چکیده:
کفال ماهیان دریای خزر یکی از مهمترین ماهیان شیلا تی این دریا می باشند که امروزه اکثریت صید ماهیان دریای مذکور به خود اختصاص داده اند.: هدف از این تحقیق بررسی میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی در شرایط زمانی، دمایی و تداوم بخش های مختلف بوده است.: بدین منظور میزان ATP اسپرم های:

۱) نمونه های تازه در دماهای مختلف ۱۰-۱۲ درجه و ۱۸-۲۰ درجه سانتی گراد،
۲) نمونه های نگهداری شده در دماهای مختلف۴ (درجه و دمای اتاق) به مدت شش ساعت،
۳) نمونه های نگهداری شده در ( تداوم بخش های مختلف ( گلیسرول، محلول نمک ۷/۰ %، محلول نمک ۶۵/۰%) به مدت ۵ و ۱۰ روز، به روش فوق حساس بیو- لومینوسانس اندازه گیری گردید.
بر اساس آزمایش هاي انجام شده در این تحقیق غلظت ATP اسپرم های تازه نمونه گیری شده در دمای ۱۰ تا ۱۲ درجه سانتیگراد ۲۲/۷ ±۰۴/۷۴% غلظت ATP اسپرم های تازه نمونه گیری شده در دمای ۱۸ تا ۲۰ درجه بود. اسپرم های نگهداری شده در دمای ۴ درجه و دمای آزمایشگاه به مدت ۶ ساعت به ترتیب ۹۱/۰ ±۲۶/۹۰% و ۴۹/۱ ±۱۷/۱۷% ATP خود را حفظ کردند.

نگهداری اسپرم در تداوم بخش های مختلف( گلیسرول، محلول نمک ۷/۰ %، محلول نمک ۶۵/۰% ) به مدت ۵ روز نشان داد که گلیسرول و محلول نمک ۶۵/۰% درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک ۷/۰% حفظ کردند و نگهداری اسپرم در همان تداوم بخش ها به مدت ۱۰ روز نشان داد که گلیسرول درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک ۷/۰% و ۶۵/۰% حفظ کرد.
براساس نتايج بدست آمده براي حفظ ميزان ATP اسپرم ماهي كفال طلايي نمونه گيري در دماي ۱۸-۲۰ درجه و نگهداري در گليسرول توصيه مي شود.

واژگان کلیدی: اسپرم، ماهی کفال طلایی، ATP،

مقدمه:
اسپرم به عنوان یک عامل مهم تولید مثل، بقاء و تداوم نسل است. بررسی اسپرم از نظر پارامترهایی چون توانایی تلقیح، تحرک، درصد اسپرم های متحرک، سرعت حرکت، فرکانس ضربه تاژکی، میزان ATP و فاکتورهای شیمیایی و بیو شیمیایی، در تشخیص کیفیت اسپرم و کنترل روند تولید مثلی موجودات زنده از جمله آبزیان به ما کمک می کند. به همین علت تاکنون تحقیقات

 

گسترده ایی توسط پژوهشگران مختلف روی این سلول صورت گرفته است. با این حال مطالعات انجام شده در ارتباط با میزان ATP اسپرم ماهیان نسبتا کم است. این امر تفسیر علت ناموفق بودن پروژه های پرورشی کردن برخی ماهیان را دشوار می کند. در این رابطه باید مطالعات بیشتری در زمینه بررسی میزان ATP اسپرم ماهیان صورت پذیرد. اسپرم به کمک حرکت ضربه ایی تاژک خود شنا می کند. انرژی مورد نیاز برای این حرکت از طریق هیدرولیزATP فراهم می شود.(۱).تحرک اسپرم به میزان ATP ذخیره ایی اولیه(۲) و میزان ATP سنتز شده در طول فاز تحرک (۳) وابسته است. در اکثر ماهیانی که دارای لقاح خارجی هستند،ATP سنتاز قادر به نگهداری نسبت های بالای ATP هیدرولیز شده مورد نیاز در طول حرکت نیست لذا میزان ATP به سرعت کاهش می یابد. این کاهش ATP به موازات کاهش تعداد ضربات تاژکی و سرعت حرکت اسپرم است(۲). يك رابطه خطي بين ظرفيت تلقيح اسپرم و پارامترهاي اسپرمي از جمله ميزان ATP و

سرعت حركت اسپرم وجود دارد(۴) آنزيم اصلي تبديل انرژي شيميايي گراديان پروتون در سيستم بيولوژيكي ، ATP سنتتاز است. اين آنزيم براي سنتز ATP از ADP و فسفات غيرآلي استفاده مي كند ساختمان و عملكرد اين آنزيم در گونه هاي مختلف يكسان است (۵) تفاوت قابل توجهی بین گونه ها در مقدار ATPمورد نیاز برای تامین حرکت اسپرم وجود دارد(۶). تحقیقی در رابطه با میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی تاکنون صورت نگرفته است. در این پروژه سعی بر آن داشتیم که میزانATP اسپرم ماهی کفال طلایی را در شرایط مختلف اندازه گیری نماییم.
مواد و روشها:
به منظور بيان ميزان ATP برحسب تعداد سلول ، تعداد اسپرم هاي موجود در يك ميلي ليتر از مايع اسپرم اخذ شده از ۱۰ ماهي نر كفال طلايي ، به كمك لام نئوبار و ميكروسكوپ نوري (NIKON Y100) مورد شمارش قرار گرفت. در اين تحقيق جهت بررسي تاثير دماي نمونه گيري و ميزان ATP اسپرم ماهي ، نمونه گيري در دو دماي ◦C 10-12 و۱۸-۲۰ ◦C انجام شد . ما در این تحقیق برای

اندازه گیری میزان ATP از روش بیولومینوسانس استفاده کردیم بدین شکل که نمونه اسپرم را به نسبت ۱۰۰/۱ در محلول بافر HEPES جوشان مخلوط کرده سپس ۵۰ از آن را با ۵۰ از محلول کیت حساس بیولومینو سانس (Biaffin) در پلیت مخصوص اندازه گیری لومینوسانس با هم مخلوط کرده و سینگالهای لومینوسانس را با استفاده از دستگاه لومینومتر

۱۰-۱۹ mol/well, Germany) × (Lumistar ,BMG labtech GmbH, 5اندازه گیری کرده و سپس میزان ATP هرنمونه را با استفاده از استانداردهای ATP محاسبه کرده و بصورت nmol/108 اسپرم بیان کردیم.
درجه حرارت نگهداري اسپرم ها بر ميزان ATP سلول هاي مذكور تاثيرگذار خواهد بود. لذا جهت بررسي دماي مناسب نگهداري ، اسپرم ها به مدت ۶ ساعت در دماي ۴ درجه و دماي آزمايشگاه نگهداري و سپس ميزان ATP آن ها مورد اندازه گيري قرار گرفت. معمولا براي نگهداري اسپرم از

محلول هاي تداوم بخشExtenders )) استفاده مي كنند اين محلول ها سبب تداوم و حفظ فعاليت اسپرم ها در دوره نگهداري مي شوند. به منظور بررسي بهترين محلول تداوم بخش ، محلول گليسرول ۱۰ درصد و گلوكز ۰٫۳ مولار ، محلول نمك ۰٫۷ درصد و محلول نمك ۰٫۶۵ درصد مورد بررسي قرار گرفتند . ميزان ATP اسپرم ها در محلول هاي مذكور پس از نگهداري اسپرم در دماي منفي ۱۵ درجه در زمان هاي ۵ و ۱۰ روز مورد سنجش قرار گرفت.

جهت انجام تحقیق در روز دهم آبان ۱۳۸۴از دریاچه خزر که دمای آب آن ۱۸ تا ۲۰◦C و شوری آن ۱۲ تا ۱۳ ppm بود و همچنین در روز ۱۷ آبان ۱۳۸۴ در پی کولاک و کاهش چشمگیردمای هوا از دریاچه خزرکه دمای آب آن ۱۰ تا ۱۲ ◦C و شوری آن ۱۲ تا ppm 13
بود تعدادی ماهی کفال طلایی صید کرده و پس از تعیین جنسیت، نمونه های نری را که هنوز اسپرم ریزی نکرده بودند انتخاب نموده و از بین آنها از ۱۰ ماهی نر با طول تقریبی۲۵ تا ۳۰cm و وزن ۹۰۰ تا ۱۱۰۰g نمونه گیری شد. بعد از نمونه گیری ، بلافاصله درب لوله های آزمایش توسط نوار پارافیلم محکم بسته شده و در جعبه یخ ۴ ◦C به آزمایشگاه منتقل شدند. در واقع اسمولالیته پائین ادرار با تحریک اولیه موجب کاهش اولیه ذخیره ATP سلولی و کاهش کیفیت اسپرم کپور می شود. لذا ما برای ممانعت از کاهش کیفیت اسپرم، در طول نمونه گیری از آلوده شدن اسپرم به ادرار و هر گونه ماده آلوده کننده ای جلوگیری کردیم.
به منظور بررسی میزان ATP نمونه اسپرم نگهداری شده در شرایط آزمایشگاه و دمای ۴ ◦C به مدت ۶ ساعت، مقداری از نمونه اسپرم هر ماهی که در دمای ۱۰ تا ◦C 12 نمونه گیری شده ، در شرایط آزمایشگاه (۲۲ ◦C) و مقداری در دمای ◦C 4 نگهداری شد. همچنین به منظور بررسی میزان ATP

نمونه اسپرم نگهداری شده در سرما در تداوم بخش های مختلف (محلول گلیسرول ۱۰% و گلوکز ۳/۰ مولار، محلول نمک ۷/۰% ، محلول نمک ۶۵/۰% ) بعد از ۵ و ۱۰ روز ، یک حجم از اسپرم را با سه حجم از محلول تداوم بخش به آرامی مخلوط نموده و نمونه های اسپرم مخلوط شده با گلیسرول و محلول نمک ۶۵/۰% در دمای -۱۵ ◦C و نمونه های مخلوط شده با محلول نمک ۷/۰% در دمای ۱◦C بالای یخچال نگهداری شد.
برای بررسی میزان ATP نمونه اسپرم های تاز

ه نمونه گیری شده (در دمای ۱۸ تا ◦C 20 و ۱۰ تا ◦C 12 آب دریا) و نگهداری شده (در دمای آزمایشگاه (۲۲◦C) و◦C 4)، ابتدا باید نمونه اسپرم هرماهی را به نسبت ۱:۱۰۰درمحلول بافر HEPES(pH=7.7, EDTA 2 mM , ( 25 mM HEPES , 10 mM Magnesium Chloride در میکرو ویال رقیق کرد. سپس میکرو ویال را در حمام آب جوش ◦C 100قرار داده تا در اثر حرارت، محتوی میکرو ویال شروع به جوشیدن کند. پس از کمی جوشیدن محتوی میکرو ویال، آنرا خارج کرده ، که در حقیقت در اثر این حرارت غشاء سلول اسپرم تجزیه شده و ATP سلول آزاد میشود(۸). درمرحله بعد به ۵۰ از محلول کیت حساس بیو لومینوسانس ( كيت شامل دو محلول و دو پودر جامد مي باشد كه محلول هاي آن شامل لوسيفراز وبافر است سپس پودرهاي جامد كه شامل دي

تيوتريتيول (DTT)و لوسيفرین مي باشد را طبق دستور بروشور كيت باهم مخلوط كرده و يك مخلوط نهايي به دست مي آيد كه براي انجام آزمايش مي بايست ۵۰ ميكروليتر از اين مخلوط نهايي با ۵۰ ميكرو ليتر از محلول مورد اندازه گيري باهم در پليت اندازه گيري لومينوسانس مخلوط كرد. كيت حساس بيولومينوسانس ساخت شركت Biaffin آلمان مي باشد). سیگنالهای لومینوسانس در دمای اتاق به کمک دستگاه لومینومتر بعد از ۱۰ دقیقه اندازه گیری شدند.و افزایش این زمان به بیش از ۳۰ دقیقه سبب كاهش سیگنال و عدم اعتبار منحنی استاندارد خواهد شد. سپس پلیت را وارد دستگاه لومینومتر کرده تا سیگنالهای لومینوسانس را اندازه گیری نماید. در مرحله بعد سیگنالهای لومینوسانس را بر اساس استانداردهای ATP به صورت nM ATP درآورده و در نهایت غلظتATP هر نمونه اسپرم ماهی را بصورت nM ATP به ازای ۱۰۸ اسپرم بیان کردیم.

به منظور بررسی میزانATP نمونه اسپرم نگهداری شده در سرما و تداوم بخش های مختلف بعد از ۵ و۱۰ روز، ابتدا نمونه های منجمد شده در دمای ) -۱۵ ◦C (نمونه نگهداری شده در گلیسرول و محلول نمک ( ۶۵/۰% از فریزر خارج کرده و به مدت ۳۰ ثانیه در دمای ۳۷ ◦C قرار داده تا ذوب شوند( ۹). مراحل آزمایش برای نمونه های نگهداری شده در سرما و تداوم بخش های مختلف بعد از ۵ و ۱۰ روز مجددا تکرار شدند.

نتایج:
نتيجه ميانگين شمارش تعداد اسپرم هاي مذكور برحسب ×۱۰۸ تعداد اسپرم به صورت زير بود: ماهي اول : ۲۲۰، دوم: ۲۵۸، سوم: ۲۴۵، چهارم:۲۰۰، پنجم:۲۹۰، ششم : ۲۷۵، هفتم : ۳۱۵، هشتم : ۲۳۵، نهم:۱۸۰، دهم:۱۷۰ بود. نتايج بررسي اثر دما بر غلظت ATP در اسپرم ماهي كفال طلايي در نمودار شماره يك ارائه شده است . نتيجه بررسي اثر دما بر نگهداري اسپرم ماهي كفال طلايي در نمودار شماره ۲ آورده شده است . نتيجه اندازه گيري تداوم فعاليت اسپرم ها در محلول هاي مختلف در نمودار شماره ۳ ارائه شده است . روند تغييرات ميزان ATP در محلول هاي مختلف تداوم بخش طي زمان نگهداري ۱۰ روزه در نمودار شماره ۴ آورده شده است . بررسی نتایج کسب شده نشان داد:
۱- بررسی غلظتATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دماهای مختلف.

غلظت ATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دمای ◦C 10-12، ۲۲/۷ ۰۴/۷۴% غلظت ATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دمای ◦C20-18 بود
(اسپرم نمونه گیری شده در دمای ◦C 20-18 ،sperm nmol/108 09/1 04/ 17، N=10 ، اسپرم نمونه گیری شده در دمای ◦C 12-10، sperm nmol/108
9/0 21/12 ، N=10 ، ۰۵/۰P> ).
2- بررسی غلظت ATP اسپرمهای نگهداری شده در دماهای مختلف به مدت ۶ ساعت بیشترین تحرك اسپرم وتوانايي آن برای تلقیح تخم بعد از نمونه گیری است. نتایج کسب شده از این تحقیق

به مانشان داد که غلظت ATP اسپرمهای نگهداری شده در دمای ◦C4 به مدت ۶ ساعت۰۹۱/ ۲۶/۹۰% غلظت ATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دمای ◦C12-10 بود که این تفاوت معنی دار نبود. ( ۰۵/۰<p n=10,). غلظت ATP اسپرمهای نگهداری شده در دمای آزمایشگاه به مدت ۶ ساعت غلظت ATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دمای ◦C 12- 10 بود که این تفاوت معنی دار بود(n=10, p<0/001 ).
3- بررسی غلظت ATP اسپرمهای نگهداری شده در تداوم بخش های مختلف به مدت ۵ روز.