خلاصه

در سالهای اخیر بحث امکان کنترل بیولوﮊیکی خاکزاد مورد توجه جدی محققین قرار گرفته است که از آن جمله میتوان به باکتریهای آنتاگونیست بخصوص از باکتریهای گروه سودوموناسهای فلورسنت در کنترل بیماریهای قارچی و باکتریایی ریشه گیاهان زراعی اشاره کرد. میکروارگانیسمهایی که در ناحیه ریزوسفر گیاهان زندگی میکنند گزینه مناسبی برای استفاده در روشهای کنترل بیولوﮊیکی هستند زیرا ریزوسفر خط مقدم دفاعی

ریشهها علیه بیمارگرهای خاکزی میباشند. در این تحقیق تاثیر ٤١ جدایه باکتری در کنترل گونه var. Pythium ultimum sporangiferum روی ریشه گیاه لوبیا مورد بررسی قرار گرفت. اغلب کلنیهای رشد یافته روی محیط اختصاصی اس یک تولید رنگدانه فلورسنت کردند. با توجه به نتایج تستهای بیوشیمیایی،

جدایههای Pf18 و Pf23 (جدا شده از مزارع لوبیای شهرستان خمین) و جدایه Pf26 از مزارع لوبیای دانشکده کشاورزی کرج به عنوان گونهPseudomonas putida تشخیص داده شدند. جدایههای Pf13 و Pf22 بعلت عدم قطعیت در تشخیص به عنوان Pseudomonas sp. شناسایی شدند. جدایههای Pf8, Pf15, Pf16, Pf26, Pf27 و نیز استرین CHAO رشد قارچ داشتند. بهترین تأثیر را در جلوگیری از رشد P.ultimum در

شرایط آزمایشگاهی داشتند. جدایههای Bs4، Pf6 و Pf20 هیچ گونه تأثیری در کاهش رشد این گونه نداشتند.

به غیر از ١٠ جدایه شامل جدایههای Pf9, Pf10, Pf14, Pf19, Pf20, Pf24, Pf25, Pf29 Pf6, و Pf31

که قادر به محافظت از بذر نبودند بقیه باکتریها با ممانعت از رشد قارچ بیمارگر، امکان جوانهزنی بذر لوبیا در محیط کشت را باعث شدند. از بین ریزوباکتریهای آنتاگونیست مورد استفاده فقط ١٦ جدایه شامل Pf2, Pf4,

Pf8, Pf9, Pf13, Pf14, Pf15, Pf16, Pf18, Pf22, Pf26, Pf27, Pf28, Pf31 و Pf32 و نیز استرین CHAO تولید سیانید هیدروﮊن کردند. ١٤ جدایه شامل Pf1, Pf5, Pf6, Pf7 , Pf12 , Pf15, Pf20, Pf21, Pf23، Pf25, Pf27, Pf28 و Pf32 و نیز استرین CHAO تولید پروتئاز کردند. جدایههای Pf1, Pf13, Pf16, Pf26, Pf27 و Pf32 و نیز استرین CHAO با توجه به اندازه قطر هاله نارنجی رنگ اطراف کلنی باکتریها بیشترین تولید سیدروفور را داشتند. جدایههای B. subtilis و نیز جدایههای Pf11, Pf17, Pf20 و

Pf23 اصلا تولید سیدروفور نکردند. هیچیک از جدایههای مورد آزمایش نتوانستند درون لوله آزمایش حاوی محیط سلولاز باعث تغییر رنگ کاغذ صافی بشوند. جدایههای Pf16 وPf26 بهترین اثر را در افزایش وزن تر بوتههای لوبیا در خاک آلوده به P. ultimum در شرایط گلخانه داشتند و به همراه شاهد سالم در یک گروه

قرار گرفتند. بهترین تأثیر مربوط به جدایه Pf16 بود. بیشترین قدرت کلونیزاسیون ریشه مربوط به جدایههای

Pf4, Pf7, Pf13 و Pf28 بود.

واﮊههای کلیدی: لوبیا، کنترل بیولوﮊیکی، سودوموناسهای فلورسنت

مکاتبه کننده: مسعود احمدزاده

P. fluorescens

Pythium ultimum Trow
٧٩٤ مجله علوم کشاورزی ایران، جلد ٣٤، شماره ٤، سال ١٣٨٢

مقدمه

از بین بیماریهای مربوط به ریشه لوبیا، بیماری پوسیدگی

بذر، ریشه و بوته میری در اثر گونه

از شایعترین آنها میباشند (٢). گسترده بودن دامنه میزبانی،

انتشار وسیع جغرافیایی، بالا بودن قدرت بیماریزایی، انگل اختیاری بودن و توانایی زیاد در باقی ماندن بحالت ساپروفیتی در غیاب گیاه میزبان این گونه را از نظر بیماریزایی با اهمیت نموده و کارآیی برخی روشهای زراعی مانند آیش و تناوب را در کنترل بیماری کاهش داده است. برخی روشهای زراعی از قبیل رعایت فاصله کافی بین بوتههای لوبیا به منظور تهویه بهتر خاک و کاهش سایهانداز و جلوگیری از انتقال عامل بیمارگر بین ریشهها از اقداماتی است که میتواند در کنترل بیماری موثر واقع شود. ضد عفونی بذر با قارچکشهای ضد ائومیست١ نیز تا اندازهای در کاهش بیماری موثر است. تعدادی ارقام مقاوم به بیماری شناسایی شدهاند که متاسفانه در شرایط مزرعه دوام چندانی نداشته و پس از چند سال استفاده، مقاومت آنها شکسته شده است.

تاثیر اندک روشهای شیمیایی در کنترل بیماریهای گیاهی خصوصا بیمارگرهای خاکزی وهزینههای اقتصادی آن از یک طرف و نگرانیهای زیست محیطی از طرف دیگر، دستیابی به روشهای سالم و ارزانتر را به عنوان یک چالش جدی فراروی محققان قرار داده است. در سالهای اخیر بحث امکان کنترل بیولوﮊیکی عوامل بیماریزای گیاهی با استفاده از میکروارگانیسمهای آنتاگونیست بخصوص از گروه باکتریهای متعلق به سودوموناسهای فلورسنت (از قبیل Pseudomonas fluorescens و (P. putida و تعدادی از گونههای باسیلوس (Bacillus) در کنترل بیماریهای قارچی و باکتریایی ریشه گیاهان زراعی اشاره کرد. میکروارگانیسمهایی که در ناحیه ریزوسفر گیاهان زندگی میکنند گزینه مناسبی برای استفاده در روشهای کنترل بیولوﮊیکی هستند زیرا ریزوسفر خط مقدم دفاعی ریشهها علیه بیمارگرهای خاکزی میباشند (٢٣).

سودوموناسهای فلورسنت بخش قابل توجهی از جمعیت بومی در خاکهایی که بطور طبیعی بازدارنده بوده و نیز خاکهایی که

۱ . Oomycetes

بطور مستمر زیر کشت یک محصول٢ قرار گرفتهاند و یا با استفاده از تشعشع خورشیدی پاستوریزه شدهاند میباشند (٢٠).

بررسی منابع منتشر شده نشان میدهد که اول گزارش در مورد نقش سودوموناسهای فلورسنت در کنترل بیماریهای گیاهی مربوط به (٩) میباشد. این دو محقق خواص

آنتاگونیستی علیه قارچ Rhizoctonia

solani وی پنبه و در سال بعد علیه Pythium ultimum را روی همین گیاه به اثبات رساندند. همچنین موفق شدند نقش آنتی بیوتیک پایولوتئورین٣ را در این بازدارندگی نشان بدهند (

١٠). تا کنون تاثیرریزوباکتریهای آنتاگونیست بخصوص ازگروه سودوموناسهای فلورسنت و برخی گونههای جنس باسیلوس در کنترل بسیاری از بیماریهای قارچی و باکتریایی ریشه اغلب گیاهان زراعی به اثبات رسیده است (٣، ٢١، ٢٣). باکتریهای موجود در ناحیه ریزوسفر از گروه سودوموناسهای فلورسنت بطور مستقیم با تولید یک سری هورمونهای گیاهی و تحریک رشد گیاه، و نیز بصورت غیر مستقیم از طریق کنترل بیولوﮊیکی بیمارگرها و یا القای مقاومت در گیاهان باعث افزایش رشد آنها میشوند(٢٣). تولید آنتی بیوتیک (٧)، سیدروفور (١٤، ٢١)،

سیانید هیدروﮊن (١٣) و انزیم پروتئاز (١٣) از مهمترین مکانیسمهای موثر در کنترل بیولوﮊیکی عوامل بیماریزای گیاهی توسط این باکتریها بشمار میرود. اغلب میکروارگانیسمهای هوازی و بیهوازی در شرایط کمبود آهن تولید موادی با وزن ملکولی کم (٥٠٠ تا ١٠٠٠ دالتون) نموده که تمایل زیادی به تشکیل کمپلکس با آهن سه ظرفیتی (یون فریک) دارند. نقش اصلی این مواد تامین آهن برای سلول است

(١٤). سیدروفورها ضمن افزایش رشد گیاه، در کنترل بیولوﮊیکی عوامل بیماریزای گیاهی نیز موثرند. یکی دیگر از متابولیتهای میکروبی که بوسیله سودوموناسهای فلورسنت تولید میشوند سیانید هیدروﮊن می باشد که روی سیستم جذب مواد غذایی تاثیر می گذارد. جذب مواد غذایی توسط گیاه یک فرآیند انرﮊیخواه است. بر اساس مطالعات صورت گرفته حدود ٦٠ درصد انرﮊی ناشی از تنفس ریشه گیاه ذرت به این فرآیند اختصاص دارد. تولید انرﮊی بصورت بستههای ATP در سیستم

۲ . Monoculture 3 . Pyolutorin

احمدزاده و همکاران: بررسی تاثیر سودوموناسهای فلورسنت روی قارچ… ٧٩٥

تنفسی سیتوکروم اکسیداز بوسیله سیانید هیدروﮊن ممانعت میشود و باعث میگردد تا الکترونهای آزاد شده بوسیله اکسیداسیون NADH در میتوکندری از سایر مسیرهای تنفسی دیگر که مقاوم به سیانید هیدروﮊن است به اکسیژن برسد. لذا اتلاف انرﮊی در این حالت افزایش یافته و در نهایت باعث اختلال در رشد طبیعی گیاه میگردد (٢١).

بر اساس نتایج کارهای (١١) تعدادی از استرینهای P. fluorescens روی گونه P. ultimum عامل بوتهمیری نخود، اثرات مشابهی با قارچکشهای متالاکسیل و کاپتان داشت.

قدرت جوانهزنی و افزایش عملکرد برای تیمار متالاکسیل در تمام آزمایشها معادل یا بیشتر از سایر تیمارها بود. براساس نتایج کارهای (٢٢) تیمار بذور نخود باباکتری P. fluorescens

استرین Q29z-80 تاثیر مشابهی با کاربرد قارچکشهای متالاکسیل و کاپتان در شرایط مزرعه داشت. محققین در حال حاضر به دنبال پیدا نمودن خصوصیاتی از باکتریهای آنتاگونیست که در افزایش قدرت رقابت در محیط ریزو سفر و کارآیی آنها موثر است میباشند. این موضوع به آنها امکان میدهد تا با استفاده از مهندسی ﮊنتیک خصوصیات مورد نظر را در یک باکتری معین وارد نمایند. بررسی تاثیر عوامل محیطی روی تولید متابولیتهای ضد میکروبی و نیز یافتن روشهای سریع و آسان شناسایی باکتریهای آنتاگونیست از دیگر موضوعات مهمی است که درسالهای اخیر مورد توجه جدی مراکز علمی جهان و ایران قرار گرفته است.

مواد و روشها

جداسازی جنس Pythium

بذور پوسیده، پس از آمادهسازی را به محیط آب آگار ٢ درصد حاوی ٥٠ میلیگرم در لیتر آنتیبیوتیک ریفمپیسین١ منتقل نموده و پس از ٤٨ ساعت نگهداری در دمای ٢٣ درجه سانتیگراد، انتهای هیف کلنی به محیط کشت سیبزمینی-

هویج- آگار (PCA) منتقل و در دمای یخچال نگهداری شد.

برای جداسازی مستقیم و برآورد جمعیت قارچ یک گرم خاک کاملا خشک و نرم با ١٠ میلیلیتر آب سترون بهم زده شد و رقتهای مختلفی از آن تهیه و ٢/٠ میلیلیتر از هر کدام روی

۱ . rifampicin

محیط کشت انتخابی (حاوی ٢ گرم ساکارز، ٧/٠ گرم دی فسفات پتاسیم، ٣٠ میلیگرم سولفات استرپتومایسین، ٥/٠ گرم کربنات کلسیم، ٢/٠ گرم عصاره مخمر، ١ گرم نیترات پتاسیم، ١٢٠ میلیگرم پیمارسین و ٧٠ میلیگرم قارچکش (PCNB

منتقل و بصورت وارونه در دمای ٢٥ سانتیگراد نگهداری شد. با توجه به متوسط تعداد کلنی در تشتکها و میزان خاک مورد استفاده، جمعیت قارچ در هر گرم خاک محاسبه گردید.
شناسایی گونه Pythium

تشخیص گونه بر اساس منوگراف دیک (١٩٩٠) صورت گرفت. سرعت رشد شعاعی روی محیط کشت PDA در دمای ٢٥ درجه سانتیگراد در شرایط تاریکی، رنگ و منظره کلنی، اندازهگیری قطر ائوگون٢، ائوسپور٣، ائووپلاست٤ و ضخامت دیواره ائوسپور، منشا آنتریدی و نحوه اتصال آن به ائوگون تعیین گردید. این پارامترها با بزرگنمایی ١٠٠٠ میکروسکوﭖ اندازهگیری گردید. هر عدد از میانگین دو قطر بدست آمد.

شاخصهای ائووپلاست آپلروتیک و دیواره با استفاده از فرمولهای دیک محاسبه شد (٥). برای تولید اندامهای جنسی این قارچ (آنتریدی و ائوگون) از محیط کشت هویج – سیبزمینی – آگار (PCA) استفاده شد