بررسي اثر زانتان و كاراگينان بر خواص حلاليت ايزوله پروتئين سويا

چکيده
محدوديت هايي در استفاده از پروتئين سويا مانند حلاليت کم و طعم نامطلوب آن وجود دارد. در اين پژوهش سعي گرديد كه خواص عملکردي پروتئين سويا توسط دو صمغ زانتان و کاراگينان بهبود يابد. زانتان در چهار سطح ۰، ۰۴/۰، ۰۹/۰ و ۱۳/۰ درصد و کاراجينان در سطوح ۰، ۰۳/۰، ۰۷/۰ و ۰۹/۰ درصد (در محلول) استفاده شد و صفت‌هاي حجم سرم، حجم رسوب و ضريب حلاليت نيتروژن مورد ارزيابي قرار گرفت.

نتايج آماري نشان داد که نمونه هاي داراي ۱۳/۰ درصد زانتان، ۱۳/۰ درصد زانتان و ۰۷/۰ درصد کاراجينان ، ۱۳/۰ درصد زانتان و ۰۹/۰ درصد کاراجينان و ۰۹/۰ درصد زانتان و ۰۹/۰ درصد کاراجينان داراي کمترين حجم سرم و رسوب و بالاترين ميزان حلاليت بودند.
مقدمه

دربسياری از مواد غذايی، پروتئين و پلی ساکاريد بصورت توأم وجود دارد. در فرمولاسيون مواد غذايی کلوئيدی، ازپروتئين‌ها به دليل خواص امولسيون كنندگي و توليد کف و از کربوهيدرات‌ها بعنوان نگهدارنده آب و قوام دهنده استفاده می‌شود. علاوه بر اين پروتئين‌ها و کربوهيدرات‌ها در ماده غذايی ايجاد بافت و ساختار مناسب می‌نمايند۱,۲)).
واکنش پروتئين – پلی ساکاريد عمدتاً الکترواستاتيکی است و قدرت واکنش به pH و قدرت يونی بستگی دارد. اين واکنش می تواند برای کنترل حلاليت پروتئين، تشديد ژله ای شدن و پايداری امولسيون و کف بکار رود۳)). اضافه کردن پلی ساکاريدها به محلول پروتئين از تجمع زياد مولکول‌های پروتئين توسط محدود کردن واکنش پروتئين – پروتئين، يا توسط حفظ گروه‌های بار دار و يا افزايش ويسکوزيته، جلوگيری می کند( ۴).

واکنش دو بيوپليمر مي‌تواند به صورت تفکيکی (بيوپليمرها يکديگر را دفع می کنند که به عنوان عدم سازگاری مطرح می شود) و يا تجمعی باشد که در اين صورت پليمرها يکديگر را جذب می‌کنند (۵).

واکنش پروتئين و پلی ساکاريد به صورتهای حلاليت همزمان، ناسازگاری، رسوب، تشکيل کمپلکس يا جداسازی فاز وجود دارد( ۶).
از نقطه نظر ترموديناميکی، پروتئين وپلی ساکاريد در محلول به صورت سازگار و يا ناسازگار وجود دارند. تحت شرايط ناسازگاری ترموديناميکی، سيستمی شامل دو فاز حاصل می شود که عمدتاً هر فاز دارای مولکول‌های متفاوت است(۴).
فاکتورهای مؤثر در ايجاد سازگاری پروتئين – پلی ساکاريد، شامل نسبت پروتئين به پلی ساکاريد، pH، قدرت يونی، ميزان کل مواد جامد، درجه حرارت، ميزان اسيدی بودن و طبيعت پليمرها ( وزن مولکولی، بار و قابليت انعطاف زنجير) می باشد( ۴).

واکنش دافعه، بين پروتئين و پلی ساکاريد غير يونی يا پلی ساکاريد آنيونی در pH بالای نقطه ايزوالکتريک پروتئين اتفاق می افتد. واکنش جاذبه غير خاص بين پروتئين وپلی ساکاريد از تشکيل پيوندهای يونی، واندوالس، هيدروژنی و… حاصل می گردد. جاذبه قوی بين پروتئين ها با بار مثبت ( pH زير نقطه ايزوالکتريک پروتئين ) و پلی ساکاريد آنيونی، مخصوصاً درقدرت يونی پايين، و جاذبه ضعيف بين پروتئين‌های خنثی يا با بار منفی (pH بالای نقطه ايزوالکتريک پروتئين) و پلی ساکاريد اتفاق می افتد (۲).
محلول آبی پروتئين وپلی ساکاريد، ممکن است در محدوده خاصی از نظر مقدار، جداسازی فاز نشان دهد. جداسازی فاز در اثر دو رفتار ثانويه توده ای شدن يا ناسازگاری ترموديناميکی صورت می‌گيرد.

ترکيب دوگانه پروتئين – پلی ساکاريد، بسته به دما، شرايط حلال و ميزان آنها می تواند توده ای شدن، ناسازگاری يا هيچ کدام را نشان دهد.
توده ای شدن شامل جداسازی خودبه‌خودی سيستم به دو فاز غنی از حلال و بدون حلال( شامل پروتئين وپلی ساکاريد) می‌باشد. اين امر توسط رسوب همزمان مخلوط پروتئين- پلی ساکاريد تحت اثر واکنش‌های جاذبه الکترواستاتيکی( غير خاص ) بين بارهای مخالف پروتئين – پلی ساکاريد انجام می‌شود (۲). توده ای شدن زماني که نيروی جاذبه بين دو بيوپليمر مختلف آنقدر قوی باشد که آنها را بهم نزديک نمايد وتشکيل کمپلکس دهد، اتفاق می افتد. چون کمپلکس حاصل دارای دانسيته متفاوتی نسبت به محيط اطراف خود می‌باشد، جداسازی در بالا يا پايين سيستم در اثر نيروی جاذبه زمين صورت می‌گيرد (۷). توده‌ای شدن در ميزان کم پلی ساکاريد اتفاق می‌افتد. چون در ميزان کم، پلی ساکاريد نمی‌تواند بطور کامل پروتئين را پوشش دهد و پلی ساکاريد ممکن است بيشتر از يک مولکول پروتئين را جذب نمايد (۸, ۵).

ناسازگاری ترموديناميکی شامل جداسازی خود به خودی سيستم به دو فاز غنی از حلال است که در يک فاز پروتئين و در ديگری پلی ساکاريد غالب است. اين پديده در اثر مخلوط نشدن محلول پروتئين و پلی ساکاريد غير‌ رقيق، تحت اثر واکنش دافعه پروتئين – پلی ساکاريد (۲) و در واقع زماني که واکنش بين بيوپليمرهای مشابه (۱BP-1BP و ۲BP- 2BP ) از نظر انرژی نسبت به واکنش بين بيوپليمرهای مختلف( ۲BP- 1BP ) مطلوب‌تر باشد، اتفاق می افتد(۷).
۲- مواد وروش ها
۲-۱ – آماده سازي نمونه

براي آماده سازي محلول از زانتان با ميزان ۰، ۰۴/۰، ۰۹/۰ و ۱۳/۰ درصد ، كاراگينان با ميزان ۰ ، ۰۳/۰، ۰۷/۰ و ۰۹/۰ درصد و ايزوله پروتئين سويا( SPI) به مقدار ۵/۶% در محلول استفاده شد. پروتئين، زانتان و كاراگينان توسط يك همزن كاسه دار مخصوص مواد پودري به مدت ۵-۷ دقيقه با دور متوسط بطور كامل مخلوط گشتند. به اين ترتيب پودري همگن و يكنواخت بدست آمد. اين پودر در تهيه محلول جهت انجام آزمايشات به كار گرفته شد.
۲-۲- آزمايشات فيزيكي و شيميايي
۲-۲-۱- تعيين ميزان حلاليت ايزوله پروتئين سويا
برای تعيين حلاليت پروتئين، از انديس حلاليت نيتروژن (NS) استفاده می شود. جهت اندازه‌گيري NS از روش برادفورد استفاده شد. با استفاده از اين روش مي توان ميزان نيتروژن در ماده را تعيين كرد.

ميزان نيتروژن در کل نمونه / ميزان نيتروژن در فازشفاف =NS
براي انجام آزمايش، پودر با آب با نسبت ۱ به ۹/۶ ( پودر به آب) توسط همزن مغناطيسي به مدت نيم ساعت مخلوط شدند و به اين ترتيب مايعي يكنواخت حاصل گشت. نمونه‌های موجود، به مدت ۱۵ دقيقه سانتريفوژ شدند( g × ۴۳۵۰). در اثر سانتريفوژ دو فاز در هر نمونه به دست آمد كه شامل مايع شفاف در بالا و رسوب در پايين بود. با تعيين نيتروژن در فاز شفاف و در کل نمونه، ميزان حلاليت پروتئين تعيين گرديد(۹).

براي اندازه گيري ميزان نيتروژن كل نمونه و ميزان نيتروژن فاز شفاف به روش براد فورد، نياز به تهيه محلول استاندارد مي باشد. محلول استاندارد غلظت هاي مختلف و مشخصي از پروتئين استاندارد آلبومين گاوی است كه جهت تهيه منحني استاندارد دستگاه اسپكتروفتومتر ( طول موج ۵۴۰ نانو‌متر) به كار مي‌رود. با استفاده از ميزان جذب محلول هاي استاندارد معادل رگرسيوني مناسب به دست آمد كه از آن براي تعيين ميزان نيتروژن فاز شفاف و كل نمونه استفاده شد.

۲-۲-۲-تعيين مقدار رسوب

حجم رسوب در تمام نمونه ها پس از گذشت زمان ۹۰ و ۱۲۰ دقيقه بر حسب ميلي ليتر محاسبه شد. براي محاسبه مقدار رسوب، ابتدا نمونه محلول مطابق آن چه در قسمت ۲-۱ توضيح داده شد، آماده گرديد. سپس نمونه‌ها در داخل مزورهاي يكسان ريخته شدند. بر حسب نوع محلول حالت هاي متفاوتي در مزور‌ها مشاهده شد. حجم رسوب تشكيل شده در قسمت پايين مزور بر حسب ميلي ليتر به عنوان حجم رسوب گزارش شد. حجم رسوب مربوط به شانزده نمونه پس از گذشت مدت زمان ۹۰ و ۱۲۰ دقيقه از شروع آزمايش خوانده شد.
۲-۲-۳- تعيين مقدار سرم

پس از گذشت مدت زماني از آماده سازي محلول، در بعضي از نمونه‌ها مايع شفافي از قسمت رسوب و كف محلول جدا مي‌شود كه تحت عنوان سرم مطرح مي‌شود. به دليل تشكيل سرم در بعضي از نمونه ها، حجم سرم پس از گذشت مدت زمان ۹۰ و ۱۲۰ دقيقه از شروع آزمايش، بر حسب ميلي ليتردر مزور‌هاي يكسان (مرحله قبل) محاسبه گرديد. سرم مايع شفافي است كه در بعضي از نمونه ها پس از گذشت مدت زماني از شروع آزمايش تشكيل مي‌گردد. پس از آماده سازي نمونه، حجم سرم پس از گذشت مدت زمان ۹۰ و ۱۲۰ دقيقه از شروع آزمايش بر حسب ميلي ليتر محاسبه گرديد.
براي بررسي نتايج از آزمايش فاكتوريل در قالب طرح كاملا تصادفي در سه تكرار(۱۶*۳) استفاده شد.
۳- نتايج و بحث
۳-۱ – اثر زانتان بر حلاليت پروتئين
با توجه به نمودار ۱ با افزايش ميزان زانتان، NS افزايش پيدا مي كند كه علت آن پيوند بين هيدروكلوئيد با پروتئين و جلوگيري از رسوب پروتئين است(۱۰).

نمودار ۱ – اثر زانتان بر درصد حلاليت نيتروژن
۳-۲- اثر زانتان بر حجم سرم
بررسي اثر زانتان (x) بر حجم سرم در دو زمان ۹۰ و ۱۲۰ دقيقه ( نمودار۲و ۳) نشان مي دهد كه اين مقدار در سطح اطمينان (p<0.01) در تمام سطوح زانتان داراي اختلاف معني داري است. نتايج نمودار ۲ و ۳ حاكي از آن است كه زانتان در كاهش حجم سرم موثر است. علت اين امرتناسب بين ميزان زانتان و پروتئين ودر نتيجه كاهش پديده توده اي شدن و ناسازگاري ترموديناميكي با افزايش مقدار زانتان مي باشد. در اين شرايط با افزايش ميزان زانتان در محلول حلاليت هم زمان پروتئين و پلي ساكاريد افزايش مي يابد. شبكه ايجاد شده توسط زانتان ذرات پروتئين سويا را نگه داشته و مانع رسوب ذرات مي‌شود
(۲, ۴,۵).

نمودار ۲ -اثر زانتان بر حجم سرم در زمان ۹۰ دقيقه

نمودار ۳- اثر زانتان بر حجم سرم در زمان ۱۲۰ دقيقه

۳-۳- بررسي اثر صمغ زانتان بر حجم رسوب
نتايج آناليز واريانس گوياي معني دار بودن تاثير زانتان (x) بر حجم رسوب در سطح اطمينان يك در صد(p<0.01) مي باشد. مطابق نمودار۴ و ۵ در سطح چهارم زانتان علت افزايش رسوب، وجود مقدار زيادي مايع همراه رسوب است كه اين حالت به عنوان رسوب مايع مطرح است (۴) و در واقع رسوب جامد مانند ساير نمونه ها وجود ندارد. معرفي اين حالت تنها به منظور بيان جداسازي فاز در نمونه ‌صورت گرفت ( اين حالت در زمان ۹۰ و ۱۲۰ دقيقه براي نمونه حاوي سطح چهارم زانتان و سطح دوم كاراگينان اتفاق افتاد). در سطح سوم زانتان، افزايشي در حجم رسوب مشاهده شد كه احتمالا به دليل جداسازي فاز (ناسازگاري ترموديناميكي) مي باشد(۲, ۷ ).

نمودار ۴ – اثرزانتان بر حجم رسوب در زمان ۹۰ دقيقه

نمودار ۵- اثر زانتان بر حجم رسوب در زمان ۱۲۰ دقيقه

۳-۴- اثر كاراجينان بر حلاليت پروتئين
با توجه به نمودار ۶ با افزايش ميزان كاراجينان، NS( سطح دوم نسبت به سطح اول) افزايش پيدا مي‌كند كه علت آن باند شدن هيدروكلوئيد با پروتئين و جلوگيري از رسوب پروتئين است( ۱۱ ، ۵).

نمودار۶ – اثر كاراجينان بر درصد حلاليت نيتروژن
۳-۵- اثر كاراجينان بر حجم سرم
نتايج آناليز واريانس نشان دهنده معني دار بودن تاثير كاراجينان (c) بر حجم سرم در سطح اطمينان يك درصد ( p< 0.01 ) مي باشد. همانگونه كه در نمودار ۷ و ۸ مشاهده مي شود، با افزايش ميزان كاراجينان حجم سرم كم مي شود كه اين امر به دليل جذب بيشتر آب آزاد در مقادير بالاتر صمغ كاراجينان است. در نمودار۷، سطوح دوم، سوم و چهارم كاراجينان داراي اختلاف معني دار در سطح ۱% مي باشند. سطح اول و دوم اختلاف معني داري ندارند. با وجود افزايش ميزان صمغ در سطح دوم نسبت به سطح اول،‌ ميزان سرم كاهش نيافته است كه اين امر احتمالا به دليل واكنش جداسازي فاز است. در اين حالت مقدار صمغ به قدري كم است كه پلي ساكاريد بيشتر از يك مولكول پروتئين را جذب مي كند و توده پروتئين از قسمت مايع جدا مي شود(۴).
در نمودار ۸ ( زمان ۱۲۰ دقيقه) سطح اول و دوم كاراجينان نيز داري اختلاف معني دار در سطح اطمينان يك درصد( p< 0.01 ) مي باشند زيرا زمان در شروع جداسازي فاز موثر است(۸)و نيز براي ايجاد اتصال و پيوند بين هيدروكلوئيدها و پروتئين، نياز به گذشت زمان است(۲ ۱۲,)

نمودار۷- اثر كاراجينان بر حجم سرم در زمان ۹۰ دقيقه

نمودار ۸ – اثر كارجينان بر حجم سرم در زمان ۱۲۰ دقيقه

۳-۶- بررسي اثر صمغ كاراجينان بر حجم رسوب
مطابق نمودار ۹ و۱۰ در زمان ۹۰ و۱۲۰ دقيقه، حجم رسوب با افزايش ميزان كاراجينان(c) تقريبا كاهش مي‌يابد كه اين اختلاف در اكثر سطوح كاراجينان معني دار(p< 0.01) است. كاهش ميزان رسوب با افزايش مقدار كاراجينان، به علت توانايي اتصال اين صمغ با مقدار كمي از پروتئين مي‌باشد. در اين شرايط، پروتئين‌هاي پيوند شده خواص سطحي معمول خود را از دست داده و خواص سطحي هيدروكلوئيد را مي پذيرند و به اين ترتيب ميل تركيبي آنها با فاز پيوسته ( آّب) افزايش مي يابد( ۱۱، ۵). علت افزايش رسوب در سطح دوم كاراجينان وجود مقدار زيادي مايع همراه رسوب مي باشد كه اين حالت در زمان ۹۰ و ۱۲۰ دقيقه براي نمونه حاوي سطح چهارم زانتان و سطح دوم كاراجينان مشاهده شد. حجم واقعي رسوب درسطح دوم كاراجينان بدون در نظر گرفتن مايع در آزمايش‌هاي انجام شده، كمتر از حجم رسوب سطح اول كاراجينان مي باشد. عدد خوانده شده با احتساب مقدار زيادي مايع همراه رسوب مي‌باشد.

نمودار۹- اثر كاراجينان بر حجم رسوب در زمان ۹۰ دقيقه

نمودار۱۰- اثر كاراجينان بر حجم رسوب در زمان ۱۲۰ دقيقه
۳-۷- بررسي اثر متقابل صمغ زانتان و كاراجينان بر ضريب حلاليت نيتروژن(NS)
با توجه به نمودار ۱۱، بررسي اثر متقابل صمغ زانتان(x) و كاراجينان (c) بر ضريب حلاليت نيتروژن نشان مي دهد كه اختلاف در تمام سطوح زانتان وكاراجينان به لحاظ آماري معني دار (p<0.01) است وتقريبا با افزايش ميزان زانتانو كاراجينان افزايش مي يابد. اين حالت به دليل تشكيل شبكه بين دو هيدروكلوئيد و اتصال با پروتئين است. در مواردي كه با افزايش ميزان پلي ساكاريد حلاليت كاهش پيدا كرده، به علت نامتناسب بودن نسبت صمغ به پروتئين است كه سبب توده اي شدن پروتئين مي‌شود (Nishinari and Doi, 1994).

نمودار ۱۱- اثر متقابل زانتان و كاراجينان بر درصد حلاليت نيتروژن

۳-۸- بررسي اثرمتقابل صمغ زانتان و كاراجينان بر حجم سرم
نتايج نمودارهاي ۱۲ و۱۳ حاكي ازآن است كه اثرمتقابل زانتان و كاراجينان بر حجم سرم در اكثر سطوح اختلاف معني دار در سطح يك درصد (p<0.01) دارند.
با افزايش همزمان مقادير زانتان و كاراجينان، حجم سرم كاهش پيدا مي‌كند كه اين امر به دليل تشكيل شبكه بين دو هيدروكلوئيد و به تله انداختن آب آزاد بيشتر مي باشد (۱۳). افزايش حجم سرم در نمونه داراي (x = 0 % و c = 03/0%)، (x = 0 % و c = 07/0%)، (x =04/0 % و c = 09/0%)، (x = 09/0 % و c = 07/0%) و (x =13/0 % و c = 03/0%) به علت وقوع پديده جداسازي فاز و نا متناسب بودن نسبت مقدار صمغ به پروتئين مي باشد (۲, ۴, ۵).
اختلاف حجم بين دو زمان ۹۰ و ۱۲۰ دقيقه به دليل آن است كه جداسازي فاز به زمان وابسته بوده و ازطرفي، گذشت زمان جهت برقراري پيوند بين هيدروكلوئيدها و پروتئين الزامي مي باشد (۲ ۱۲,).