مقدمه

سیب زمینی یکی از محصولات مهم کشاورزی در ایران بوده که از نظر تولید سالیانه بعد از گندم، برنج، ذرت و جو در مقام پنجم قرار دارد. استانهای اردبیل، اصفهان، همدان، فارس، آذربایجان شرقی و خراسان از مهمترین مناطق کشت این محصول در کشور میباشند (١). بیماری جرب سیبزمینی١ از بیماریهای باکتریایی این محصول میباشد که عامل آن گونههای مختلف جنس Streptomyces میباشند. باکتریهای وابسته به این جنس به خاطر تولید مواد متابولیکی ثانویه خصوصا آنتیبیوتیکها به خوبی شناخته شدهاند. در میان بیماریهایی که گونههای Streptomyces در گیاهان ایجاد میکنند جرب

مکاتبه کننده: امید عینی ۱ . Solanum tuberosum

سیبزمینی مهمترین آنهاست که به عنوان چهارمین بیماری مهم سیبزمینی در نواحی شمال آمریکا در سال ١٩٩١ گزارش شده است (٢).

اهمیت این بیماری به خاطر کاهش بازارپسندی و ارزش محصول به دلیل ایجاد علایم ظاهری روی غده و نیز غدهزاد بودن آن است. این بیماری در خاکهای خنثی و نسبتا” قلیایی بیشتر مشاهده شده است ولی از نواحی با خاکهای اسیدی pH)

کمتر از٢/٥) نیز گزارش شده است. بیماری جرب سیبزمینی

توسط باکتری (٨، ٢٢، ٢٣، ٣١) و سایر گونههای

Streptomyces ایجاد میشود (٣، ٧، ١٢، ١٣، ٢٢، ٢٤).

علایم ناشی از باکتری Streptomyces به اندامهای زیر زمینی گیاه محدود میشود و اولین علایم این بیماری اغلب به

S. scabies
٨٣٨ مجله علوم کشاورزی ایران، جلد ٣٤، شماره ٤، سال ١٣٨٢

صورت نکروز شدن محل آلودگی نمایان میشود. آلودگی سیستمیک تا کنون گزارش نشده است. اگرچه قسمتهای هوایی گیاه نیز در آلودگیهای شدید ریشه کاهش رشد پیدا کرده یا پژمرده میگردند علایم بیماری جرب سیبزمینی به صورت زخمهای کوچک برجسته بر روی اندامهای زیر زمینی در اطراف عدسکها یا حفرههای نکروزه عمیق تا عمق هفت میلیمتر در بافت میزبان میباشد که این علایم با توجه به استرین عامل بیماری و شرایط محیطی متغیر میباشند. شدت علایم بستگی به اثر متقابل بین میزبان، شرایط محیطی و استرین پاتوﮊن دارد

(١٠، ١٦، ٢٣).

گونههای بیماریزای جنس Streptomyces از نظر ویژگیهای مورفولوﮊیک، فیزیولوﮊیک و ترکیب اسیدهای چرب مختلف میباشند، که بیانگر آن است که این گونهها ارتباط نزدیکی با هم ندارند. هیبریداسیون DNA-DNA نیز مبین این مطلب است. درتمام استرینهای S. scabies و S. acidiscabies که توسط روش هیبریداسیون DNA-DNA

مقایسه شدهاند همولوﮊی DNA کمتر از ٢٠ درصد بوده است. سایر مطالعات نیز نشان داده است که S. ipomoeae با سایر گونهها از قبیل S. scabies (همولوﮊی DNA ٣٩ درصد)، S. acidiscabies (همولوﮊی DNA ١٧ درصد) و با گونههای غیر بیماریزا ارتباط نزدیکی ندارد (١٤، ٢٠).

یکی از روشهای سریع برای شناسایی باکتریهای ناشناخته آنالیز اسیدهای چرب دیواره سلولی است (٤، ٦، ١١). با استفاده از تغییر اسیدهای چرب دیواره سلولی میتوان استرینهای بیماریزای S. scabies، S. acidiscabies و S. albidoflavus

و استرینهای تولید کننده آنتی بیوتیک را از همدیگر متمایز ساخت (٢٥).
مطالعه اسیدهای چرب (٢٦ اسید چرب) در ٢٧ استرین

(٢٠ استرین بیماریزا و هفت استرین بازدارنده

(Streptomyces نشان داده که این استرینها کلا” دارای ١٦ تا ١٨ اسید چرب بودهاند که اسیدهای چرب ۱۶:۰ iso ، ۱۵:۰ anteiso بیشترین درصد اسیدهای چرب دیواره سلولی را در کلیه استرینها تشکیل داده اند. آنالیز واریانس (ANOVA)

اسیدهای چرب، تفاوتهای مهمی را در میزان برخی اسیدهای چرب در استرینهای بیماریزاها در مقایسه با غیر بیماریزاها نشان داده است (٢٥).

امروزه روشهای شیمیایی، مولکولی و تاکسونومی عددی جهت مقایسه گونههای Streptomyces به کار میروند که این روشها شامل: Phage typing ، هیبریداسیون DNA-DNA، ELISA ، تشخیص سریع بیوشیمیایی با استفاده از مواد ۴- metyl- umbeliferon-linked، مقایسه پروتئینهای ریبوزومی، آنالیز قطعات DNA حاصل از برش آنزیمهای محدودگر و مقایسه توالیs rRNA ١٦و s rRNA٢٣ میباشند

(٣).

بیماری جرب معمولی سیبزمینی که به وسیله باکتری S. scabies ایجاد میشود تا کنون از کشورهای اروپای شرقی و غربی، آفریقای جنوبی، استرالیا، نیوزلند، اسرائیل، آمریکا و کانادا گزارش شده است. عامل بیماری در برخی نواحی روی تربچه، شلغم و هویج نیز علایمی ایجاد میکند (٢٣).

تاکنون هیچ گزارش مدونی از بررسی و شناسایی عامل بیماری جرب سیبزمینی در ایران ارائه نشده است. با توجه به وجود علایم این بیماری بر روی غدههای سیب زمینی جمعآوری شده از اکثر مناطق سیبزمینی کاری کشور بررسی عامل بیماری به منظور شناسایی گونه یا گونههای باکتری و سایر میزبانهای آن جهت اتخاذ استراتژی مناسب جهت کاهش خسارت بیماری در آینده از اهمیت ویژهای برخوردار است.

مواد و روشها

نمونه برداری، جداسازی و نگهداری استرینها

در سال ١٣٧٩ از مزارع مختلف سیب زمینی استانهای همدان (ایستگاه تحقیقاتی تجرک، شهرستانهای بهار، قهاوند و همدان)، اصفهان (شهرهای دامنه، خوانسار، کمیتک، وران شمالی، فریدن)، چهارمحال و بختیاری (شهرهای نافچ، گندمان، سفید دشت، فرادنبه، بلداجی) و خراسان (شهرهای مشهد، تربت حیدریه، جلگه رخ) به طور تصادفی از غدههای دارای علایم بیماری نمونهبرداری شد. نمونهها در پاکتهای کاغذی قرار داده و به آزمایشگاه منتقل و در یخچال نگهداری گردید.

جهت جداسازی عامل بیماری، هر یک از نمونهها ابتدا زیر جریان ملایم آب و سپس با آب مقطر استریل شسته شدند.

نمونه با هیپوکلرید سدیم پنج تا ١٠ درصد (از ماده تجاری)

ضدعفونی کرده و سپس با آب مقطر استریل شستشو شدند و در اتاق کشت از لایه نازک حصیری رنگ زیر ناحیه آلوده (مرز بین

خداکرمیان و همکاران: الگوی پروتئین و اسیدهای چرب جدایههای … ٨٣٩

بافت سالم و آلوده) تکههایی از بافت غده جدا گردید و در آب مقطر سترون خرد شد. از سوسپانسیون ایجاد شده دو تا سه لوﭖ روی محیط کشت YMA (عصاره مخمر چهار گرم، عصاره مالت ١٠ گرم، دکستروز چهار گرم، آگار ٢٠ گرم در یک لیتر آب مقطر با ٣/٧( pH= و محیط آب آگار دارای آنتیبیوتیک

(١٠ میلی لیتر از محلول پایه حاوی نیستاتین١ ٥٠٠ میلیگرم، سولفلت پلیمیکسین٢ بی ٥٠ میلیگرم، پنیسیلین جی٣ ١٠ میلیگرم و سیکلوهگزامید٤ ٥٠٠ میلیگرم در یک لیتر محیط کشت)به صورت مخطط کشت شد. تشتکهای پتری کشت شده به صورت وارونه در دمای ٢٥ تا ٣٠ درجه سانتیگراد قرار داده شدند و پس از گذشت پنج تا هفت روز از تک کلنیهای رشد کرده که ظاهری شاخه شاخه داشتند، انتخاب و مجددا” تا خالص سازی کامل، روی محیطهای مذکور مخططگردیدند(٢٧). پساز جداسازی، تشخیص و انتخاب جدایههای Streptomyces

جهت نگهداری از روشهای سوسپانسیون در آب چهار درجه سانتیگراد، کشت بر روی محیط YMEA مورب در زیر پارافین در یخچال یا سوسپانسیون اسپور در گلیسرول ٢٠ درصد و نگهداری در دمای١٠درجه سانتیگراد زیر صفر استفاده شد(٢٨).

اثبات بیماریزایی

اثبات بیماریزایی روی تکههای سیب زمینی: ابتدا غده سیب زمینی را با آب شسشو داده و سپس با هیپوکلریت سدیم پنج تا ١٠ درصد از ماده تجاری و ١/٠ درصد کربنات کلسیم به مدت سه دقیقه ضدعفونی سطحی گردید، در شرایط استریل پوست غده را جدا کرده و از قسمت وسط غده قطعاتی به اندازه یک در دو سانتیمتر تهیه کرده و در تشتکهای پتری سترون قرار داده شد. سپس از هر ایزوله که قبلا” کشت شده و تولید اسپور کرده

(کشت ١٤ روزه) به همراه محیط کشت برداشته و به طور وارونه روی قطعات سیب زمینی قرار داده، برای شاهد منفی از محیط کشت OM تلقیح نشده و شاهد مثبت از استرین استاندارد بیماریزای S. scabies