ایمن سازی دهانی با ذرات نانو پادگن-جفتی و ایمن سازی تقویت زیرپوستی، واکنش های پادتن بدنی و مخاطی بلند مدت در موش ها را تحریک می کند

ساوانا ای. هاو، جولکا اچ. کونجوفکا

چکیده
عوامل بیماری زای ناشی از غذا یا آب میزبان خود را از طریق سطوح مخاطی روده ای مورد هجوم قرار می دهند، و بنابراین واکس های دهانی مؤثر تا حد زیادی بیماریهای مسری را کاهش میدهند. ماهیت پادگن و همچنین حالت درونی سازی آن در مخاط روده ای بر روی واکنش های ایمنی تأثیر می گذارد. ما نشان میدهیم که اوالبومین پادگن پروتئین مدل (Ova) از طریق دهان (p.o.) تحمل دهانی (OT) را تحریک میکند که توسط واکنش پادتن بدنی lgG1 توصیف می گردد، که نمی توان آنرا توسط ایمن سازی زیرپوستی (s.c.) با Ova با دوای ممد فروند (CFA) تقویت کرد. lgA روده ای تولید شده در واکنش نسبت به تغذبه Ova با گذشت زمان کاهش پیدا کرد و توسط مدیریت Ova ترکیب شده با ۲۰ nm از ذرات نانو (NP-Ova) تغییر داده شد. مدیریت p.o. از IgG1/IgG2c بدنی Ova-NP و مخاط روده ای برای تراوش IgA را تحریک میکرد. این واکنش ها توسط ایمن سازی s.c. با ایمن سازی p.o. یا Ova+CFA همراه با Ova-NP تقویت می شدند. البته فقط در سرم موش های تقویت شده توسط s.c. و پادتن های مخاطی چگالی محلول ها پس از آماده سازی بمدت ۶ ماه در اندازه بالا باقی ماندند. برعکس، آماده سازی s.c. با Ova-NP پادتن های سرم با سلطه IgG1 را تحریک می کرد، اما مخاط روده ای را برای تراوش IgA ، حتی پس از ایمن سازی ثانوی p.o. با Ova-NP آماده نمی کرد. این نتایج نشان میدهند که Ova ترکیب شده با NP ها به شکل ایمن زا به محیط درمانی داخلی می رسد، و اینکه ایمن سازی مخاطی با Ova-NP برای القاء واکنش ایمنی Th1/Th2 قطبیده و همچنین واکنش IgA روده ای ضروری است. همچنین، آماده سازی مخاطی با Ova-NP همراه با تقویت s.c.واکنش های حافظه مخاطی و بدنی را تحریک میکند. این یافته ها برای ساخت واکسن های مخاطی موثر مهم هستند.

مقدمه
اغلب عفونت های انگلی، ویروسی و باکتریایی در سطوح مخاطی رخ میدهند و بنابراین ساخت واکسن های مخاطی مؤثر تا حد زیادی بیماریهای عفونتی و مسری را کاهش میدهد. البته این کار عمدتاً بخاطر ثبات ضعیف، بالاگیری، و ایمن زایی پادگن های مخاطی مشکل است. در نتیجه، واکسن های مخاطی خیلی کمی در حال حاضر برای استفاده در انسان ها مجاز می باشند. واکسن های دهانی خصوصاً برای ایمن سازی گسرتده راحت هستند، چون آنها در تزریقات پراگوارشی ترجیح داده می شوند و استفاده از آمپول و سرنگ را حذف میکنند. واکسن های دهانی برای اینکه مؤثر باشند باید بطور مؤثر در سطوح مخاطی دورنی گردند و عامل تأثیرگذار مختص به پادگن، و همچنین واکنش سلول های B و T را تحریک کند. پادگن های مخاطی خصوصاً برای محافظت در مقابل عوامل بیماریزا و زهرابه های آنها مهم هستند، که می تواند پادگن های مخاطی را خنثی سازد و دسترسی آنها به محیط درمانی داخلی را محدود سازد. IgA تراوشی می تواند میکرو ارگانیسم ها و زهرابه ها را خنثی سازد و از تماس آنها با مانع سلولی مخاطی جلوگیری کند. خصوصاً مشخص شد که IgA روده ای سم وبا را خنثی می سازد و جنبدگی سالمونلا را کاهش میدهد و همچنین توانایی باسیل شیگلا برای هجوم بر بافت پوششی روده ای را کاهش میدهد. همچنین، مشخص شد که انتقال دهانی پادگن های IgA خاص از موش ها در مقابل عفونت های باکتریایی مانند ، ، و حفاظت میکنند. IgA علاوه بر کمک به به دام انداختن پادگن ها در مخاط روده ای، برای بیرون انداختن پادگن ها از محیط درمانی داخلی در لومن روده ای از طریق ترانسیتوسیز، و همچنین انتقال پادگن های لومن به بافت های خلطی زیرین برای آغاز واکنش های ایمنی نیز مهم است. اگرچه واکسیناسیون پراگوارشی پادگن های بدنی و حفاظت در مقابل بعضی از عوامل بیماریزای مخاطی مانند HPV، ویروس های فلج اطفال و آنفولانزا را تحریک میکند، و واکسیناسیون

مخاطی پادتن های بدنی و مخاطی موضعی را تحریک میکند که حفاظت در مقابل عوامل بیماریزای مخاطی مانند HIV، روتاویروس، نورو ویروس، و را ایجاد میکنند. بنابراین، تأثیر و کارایی یک واکسن دهانی تا حد زیادی به توانایی واکسن برای تحریک تولید بلند مدت پادتن ها در سطوح مخاطی بستگی دارد. همچنین، برای افزایش کارایی فرمول بندی واکنش، استراتژی های ایمن سازی مختلفی مورد استفاده قرار می گیرند. سیستم ایمن سازی تقویت-اصلی بر روی موضعی

سازی و قدرت واکنش ایمنی، و در نتیجه بر روی کارایی واکسن تأثیر می گذارد. ایمن زایی بسیاری از فرمول بندی های واکسن ها به مدیریت همزمان آنها با دوای ممد بستگی دارد. البته نگرانی های امنیتی در مورد استفاده از دواهای ممد وجود دارد. همچنین، کاهش زهراگینی واکسن های زنده که برای ایمن سازی مخاطی ایجاد می گردد، نگرانی هایی را پیش می آورد که آسیب های تقلیل داده شده ممکن است باعث برگشت، راه اندازی، یا تشدید بیماری های خود ایمن گردند، و یا باعث بیماری هایی در افراد ایمن-سازگار شده شود.

برای غلبه بر بعضی از این مشکلات، استفاده از ذرات در مقیاس نانو بعنوان ابزاری برای استفاده همراه با پادگن ها یا داروها متداول شده است. NP هایی با اندازه های مختلف از موادی با زیست تجزیه پذیر ساخته شده اند می توان آنها را با پادگن های بسیاری ترکیب کرد، و بنابراین بصورت بالقوه ایمن هستند و در عین حال ایمنی در مقابل عوامل بیماریزای بسیاری را تحریک میکنند. NP های بزرگتر از ۲۰۰ نانومتر بعلت توانایی خود برای حمل مقدار زیادی از پادگن، عمدتاً همراه با پادگن ها

استفاده می گردند. البته NP های کوچک تر نیز می توانند به مانع مخاطی نفوذ کنند و در سطوح مخاطی بصورت موثرتری در مقایسه با NP های بزرگتر، درونی سازی گردند. ما نشان دادیم که سلول های مخاطی روده ای p.o. همراه با NP های ۲۰ و

۴۰ نانومتری را درونی می سازند، که سپس به گره

های لنفاوی میان روده ای (MLN) انتقال داده می شوند. ما در اینجا اثبات میکنیم که پادگن ترکیب شده با NP ، p.o. هایی را مدیریت میکند که به شکل ایمن زا به محیط درمانی داخلی می رسند و پادگن های بدنی و مخاطی را تحریک میکنند. ما همچنین نشان میدهیم که آماده سازی مخاطی با Ova-NP برای یک واکنش ایمنی Th1/Th2 بدنی ترکیبی ضروری است. بعلاوه، آماده سازی مخاطی با Ova-NP همراه با ایمن سازی تقویت s.c. برای تحریک سرم های بلند مدت IgG1 و IgG2c و همچنین IgA روده ای ضروری بود. این یافته ها مفاهیمی برای ساخت واکسن های مخاطی و استراتژی های ایمن سازی تقویت-اصلی دارند. این مطالعه همچنین به درک مکانیزم های اساسی کمک میکند که بر واکنش های ایمنی برای پادگن های دهانی غالب هستند.

مواد و روشها
بیانیه اخلاقی
این مطالعه در تطابق شدید با پیشنهادات راهنمای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی از سازمان های ملی بهداشت انجام شد. این پروتکل توسط هیئت مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه جنوبی ایلی نویز اثبات شد. حیوانات توسط تسهیلات آموزشی، فنی و پرسنل دامپزشکی نگهداری می شدند.

حیوانات، واکنشگرها و پادتن ها
برای این مطالعات، از موش های نر و ماده C57BL/6 با سن ۶ تا ۸ هفته استفاده شد. Chicken Ova بعنوان پادگن پروتئین مد استفاده شد. ذرات نانوی پلی استیرن فلورسنت با تغییر اسید کربوکسیلیک با Ova ترکیب شد و هر دسته ای از NP های جفتی توسط نقطه-لکه تحلیل شد. پادتن های ضد Ova خرگوش در ترکیب با streptavidin-FITC برای شناسایی Ova و Ova-NP بعنوان لکه های نقطه ای استفاده شد. پادتن های IgA ، IgG1 و IgG2c ضد موش از بز ترکیب شده با فسفاتاز قلیایی برای تعیین چگالی محلول پادتن در عصاره های سرم و سرگینی از موش های ایمن شده استفاده می شدند.
مدیرین Ova و Ova-NP در موش ها
برای ایمن سازی های p.o. موش ها بمدت ۴ ساعت گرسنه نگه داشته شدند، و سپس (کنترل)، و یا دوز معادل با Ova با استفاده از یک آمپول در روزهای ۰، ۳، ۶ و ۸ از طریق شکم به بدن آنها وارد شد. بطور کلی، موش ها (کنترل)، ، و (بصورت Ova-NP یا محلول Ova) دریافت کردند. برای ایمن سازی، NP ها تا تقلیل داده شدند. در آزمایشات دیگر، موش ها توسط p.o. با Ova-NP یا s.c. با از Ova-NP ، و سپس p.o. تقویت شده با از Ova-NP رقیق شده در PBS تا ۱۰ درصد نسبت به غلظت اولیه خود به اندازه ۲ درصد آماده سازی شدند.

جمع آوری قرص های مدفوعی و نمونه های خون
قبل از ایمن سازی و هر هفته پس از آن، قرص های مدفوعی از هر موش جمع آوری شد و در PBS حاوی ۰٫۰۲ درصد آزید سدیم تا غلظت نهایی ۱۰۰ میلی گرم ماده خشک/میلی لیتر از PBS رقیق شد. قرص های مدفوعی رقیق شده همگن شدند و سپس بمدت ۱۰ دقیقه در معرض نیروی گریز از مرکز g × ۱۰۰۰۰ قرار داده شدند. شناور خالی از باقیمانده های مدفوعی جمع آوری شدند و در دمای -۲۰ درجه سانتیگراد تا زمان تحلیل بعدی ذخیره شدند. نمونه های خون از طریق رگ دم با استفاده از یک سوزن ۳۰ g جمع آوری شدند، و سرم در دمای -۲۰ درجه سانتیگراد تا زمان تحلیل بعدی ذخیره شد.
تعیین چگالی محلول پادتن مختص به Ova در عصاره های سرم و مدفوعی با استفاده از معیار ELISA

صفحات ۹۶ حفره ای با ته پهن با از محلول Ova در بافر پوشش دهی روکش کاری شدند و در طول شب در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگه داشته شدند. پس از اینکه پادگن رها شده برداشته شد، حفره ها بمدت یک ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد با از بافر انسداد مسدود شدند. اگرچه آلبومین سرم گاوی (BSA) اغلب برای معیارهای ELISA استفاده می گردد، با اینحاب برای اجتناب از خطاهای آزمایشی ناشی از واکنش های بین BSA و پادتن های مختص به Ova و همچنین واکنش

های بین Ova و پادتن های شد BSA، از ژلاتین خوکی استفاده شد. پس از انسداد، صفحات سه بار با PBS حاوی ۰٫۰۵ درصد Tween-20 و ۰٫۰۲ درصد آزید سدیم با استفاده از یک شوینده اتوماتیک شسته شدند. پس از شستشو، از نمونه به ستون اول حفره ها اضافه شد و سپس در حفره های متوالی بافر انسداد رقیق شد و در طول شب در دمای ۴ درجه سانتیگراد پرورانده شدند. سپس صفحات سه بار شسته شدند و سپس به هر حفره از IgG1 ، IgG2c یا IgA ضد موش از بز ترکیب

شده با APاضافه شد، که به اندازه رقیق شدند و در بافر انسداد قرار داده شدند و بمدت ۲ ساعت در دمای اتاق پرورانده شدند. سپس صفحات سه بار شسته شدند و فعالیت AP توسط اضافه سازی از زیرلایه AP آزمایش شد و سپس بمدت ۲۰ دقیقه در دمای اتاق و به دور از نور پرورانده شدند. سپس واکنش با متوقف شد و مقدار جذب در ۴۰۵ نانومتر با استفاده از یک صفحه خوان خوانده شد. چگالی های محلول پادتن بصورت مقدار از بالاترین رقیق سازی متقابل بیان می گردند که مقدار OD به اندازه دو برابر کنترل منفی بدست می آید.

تحلیل آماری
هر آزمایش دوبار تکرار شد. داده ها با استفاده از راهکارهای ANOVA از نرم افزار SAS تحلیل شدند. میانگین گروه ها با استفاده از آزمایش Student’s t-test یا راهکار مقایسه چندگانه Tukey جداسازی شدند و بصورت خیلی متفاوت با در نظر گرفته شدند. داده ها بصورت میانگین انحراف استاندارد بیان شدند.
نتایج
مدیریت p.o. از Ova-NP سرم IgG2c/IgG1 و IgA روده ای را تحریک میکند، درحالیکه تغذیه Ova سرم پادتن های IgG1-غالب و IgA روده ای کوتاه مدت را تحریک میکند
ما بررسی کردیم که آیا مدیریت Ova ترکیب شده با p.o. های NP (و نه OT) ایمنی مختص به پادتن ها را تحریک میکند. OT یک پادتن خوراکی را ایجاد میکند که توسط کاهش در عملکردهای سلول T، متوقف سازی سرم IgE، IgG2a وابسته به Th1، و همچنین واکنش های IgA مخاطی توصیف شده است. بنابراین ما برای کنترل پروتکل ایمن سازی ، دوز بالایی از Ova برای کاهش OT را استفاده کردیم تا بررسی کنیم که آیا تحویل Ova از طریق NP ها OT را لغو میکند یا نه. همچنین، گروهی از موش ها با دوز پایینی از Ova محلول تغذیه شدند تا این امکان از بین برود که واکنش های ایمنی مشاهده شده در موش های ایمن شده Ova-NP بعلت دوز پادگن هستند. یک ویژگی دیگر OT متوقف سازی واکنش بدنی و همچنین واکنش ایمنی روده ای نسبت به نمایش پادگن بعدی است. بنابراین در روز ۲۸ ام پس از آخرین مدیریت Ova محلول، s.c. با به موش ها تزریق شد. موش هایی که به آنها Ova داده شده بود چگالی محلول IgG1 سرم بالاتری را در روزهای ۷، ۱۴ و ۲۸ در مقایسه با موش های کنترل و موش هایی که p.o.Ova-NP به آنها داده شده بود نشان دادند. همانطور که پیش بینی می شود، هیچ IgG1 سرم مختص به Ova در موش های کنترل در روزهای ۷، ۱۴ یا ۲۸ شناسایی نشد. تزریق s.c. از در روز ۲۸ ، سرم IgG1 را در موش های کنترل تحریک کرد و تا حد زیادی چگالی محلول سرم IgG1 را در موش هایی تقویت کرد که Ova-NP به آنها داده شده بود، اما در موش هایی که محلول Ova به آنها داده شده بود اینطور نبود. در مقایسه با این، موش هایی که Ova-NP به آنها داده شده بود محلول چگالی سرم IgG2c بالاتری را در روز ۱۴ در مقایسه با موش های کنترل و تغذیه شده با Ova نشان دادند. ایمن سازی s.c. تا حد زیادی چگالی محلول سرم IgG2c برای موش های Ova-NP و تغذیه شده با Ova تقویت کرد، درحالیکه موش های کنترل هیچ چگالی محلول سرم IgG2c را قبل یا بعد از ایمن سازی s.c. نشان دادند.

شکل ۱ – واکنش های پادتن در سرم موش های تغذیه شده با p.o. و محلول Ova ، Ova-NP یا PBS

شکل ۲ – واکنش های IgA روده ای در موش های تغذیه شده با p.o. و محلول Ova ، Ova-NP یا PBS

شکل ۳ – شکل ۲ –چگالی محلول پادتن های سرم ها در موش های تغذیه شده با p.o.و Ova-NP پس از آماده سازی p.o. یا s.c. با Ova-NP

موش های تغذیه شده با Ova-NPمحلول چگالی سرم IgG2c نسبتاً بالاتری در روز ۴۲ در مقایسه با چگالی محلول موش های کنترل و موش های تغذیه شده با Ova داشتند. برای بررسی تغییرات IgA روده ای مختص به Ova در طول زمان، قرص های مدفوعی از موش های منفرد جمع آوری شدند و از لحاظ وجود IgA مورد بررسی قرار گرفتند. هیچ مقدار قابل اندازه گیری از IgA در عصاره های مدفوعی موش های کنترل و موش های تغذیه شده با Ova-NP در روزهای ۷، ۱۴ یا ۲۸ شناسایی نشد.

برعکس، موش هایی که با محلول Ova تغذیه شده بودند، چگالی محلول IgA مدفوعی نسبتاً بالاتری را در روز ۱۴ پس از مدیریت p.o. نشان دادند. البته این چگالی های محلول پایدار نبودند و با چگالی های محلول موش های کنترل یا تغذیه شده توسط Ova-NP در روز ۲۸ متفاوت نبودند. ایمن سازی s.c. با در روز ۲۸ تا حد زیادی چگالی های محلول IgA را فقط در عصاره های مدفوعی از موش های ایمن شده با p.o. و Ova-NP تقویت کرد، اما IgA روده ای را در موش های تغذیه شده با Ova

خنثی کرد. موش های کنترل تغذیه شده با PBS و ایمن شده با در روز ۲۸ هیچ IgA را در عصاره های مدفوعی در هیچ نقطه زمانی آزمایش شده ای نشان ندادند. موش هایی که با یک دوز از محلول Ova تغذیه شده بودند با مقدار Ova داده شده از طریق Ova-NP قابل مقایسه بودند و سرم IgG1 و IgG2c را نشان دادند که مقداری کمتر از چگالی محلول موش هایی بود که با دوز بالایی از Ova تغذیه شده بودند. در موش هایی که با دوز پایینی از Ova تغذیه شدند، IgA در عصاره های مدفوعی در روز ۱۴ پس از ایمن سازی قابل شناسایی بود و با چگالی محلول IgA در عصاره های موش هایی که با ذوز بالایی از Ova تغذیه شدند قابل مقایسه بود. همچنین، تزریق s.c. با ، IgA روده ای موش هایی را تقویت نکرد که با دوز پایینی از Ova تغذیه

شده بودند. موش هایی که با p.o. و Ova-NP تغذیه شده بودند، IgA خیلی بالاتری در مقایسه با موش های تغذیه شده با دوز بالا و پایینی از IgA پس از ایمن سازی s.c. داشتند.
آماده سازی p.o. با Ova-NP برای تحریک تغییر ایزوتایپ ضروری است، که منجر به واکنش ایمنی بدنی IgG2c/IgG1 قطبیده و IgA روده ای می گردد
ما سپس بررسی کردیم که آیا تغذیه با Ova-NP برای قطبش سازی Th1/Th2 و برای تحریک IgA روده ای کاملاً مورد نیاز است. برای اینکار، ابتدا دو گروه از موش ها با p.o. یا s.c. همراه با Ova-NP ایمن سازی شدند و سپس p.o. با Ova-NP تقویت شد. در روز ۷ موش های تغذیه شده با s.c. چگالی محلول سرم IgG1 خیلی بالاتری در مقایسه با موش های تغذیه شده با p.o. داشتند، که البته هر دو گروه دارای چگالی محلول سرم IgG1 قابل مقایسه ای در روزهای ۱۴، و ۲۸ پس از ایمن سازی بودند، که تا حدودی توسط ایمن سازی دوم p.o. فقط در موش های تغذیه شده با p.o. افزایش یافت . موش های تغذیه شده با p.o. و Ova-NP چگالی محلول سرم IgG2c قابل توجهی را در روز ۱۴ نشان دادند، که در مقایسه با چگالی های محلول موش های تغذیه شده با s.c. در روزهای ۱۴، ۲۸ و ۴۲ خیلی بالاتر بودند. مانند سری آزمایشات اول، مقدار مهمی از IgA در عصاره های مدفوعی موش های تغذیه شده با p.o. فقط پس از مدیریت Ova-NP با p.o. دوم در روز ۲۸ مشاهده شد. در روز ۴۲ موش های تغذیه شده با p.o. و تقویت شده با p.o. ، IgA نسبتاً بالاتری در مقایسه با موش های تغذیه شده با s.c. و تقویت شده با p.o. و Ova-NP داشتند . بصورت غیر مترقبه ای در روزهای ۷ و ۴۲، موش هایی که با s.c. و Ova-NP تغذیه شده بودند IgA قابل اندازه گیری در نمونه های ترکیبی از عصاره های مدفوعی داشتند. تحلیل نمونه های عصاره مدفوعی و سرم فردی جمع آوری شده در روزهای ۷ و ۴۲ مشخص ساخت که فقط ۱ موش از ۵ موش تغذیه شده با s.c. و تقویت شده با p.o. ، سرم IgG2c و IgA روده ای را داشت که میانگین های کلی گروه را تحریف می کرد. آزمایش نسبت های سرم IgG1:IgG2c در روز ۴۲ مشخص ساخت که موش های تغذیه شده با s.c. و Ova+CFA یا Ova-NP باعث واکنش IgG1-غالب شدند، و نسبت های IgG1:IgG2c در مقایسه با نسبت های IgG1:IgG2c موش های تغذیه شده با p.o. و Ova-NP نسبتاً بالاتر بودند. همچنین، موش های تغذیه شده با Ova-NP سپس تقویت شده با s.c. و Ova+CFA یا p.o. با Ova-NP پایین ترین نسبت های IgG1:IgG2c را داشتند که نشاندهنده قطبش Th1 قوی بود. در روز ۴۲ نسبت های IgG1:IgG2c بین این دو گروه تا حد زیادی با هم تفاوت نداشتند.

شکل ۴ – تحریک IgA روده ای و واکنش پادتن سرم IgG2c به جریان ایمن سازی بستگی دارد که برای آماده سازی بکار برده می شد

شکل ۵ – سرم IgG1 ، IgG2c موش و چگالی محلول پادتن IgA مدفوعی در ۶ ماه پس از ایمن سازی تغذیه

جدول ۱ – چگالی محلول پادتن بدنی و مخاطی مختص به Ova در روزهای ۴۲ و ۱۸۰ پس از ایمن سازی تغذیه

چگالی محلول پادتن بدنی و مخاطی تحریک شده توسط مدیریت Ova-NPp.o. همراه با تقویت s.c. با Ova+CFA برای دوره های زمانی تمدید شده به نسبت بالا باقی می ماند
تحلیل نمونه های مدفوعی و سرم جمع آوری شده در ۶ ماه پس از تغذیه نشان داد که چگالی محلول سرم های IgG1 و IgG2c مختص به Ova و همچنین IgA روده ای در موش های تغذیه شده با p.o. و Ova-NP و s.c. تقویت شده با Ova+CFA در مقایسه با موش های تغذیه شده با p.o. و تقویت شده با p.o. و Ova-NP نسبتاً بالاتر بودند. همچنین، موش های تغذیه شده با p.o. و تقویت شده با Ova-NPIgG2c و IgA روده ای نسبتاً بالاتری در مقایسه با موش های تغذیه شده با s.c. و تقویت شده

با p.o. داشتند. جالب اینکه، در ۶ ماه پس از تغذیه، موش های تغذیه شده با Ova-NP و s.c. و تقویت شده با Ova+CFA چگالی محلول سرم IgG2c و IgA روده ای نسبتاً بالاتری در مقایسه با چگالی محلول های روز ۴۲ داشتند. برعکس، در موش های تغذیه شده و تقویت شده با p.o. و Ova-NP چگالی محلول سرم IgG1 در ۶ ماه پس از تغذیه تا حد زیادی کاهش پیدا کرد . همچنین یک کاهش (البته بی اهمیت) در چگالی محلول های سرم IgG2c وجود داشت، درحالیکه چگالی محلول IgA روده ای خیلی تغییر پیدا نکرد. در موش های تغذیه شد با s.c. و تقویت شده با p.o. و Ova-NP ، چگالی محلول سرم های IgG1 ، IgG2c و IgA روده ای تا حد زیادی بین روزهای ۴۲ و ۱۸۰ متفاوت نبود.

بحث
ماهیت پادگن بر روی بالاگیری آن در مخاط روده ای، انتقال به بافت های لنفاوی عمیق تر، و در نتیجه ایمن زایی آن تأثیر می گذارد. پادگن های بزرگتر عمدتاً توسط سلول های M درونی سازی می شوند که در بافت پوششی قرار گرفته روی لکه های پیر (PP) و غده های لنفاوی مجزا شده یافته می شوند. باکتری ها را میتوان توسط سلول های دندریت ، و از تیغه پروپریا نیز درونی کرد، که میتواند دندریت ها را بین سلول های مخاطی روده کوچک توسعه دهد. برعکس، پادگن های پروتئین انحلال پذیر که بدون هضم شدن به روده کوچک می رسند ممکن است از طریق گذرگاه های وابسته به سلول وارد تیغه پروپریا شوند و به ها انتقال داده شوند. مشخص شد که انتقال پادگن های پروتئین به MLN ها توسط های تیغه پروپریا برای تحریک OT ضروری است. هاو و همکارانش نشان دادند که NP های ۲۰ و ۴۰ نانومتری نه تنها توسط سلول های مخاطی قرار گرفته بر روی PP درونی شدند، بلکه توسط سلول های مخاطی قرار گرفته بر روی پرز نیز درونی شدند. همچنین، در تیغه پروپریا از پرز، NP ها اغلب بصورت موضعی شده با ها و مشاهده می شدند. ما بررسی کردیم که آیا مدیریت p.o. از پادگن مدل Ova ترکیب شده با NP های ۲۰ نانومتری، واکنش های ایمنی مختص به Ova را تحریک میکند، بجای OT که در مدیریت Ova انحلال پذیر مشاهده می گردد. ما همچنین این مسئله را بررسی کردیم که جریان های تغذیه و تقویت دوم ایمن سازی ها بر روی واکنش های پادتن مخاطی و بدنی بعدی تأثیر می گذارند. ما نشان دادیم که مدیریت p.o. محلول p.o. واکنش بدنی IgG1-غالب را تحریک میکند که توسط مدیریت Ova بعدی تقویت نمی گردد. تغذیه Ova همچنین IgA روده ای را تحریک می کرد. این واکنش یادآور واکنش IgA روده ای برای E.cloi وخش پروره ای بود که بسرعت نمایش میکروب های هم پروری را خنثی کرد. بنابراین مانند موجودی IgA روده ای که گونه های میکروبی اصلی را نشان میدهد، موجودی IgA روده ای همچنین پادگن های روده ای تغذیه ای برجسته ای را نشان میدهد. واکنش IgA مخاطی نیز ممکناست پادگن های روزده ای تغذیه ای برجسته ای را نشان دهد. واکنش IgA مخاطی به محلول Ova نیز دارای خصوصیات حافظه ایمنی و تقویت-اصلی کلاسیک مانند تزریق Ova+CFA نیست که IgA ردوه ای مختص به Ova را تقویت نکرد. برعکس، Ova ترکیب شده با NP های ۲۰ نانومتری واکنش پادتن سرم ترکیبی IgG2c/IgG1 را تحریک کردند و مخاط روده ای برای تراوش IgA را آماده سازی کردند. برخلاف چگالی محلول پادتن تحریک شده توسط محلول Ova ، سرم IgG2c/IgG1 و همچنین Ova روده ای تحریک شده توسط Ova-NPp.o.تا حد زیادی توسط مدیریت Ova-NPp.o. یا Ova+CFAs.c. بعدی تقویت شدند. ما در تطابق با یافته های دیگران نشان دادیم که s.c. مدیریت شده Ova-NP مانند CFA در تحریک پادتن های مختص به Ova موثرتر هستند. همچنین،

NP ها واکنش های التهابی پیرامونی یا موضعی را ایجاد نمی کنند که اغلب با CFA یا دواهای ممد دیگر مشاهده می شد. یک مشاهده خیلی مهم دیگر اینست که تغذیه مخاطی با Ova-NP قطبش سازی Th1/Th2 قوی را تحریک می کرد، درحالیکه تغذیه s.c. عمدتاً واکنش ایمنی نوع Th2 را تحریک می کرد، که توسط تحلیل چگالی محلول پادتن سرم های IgG1 و IgG2c نشان داده شده است. برتری و غلبه سرم IgG1 و عدم برتری سرم IgG2c و IgA روده ای در موش های تغذیه شده با Ova-

NP نشان میدهد که تحویل Ova از طریق NP ها بخودی خود تغییر ایزوتایپ را تحریک نمی کند. جریان مدیریت پادگن که برای ایمن سازی تغذیه استفاده شد بر روی منحرف سازی Th1 یا Th2 تأثیر می گذارد و قوی ترین قطبش Th1 در موش های تغذیه شده با p.o. و Ova-NP مشاهده شد. همچنین، IgA روده ای فقط در موش هایی مشاهده شد که از طریق سطوح

مخاطی با Ova یا Ova-NP تغذیه شده بودند. تغییر ایزوتایپ IgAممکن است در PP، MLN و احتمالاً در تیغه پروپریا از روده کوچک رخ دهد. همه این موقعیت های کالبدشناسی میتوانند PAMO های میکروبی ناشی از میکروفلورای هم پروروی را پرورش دهند، و بنابراین نمایش پادگن در این محتوا می تواند مسئول تغییر ایزوتایپ باشد، که منجر به IgG1 ، IgG2c و IgA روده ای می گردد. بقیه نشان داده اند که سیگنال دهی MyD88 برای تحریک IgG2c برای پادگن های وابسته به غده تیموس ضروری است، و اینکه توسعه واکنش Th1 اولیه و IgG2c نیازمند فعالسازی MyD88برای لنفوسیت های DC و B است.

مشخص شد کهعدم وجود MyD88 نیز باعث اختلال در تولید IgA در لکه های پیر می گردد، که نشاندهنده اینست که سیگنال دهی از طریق گیرنده های شبیه به ناقوس نقش کلیدی را در ایمنی مخاطی با وساطت IgA ایفا میکند. در این دو آزمایش جداگانه، ایمن سازی s.c. با Ova+CFA به تنهایی مقدار قابل اندازه گیری از سرم IgG2c را دو هفته پس از ایمن سازی تحریک نکرد. همچنین، موش های تغذیه شده فقط با Ova-NP دارای واکنش خلطی IgG1-غالب بودند، اگرچه در ۱

موش از ۵ موش IgG2c و IgA روده ای مشاهده شد. مشخص شد که NP های کوچک و ذرات شبه-ویروس ۳۰ نانومتری مدیریت شده بصورت میان پوستی، بصورت آزادانه در LN های موضعی تخلیه می گردند، درحالیکه NP های بزرگ اغلب در محل تزریق باقی می مانند. بنابراین قابل مشاهده است که کسر کوچکی از NP های s.c. تزریق شده در پشت یک موش می تواند به MLN نیز برسد، که تغییر ایزوتایپ ممکن است رخ دهد. تحریک واکنش های IgA در MLN ها پس از ایمن سازی s.c. قبلاً اثبات شده بود، که منجر به این پیشنهاد شد که رابطه عملکردی بین بافت های مخاطی و پوست وجود دارد.
مشخص شد که ایجاد حافظه ایمن زای مخاطی با استفاده از سم وبا بعنوان یک پادگن امکان پذیر است. البته ایمنی مخاطی کاهش یابنده سریع، نشان میدهد که حافظه مخاطی ممکن است کوتاه مدت باشد. IgA مخاطی تحریک شده پس از ایمن سازی p.o. موش ها با ذرات بدون دوای ممد، در هفته ۷ و ۸ پس از ایمن سازی بترتیب حدود ۴۰ و ۶۰ درصد کاهش یافت. در یک مطالعه مشابه، چگالی محلول پادتن IgA بزاقی در هفته ۱۳ پس از ایمن سازی حدود ۹۰ درصد کاهش یافت، که

نشاندهنده اینست که تراوش IgA روده ای تحریک شده توسط ایمن سازی p.o. با ذرات بزرگ کوتاه مدت است. ما نشان میدهیم که ایمن سازی p.o. منفرد فقط با NP ها برای تحریک چگالی محلول بالای از IgA در عصاره های مدفوعی کافی نیست. البته ایمن سازی s.c. موش های تغذیه شده با p.o. چگالی محلول IgA روده ای بالاتری داشتند. همچنین، ایمن

سازی p.o.-p.o. با Ova-NP نیز IgA روده ای را تقویت می کرد که برخلاف سرک های IgG1 و IgG2c بدنی، در ۶ ماه پس از تغذیه کاهش زیادی پیدا نکرد. این یافته با یافته های بقیه مغایرت دارد و ناهمخوانی ها در نتایج ما ممکن است بعلت تفاوت در اندازه NP های استفاده شده برای ایمن سازی باشد، چون بالاگیری NP ها در روده رابطه معکوسی با اندازه آن دارد. همچنین، اندازه NP ها نیز نقش مهمی را در حجم و کیفیت واکنش ایمنی ایفا میکند، چون مشخص شده است که NP های کوچک تر در تحریک ایمنی خلطی با وساطت سلول ها ، و همچنین در حفاظت از موش ها در مقابل تومور ها مؤثرتر هستند.
تحریک یک واکنش ایمنی Th1/Th2 و حافظه ایمنی مخاطی برای تأثیر و کارایی یک واکسن مخاطی ضروری است. واکنش های مؤثر Th1 برای حفاظت در مقابل عوامل بیماریزای مخاطی مانند ، و غیره مهم هستند. واکنش های Th2 از تولید پادتم مانند IgA مخاطی و IgG بدنی پشتیبانی می کند که برای حفاظت در مقابل و زهرابه های آن، روتراویروس، نورو ویروس، ویروس آنفولانزا، پلی ویروس و غیره ضروری هستند.

درک بهتر این مسئله که پادگن ترکیب شده با NP چطور به بافت های لنفاوی عمیق تر انتقال داده می شود، و نمایش آن برایلنفوسیت های T برای طرحی NP بر اساس واکسن های مخاطی مهم است. همچنین، اینکار به درک ما از این مسئله کمک میکند که NP های تغذیه ای متداول چطور نقش مهمی را در تزریق مخاط های روده ای به پادگن های تغذیه ای بی ضرر ایفا میکنند. استفاده از NP ها برای ساخت واکسن نسبت به راهکارهای قبلی چندین مزیت دارد. NP ها توسط سلول های مخاطی روده ای بصورت مؤثر درونی می گردند و برای مؤثر بودن نیازمند دواهای ممد نیستند، و بنابراین هیچ مسئله امنیت

ی را ایجاد نمی کنند. NP های با زیست تجزیه پذیر را می توان در کپسول های قابل هضم قرار داد تا از پادگن در مقابل خراب شدن حفاظت گردد، و بنابراین ایمن زایی فرمول بندی واکسن افزایش یابد. مطالعات بیشتری برای بررسی این احتمالات مورد نیاز است. اگرچه مدیریت p.o. بدون سوزن واکسن های مخاطی NP-مبنا خصوصاً برای ایمن سازی های حجیم ضروری است، با ایحال ایمن سازی تقویت ثانوی به نظر می رسد که برای تحریک پادگن های بدنی و مخاطی ضروری و لازم باشد.