستشو داده شود. از آنجا كه نمكهاي موجود در محيط کشت جامد و نمونه مي توانند با بعد اول الكتروفورز يعني “IEF” تداخل شديدي ايجاد نمايند، شستشو با محلول ايزوتونيك سوكروز براي كاهش دادن ميزان نمكهاي موجود در نمونه روش بسيار مناسبي است. بعد از آن مي توان سلولها را با لوپ يا اسكراپر “Scraper” برداشت كرد. استفاده كردن از آنزيمهاي پروتئولايتيك بر روي سلولهاي مستقر بر محيط جامد توصيه نمي شود اما بجاي آن مي توان سلولها را مستقيماً درحالي كه به محيط كشت چسبيده اند با اضافه كردن مقدار كمي از بافر محلول كننده ليز كرد.

اگر سلولها حاوي مقادير بالايي از اسيدهاي نوكلئيك باشند اين امر موجب ويسكوزيتي بالاي نمونه مي شود. در اين وضعيت نمونه ها بايد با معجوني از “DNase” و “RNase” عاري از پروتئاز تيمار شوند