بررسي ايمني زايي ژنهاي L7/L12 و P39 در موشهاي Balac

هدف از اين تحقيق بررسي ايمني زايي ژنهاي L7/L12 و P39 در موشهاي Balac است. بنابراين پس از جداسازي و تكثير ژنهاي فوق مراحل زير در اين تحقيق انجام گرفت.
۱- لكون نمودن ژنهاي فوق در يك ناقل انتقال دهنده Cleaning vector
2- تعيين ترادف نوكلئوتيدي ژنهاي جداشده و مقايسه آن با ژنهاي L7/L12

۳- كلون نمودن ژنها در پلاسميد بيان كننده پروكاريوني Procaryotic expression vector
4- توليد و تخليص پروتئينهاي L7/L12 و P39
5- كلون نمودن آنها در پلاسميد بيان كننده اوكاريوتي Eucaryotic expression vector
6- هاري كردن پلاسميدهاي فوق از آندوتوكسين

۷- تزريق پلاسميدها، بسويه واكنش و سويه بيماريزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C
8- سنجشهاي ايمونولوژيك

باكتريها و پلاسميدهايي كه براي انجام اين پايان نامه استفاده دشه اند بترتيب زير مي باشند:
باكتريها: بروسلاآبورتوس سويه هاي ۱۹S و ۵۴۴ اشديشيالكي سويه
اشريشيالكي سويه BL21 – اشريشياكي سويه BL21(DE3(Plyss

پلاسميرها: PGEX4T1 – PRT 28a – SK+(pSK) – Pblue Script-PCDNA3
– جداسازي كروموزوم بروسلا آبورتوس ۱۹S:
براي تكثير ج داسازي ژنهاي L7/L12 و P39 ابتدا كروموزوم باكتري جداسازي گرديد.
مواد:
بافر TE:

Tris – Hel 10mm
EDTA 1.0mm
‍PH بافر را پس از تهيه برروي ۸ تنظيم مي نمائيم.
پروتئيناز K:

CTAB/NaCl:
Nacl 4.1gr

CTAB 10gr
DDW 100ml (Final Volume)
روش:

ابتدا محيط برنسط برات را تهيه و استريل نموده و ml5 از محيط را با بروسط آبورتوس سويه ۱۹S تلقيح مي نمائيم. پس ۴۸ تا ۷۲ ساعت باكتريها رشد كرده و كدورت مناسبي را پيدا مي كند. بقيه مراحل تخليص كروموزوم بشرح زير است:

۱- ۵/۱ ميلي ليتر از سوسپاستيون فوق را مدت ۲ دقيقه در rpm5000 سانتريفوژ مي نمائيم. محلول رويي را دور مي ريزيم.
۲- Ml576 از بافر TE را بر روي رسوب باكتري اضافه كرده و رسوب را در بافر حل مي نمائيم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئيناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت يكساعت در دماي ۰C37 نگهداري مي نمائيم.

۳- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بميزان Ml80 اضافه كرده و بمدت ۱۰ دققيق در ۰C65 انكوبه مي كنيم.
۴- هم حجم مخلوط بالا از تركيب كلروفرم – ايزوآميل (۱/۲۴) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت ۵ دقيقه در rpm10000 سانترفوژ مي كنيم. محلول رويي را به لوله ديگر منتقل مي نمائيم.

۵- هم حجم محلول روئي ترميب فنل – كلروفرم – ايزوآميل (۱/۲۴/۲۵) پس از مخلوط بمدت ۵ دقيقه در vpr10000 سانتريفوژ كرده و محلول رويي به لوله ديگري منتقل مي نمائيم.
۶- هم حجم محلول روئي ايزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط مي كنيم. پس از چند دقيقه DNA كروموزومي ته نشين شده كه مي توان بات يك پيپت پاستور آنرا جمع آوري نمائيم.
۷- رسوب DNA كروموزومي را با الكل ۷۰% شستشو داده و پس از خشك شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل مي نمائيم.
بررسي كمي و كيفي DNA كروموزومي:

براي تعيين خلوط كروموزوم باكتري از مواد و وسايل زير استفاده ميشود.

۱- بافر PBE pH=8(10X)
Tris – base 890mM
Boric Acid 890mM
EDTA 25mM
2- آگارز MP
3- تانك الكتروفورز افقي
روش:
ابتدا آگارز MP در بافر TBE(0.5x) را بكمك حرارت حل كرده و ژل آگارز افقي را سيني مخصوص تانك الكتروفورز افقي تهيه مي نمائيم. سپس به مقدار Ml5 از DNA كروموزومي را در چلهك ژل ساخته شده ريخته و در تانك الكتروفورز حاوي بافر TBE(0.5x) پس از برقراري جريان الكتريكي مستقيم الكتروفورز مي كنيم.
بريا تعيين مقدار DNA نيز پس از تهيه رقت تز كروموزوم DD آنرا در (Optimal Density) طول موج ۲۶۰ نانومتر اندازه گيري مي نمائيم. مقدار DNA بر اساس فرمول:عكس رقت ۵۰ DD قرائت شده = مقدار DNA تعيين مي گردد.

– مرحله پس از جداسازي كروموزوم تكثير و جداسازي ژنهاي مورد نظر است. اين فرآيند با استفاده از دستگاه PCR انجام مي گردد. در دستگاه PCR با استفاده از عوامل پايه اي، ژن مورد نظر را مي توان با استفاده از آنزيم تك پلي مرآز Tag Polymerase تكثير نمود. عوامل پايه اي ذكر شده شامل موارد ذيل است.
۱- قالب

۲- پرايمر جلو Forward
3- پرايمر عقب Revers

۴- دروكسي نوكلئوتيدها LNTP
5- منيزيوم
۶- بافر
۷- آنزيم پلي مرآز
۸- آب مقطر استريل

براي تهيه پرايمرها ابتدا بايد آنها را طراحي كرد. براي طراحي پرايمرهاي ژن L7/L12 و P39 ابتدا مترادف نوكلئوتيدي ژنهاي فوق را از مركز اطلاعاتي NCBI بدست مي آوريم.
accession No(L7/L12). L27819
accession No(P39). L35038

سپس بر اين اساس و درنظر گرفتن نكات استاندارد طراحي پرايمر از جمله طول پرايمر، دماي اتصال G+C%، توليد پرايمر، توليد لوپ يا حلقه و … ترادف پرايمرهاي تعيين ميگردد. در اين مرحله از آناليزهاي كامپيوتري توسط برنامه Dlogo و Blast استفاده ميگردد.
ترادف ژن مورد نظر و پرايمرهاي Forward و Reverse براي جداسازي ژنهاي فوق از باكتري بروسلا به شرح زير است:
۱- پرايمرهاي L7/L12
Forward:

 

۵’ GGA AAT GCT GAT CTC GCA AA3’
Revers:
5’ CCA CTT GAG TTC AAC XTT GGC CA3’
۲- پرايمرهاي P39
Forward:
5’ GCC GGC GCC TGT TGC CAA 3’
Reverse:
5’ C CGC TTT TGC GGC TTC AA 3’
جهت سهولت مراحل كلونينگ و با توجه به محلهاي ممكن براي كلون سازي در پلاسميدهاي حد واسط و پلاسميدهاي بياني دو جايگاه آنزيمي BamHI و XhoI درابتدا و انتهاي پرايمر طراحي شده است. پرايمرهاي طراحي شده توسط شركت MWG آلمان ساخته شد.
براي انجام PCR از دستگاه TECHNE(Cambridge) مدل BENIUS استفاده شده است. براي بهينه سازي تكثير ژنهاي ذكر شده غلظتهاي مختلف يون منيزيم (از ۵/۱ تا ۵/۳ ميلي مولار) و دماهاي مختلف مناسب براي اتصال پرايمرها با DNA كروموزومي (۶۶-۶۳ درجه سانتيگراد) بكار رفته است.
– تائيد ژنوم سنتز شده توسط PCR:

براي تاييد صحت قطعه ژنوم بدست آمده از PCR از هضم آنزيمي ژنهاي فوق استفاده مي گردد. چنانچه از هضم آنزيمي ژن L7/L12 با آنزيمهاي EC0RI و Hind III بترتيب قطعات (۱۶۸+۲۰۶) و (۳۰۵+۶۹) بايد ديده شود و از هضم آنزيمي ژن P39 با آنزيمهاي NEOL و Hind III بترتيب قطعات (۱۳۶+۵۶۰+۷۰۹) و (۵۵۳+۶۵۲) بايد ديده شود.
براي تاييد نهايي صحت ژنهاي تكثير شده از نظر ماهيت و ترادف نوكلئوتيدي آنها، اين ژنها ابتدا در ناقل pSK+ كلون گرديد و سپس براي تعيين سكانس به شركت مربوط ارسال گرديد.
– كلونينگ ژنهاي L7/L12 و P39 در كلونينگ pSK+:

براي كلونينگ ژنهاي فوق ابتدا بايد ژنها تحت اثر آنزيمهاي BamHI و xhoI قرارگرفته، سپس ناقل پلاسميدي pSK نيز با آنزيمهاي اخير برش داده شود.
۱- برش آنزيمي ژنهاي L7/L12 و P39 با آنزيمهاي BamHI و xhoI.

۲- برش آنزيمي پلاسميد pSK با آنزيمهاي BamHI و xhoI پلاسميد pSK در حدود kb96/2 وزن دارد. اين پلاسميد داراي يك ناحيه تكثيري ColE1، يك ناحيه مقاومت به آمپي سيلين تحريك ناحيه f1 origin و يك ناحيه بنام multiple cloning site=MCS كه جايگاه تعدادي از آنزيمهاي تحديدي را در خود دارد. براي تكثيز پلاسميد فوق از باكتري اشديشياكلي استفاده مي گردد.

۳- براي برش آنزيمي اين پلاسميد ابتدا باكتري حاوي اين پلاسميد را تكثير ميدهد. در ضمن تكثير باكتري پلاسميد مورد نظر در باكتري همانندسازي كرده و تعداد آن افزايش مي يابد. براي تكثير باكتري از كشت آن در ml2 محيط LB حاوي ng/ml50 آنتي بيوتيك آمپي سيلين استفاده مي شود. پس از ۱۸ ساعت كشت مورد نظر كدورت مناسب را پيدا ميكند. پس از آن پلاسميد از باكتري تخليص ميگردد.
مواد:

۱- SET buffer:
Sucrose 50mM
EDTA 10mM
Tris-Hcl pH 8 15mM
2- بافر ليزكننده:
Lysis Buffer (1ml)
Na OH (2N) 100ml
SDS (10%) 100ml
DDW 800ml
3- استات پتاسيم ۵ مولار با pH 4.2
Potassiun Acetate 5M for 100ml
KAC (4M) 60ml
Acetic Acid 11.5ml
DDW 28.5ml
روش:

ابتدا ۵/۱ ميلي ليتر از كشت ۱۸ ساعت باكتري را با استفاده از سانتريفوژ با دور rpm4000 بمدت ۵ دقيقه رسوب ميدهيم. سپس رسوب بدست آمده را در ۱۰۰ml از SET buffer كاملاً حل كرده بمدت ۵ دقيقه در حرارت اتاق قرار مي دهيم. پس از مدت فوق ml200 از محلول ليز بافر تازه تهيه شده را در رسوب سوسپانسيون فوق ريخته، بخوبي مخلوط كرده و بمدت ۲ دقيقه در يخ قرار ميدهيم. سپي ml150 از محلول KAC بر نخلوط فوق ريخته پس از مخلوط نمودن مجدداً بمدت ۵ دقيقه در يخ ميگذاريم.

جهت تفكيك پروتئينهاي آزادشده سلولي از DNA پلاسميد ml450 از تركيب فنل-كلروفرم – ايزوآميل الكل (۱/۲۴/۲۵) بر سوسپانسيون حاوي باكتريهاي ليز شده افزوده و بمدت ۵ دقيقه با دور rpm10000 سناتريفوژ مي نمائيم. محلول رويي را در لوله ديگر ريخته و به آن يك ميلي ليتر اتانل مطلق سرد مي افزرائيم. سپس با استفاده از سانتريفوژ با دور rpm1000 بمدت ۵ دقيقه DNA پلاسميدي را رسوب ميدهيم. DNA رسوب داده را با الكل ۷۰% شستشو ميدهيم. پس از خشك شدن رسوب در مجاورت هوا، در ml20 از بافر TE حل نموده و به آن ئم۵ از آنزيم Rnase A(5mg/ml) براي حذف RNA موجود اضافه مي كنيم و بمدت نيم ساعت در ۰c37 قرار ميدهيم. براي نگهداري پلاسميد از ۰c20- استفاده ميشود.

پس از تلخيص، پلاسميد از نظر كيفي و كمي سنجيده ميشود. براي اين منظور از روشي كه قبلاً در مورد كروموزوم باكتري توضيح داده شد، استفاده ميگردد.
– هضم آنزمي پلاسميد sPK:
پس از تعيين غلظت پلاسميدهاي خالص شده هضم آنزيمي آن با استفاده از آنزيمهاي BamHI و xhoI صورت ميگيرد.
pSK 5ml(10ng)
BamHI 1ml

xhoI 1ml
Baffer (y Lango) 2ml

DDW 21ml
Tota l 30ml
پس از مدت ۲ ساعت انكوباسيون در دماي ۰c37 براي اطمينان از غلظت و كيفيت نمونه هضم شده آنرا برروي ژل آگارز ۸/۰% بررسي مي نمائيم.
– هضم آنزيمي ژنهاي L7/L12 و P39:
ژنهاي فوق را نيز نظير پلاميد pSK تحت اثر آنزيمهاي BamHI و xhoI قرار مي دهيم.
L7/L12 10ml P39 10ml
BamHI 1ml BamHI 1ml
xhoI 1ml xhoI 1ml

Baffer 2ml Baffer 2ml
DDW 21 DDW 21
total 30 total 30
– اتصال ژنهاي L7/L12 و P39 با پلاسميد (Ligation preparation) PSK براي اتصال قطعات ژني با پلاسميد PSK از آنزيم T4 DNA Ligale استفاده مي شود.
L7/L12 10ml P39 10ml
PSK 2ml PSK 2ml
T4 DNA ligale 1ml T4DNA ligale 1ml
Baffer 1.5ml Baffer 1.5ml
DDW 0.5ml DDW 0.5ml
total 15ml total 15ml

مخلوط فوق را بمدت ۱۶ ساعت در ۰c14 قرار ميدهيم.
– انتقال DNA نوتركيب به ميزبان) E0ch (HHI
– براي انتقال DNA نوتركيب به سلولهاي ميزبان ) E0ch (HHI ابتدا بايد سلولهاي ميزبانهاي مورد نظر و آماده پذيرش DNA نوتكريب بنمائيم. Competent cell براي تهيه اين سلولها از وش زير استفاده مي گردد.
مواد:
محيط SOB
SOB for 100ml
0.5% yeast extract
2% trypton
10mm Nacl
2.5mm Kcl
10mm Mgcl2
10mm MgSo4
پس از تنظيم pH برروي ۷-۷٫۲ تنظيم كرده و پس از آن اتوكلاو مي كنيم.
بافر TFBI
TFBI (for 100ml)
KAC 30mm
MnCl2.4H2O 50mm
Kcl 100mm
Cacl2.2H2O 10mm
Glycerol 15ml
H2O Complete to 100ml
PH را برروي ۸/۵ تنظيم كرده و پس از آن با اتوكلاو استريل مي نمائيم.
بافر TFBII
TFB II (for 100ml)
MOPS 10mm
Cacl2.2H2O 75mm
KCL 10mm
Glycerol 15ml
H2O Complete to 100ml
پس از مخلوط نمودن آنرا با اتوكلاو استريل مي كنيم.
روش تهيه Competent Cell
100 ميلي ليتر از محيط SOB را در يك ارلن يك ليتري تهيه كرده و اتوكلاو مي نمائيم. به محيط فوق ۱ ميلي ليتر از كشت ۱۸ ساعت
) E.col.(DH5را تلقيح مي نمائيم. ارلن را برروي شبكه قرار داده و با دور rpm200 در دماي ۰C37 قرار داده تا OD550nm به حدود ۵/۰ برسد. ارلن محتوي باكتري را بمدت نيم ساعت در يخ قرار داده و پس از آن بندت ۱۰ دقيقه در دماي ۰C4 در rpm1800 سانتريفوژ مي كنيم. برروي رسوب بدست آمده ۲۰ /ميلي ليتر بافر TFB I اضافه كرده و به آرامي رسوب را در بافر حل نموده و بمدت ۱۰ دقيقه در يخ مي گذاريم. سوسپانسيون فوق را بمدت ۱۰ دقيقه در ۰C4 با دور rpm1800 سانتريفوژ كرده و به رسوب بدست‌آمده ۲ ميلي ليتر بافر FTB II افزوده بمدت ۱۵ دقيقه در يخ قرار مي دهيم. پس از اين مدت ml100 از سوسپانسيون باكتري را در ايندرف ۵/۱ ريخته و آنرا در ۰C70 نگهداري مي نمائيم.
ترانسفورماسيون
مواد لازم:
– سلولهاي Competent
– پلاسميد DNA نوتركيبي
– محيط كشت مايع نوترين برات
– پليت حاوي محيط كشت نوترين آگار به همراه آمپي سيلين
– گرمخانه ۰C37
روش كار:
۱- سلولهاي Comptent باكتري ) E.coli.(DH5 را از ۰C70- بيرون آورده روي يخ قرار مي دهيم تا باز شود.
۲- مقدار ml10 از مخلوط پلاسميد نوتركيب شده در مرحله قبل، را به سلولهاي Competent مي افزائيم.
۳- نمونه فوق را بمدت ۳۰ دقيقه در يخ قرار ميدهيم.
۴- پس از زمان فوق اپندرف حاوي نمونه را بلافاصله در گرمخانه ۰C37 بمدت ۵ دقيقه قرار ميدهيم.
۵- مجدداً نمونه ها را بمدت ۲ دقيقه در يخ قرار ميدهيم.
۶- مقدار ml800 محيط كشت نوترين برات به نمونه فوق اضافه كرده و بمدت يكساعت در ۰C37 انكوبه مب كنيم.
۷- پس از انكوباسيون، سوسپانسيون فوق را به پليتهاي حاوي نوترين آگار (محتوي Ng/cl60 آمپي سيلين) منتقل كرده و پليتها را ۱۸ ساعت در گرمخانه ۰C37 قرار مي دهيم.