مقدمه
در حبوبات، پروتئینها از اجزای مهم بذرند و نقش بسزایی در تهیه مواد غذایی دارند. در مجموع ۸۰ درصد وزن خشک بذر نخود را کربوهیدرات و پروتئین تشکیل میدهد .(Talebi et al., 2008) برطرف کردن نقص پروتئینی غلات از طریق افزودن پروتئین حبوبات، از بهترین راه حلهای رفع کمبود پروتئین و کالری در کشورهای در حال توسعه است. پروتئین نخود در مقایسه با سایر بقولات ارزش بیولوژیکی بیشتری ۵۲) تا ۷۸ درصد) دارد و از پروتئین سایر بقولات مرغوبتر است .(Samdaliri et al., 2010) نخود در دنیا پس از لوبیا (Phaseolus vulgaris L.) و نخود فرنگی ( Pisum (sativum L. رتبه سوم و در جنوب آسیا رتبه اول را در بین حبوبات دارد .(Gaur et al., 2010) عملکرد نخود از ۰/۳۵ تن در هکتار در ایران تا ۱/۶۰ تن در هکتار در مکزیک گزارش شده است ( Upadhyaya et al., 2007; .(Aggarwal et al., 2011
بهبود محصول از طریق استفاده از تنوع ژنتیکی، کلید موفقیت برنامههای اصلاحی است ( Renganayaki .(et al., 2001 اختلافات بین ژنوتیپها با توجه به ویژگی های زراعی، مورفولوژیک، بیوشیمیایی و مولکولی بهطور مستقیم و غیرمستقیم نشاندهنده اختلافات در سطح DNA است. بنابراین، کسب اطلاعات در مورد روابط ژنتیکی، اجتنابناپذیر است ( Tahir & Karim, .(2011 دلایل زیادی برای نیاز به ارزیابی صحیح تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتهای گیاهی وجود دارد. از این دلایل می توان به گواهی بذر، حمایت یا نگهداری صحیح تنوع ژنتیکی گیاهان ( Dwevdi & Gaibriyal, (2009، تجزیه تغییرپذیری ژنتیکی در ژنوتیپ ها، توزیع و نگهداری ژرمپلاسم (Zheleva et al., 2007) و انتخاب صحیح والدهای برتر برای تلاقی ها ( Tahir & Karim, (2011 اشاره کرد. بهکارگیری منابع ژنتیکی گوناگون در افزایش تنوع ژنتیکی مؤثر است. بهطور کلی، در دسترس بودن لاینهای مختلف و تلاقی بین آنها فرصت مناسبی را برای خلق ترکیبات ژنی جدید فراهم می کند و احتمال تولید یک ژنوتیپ منحصربه فرد، به تناسب والدین با تعداد ژنهای مختلف افزایش مییابد .(Upadhyaya et al., 2007) نشانگرهای مولکولی، چندشکلی را در سطح DNA آشکار میکنند و در نتیجه تحت تأثیر شرایط محیطی یا مراحل رشدی گیاه قرار نمیگیرند .(Collard et al., 2005) استفاده از نشانگرهای مولکولی و تهیه نقشههای پیوستگی ژنتیکی، از فعالیتهای اصلی در زمینه اصلاح مولکولی است. یکی از نشانگرهای مولکولی کارامد،ISSR1 است. در این روش از توالیهای ریزماهواره بهعنوان آغازگر در واکنش زنجیرهای پلی مراز برای ایجاد نشانگرهای چندشکل استفاده میشود. این روش، آسان و سریع است. ماهیت این روش به گونه ای است که از مزایای ریزماهواره ها و نشانگرهای تصادفی (مانند AFLP و RAPD ( شامل اختصاصی بودن، چندشکلی زیاد و تکرارپذیری خوب بهره میبرد ( Vos et al., 1995; Virk .(et al., 2000 مهم ترین محدودیت این روشها تکرارپذیری اندک RAPD، زیاد بودن هزینه AFLP و نیاز به دانستن توالیهای جانبی برای طراحی آغازگرهای خاص هر گونه در ریزماهواره است، که نشانگر ISSR بر این محدودیتها غلبه کرده است .(Belaj et al. , 2003) نشانگرهای ISSR بسیار چند شکل بوده و در مطالعات تنوع ژنتیکی، فیلوژنی، نشاندار کردن ژنی، نقشه یابی ژنومی و زیست شناسی تکاملی سودمندند. کاربرد نشانگرهای مولکولی در گونه زراعی نخود بسیار کم است که یکی از دلایل احتمالی آن، تنوع ژنتیکی کم در خزانههای کشتشده این گونه است .(Varshney et al., 2007) در واقع یکی از دلایل عملکرد اندک نخود، تنوع ژنتیکی ضعیف آن است
.(Clarke & Siddique, 2004; Rao, 2007) در یک مطالعه، ارتباط ژنتیکی بین نخود زراعی و شش گونه یکساله وحشی جنس Cicer با استفاده از نشانگر RAPD بررسی شد. در این بررسی از ۴۲ آغازگر تصادفی استفاده شد که فقط نه آغازگر قادر به تولید نوار در همه گونهها بودند. براساس چندشکلیهای موجود، گونههای مورد مطالعه در سه گروه دستهبندی شدند .(Talebi et al., 2009) ارزیابی مولکولی پنج ژنوتیپ نخود با استفاده از نشانگرهای ISSR و RAPD انجام گرفت. در هر روش نشانگری از پنج آغازگر استفاده شد که همه آنها نوار تولید کردند. برای هر آغازگر RAPD میانگین ۵/۸ نوار و برای هر آغازگر ISSR میانگین ۶/۶ نوار مشاهده شد. در نشانگر RAPD، ۵۵/۱۷ درصد و در نشانگر ISSR، ۶۳/۶۳ درصد نوار چندشکل وجود داشت .(Tahir & Karim, 2011) در بررسی دیگری با استفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR ارتباط ژنتیکی بین نوزده ژنوتیپ نخود زراعی و پنج ژنوتیپ از گونه وحشی Cicer reticulatum انجام گرفت. در تجزیه RAPD میانگین شش نوار و در تجزیه ISSR میانگین یازده نوار برای هر آغازگر مشاهده شد. در RAPD ژنوتیپهای وحشی با ژنوتیپهای زراعی ۷۷/۸ درصد و در ۷۹/۶ ISSR درصد نوارهای چندشکل مشاهده شد. در RAPD بین ژنوتیپهای وحشی ۵۱/۷ درصد و بین ژنوتیپهای زراعی ۵۰/۵ درصد و در ISSR بین ژنوتیپهای وحشی ۶۵/۶۳ درصد و بین ژنوتیپهای زراعی ۵۶/۲۵ درصد نوارهای چندشکل مشاهده شد. تجزیه ISSR نشان داد که حتی با شش آغازگر چندشکل میتوان تخمین قابل اعتمادی از تنوع ژنتیکی بهدست آورد، در حالیکه در تجزیه RAPD برای این امر حدود ۳۰ آغازگر نیاز بود .(Rao, 2007) در آزمایش دیگری از پنج آغازگر ISSR برای بررسی تنوع ژنتیکی ۲۵ ژنوتیپ نخود استفاده شد. نتایج نشان داد که نوارها در دامنه ۰/۳ تا ۱/۵ کیلوباز تولید شدند. همچنین، ارزش ضریب کوفنتیک (r=0/92)، نشاندهنده تنوع کافی بین ژنوتیپهای موردبررسی بود .(Aggrawal et al., 2010)
برای ارزیابی کارایی نشانگرهای مختلف در کشف چندشکلی در سطح DNA، ۱۹ نشانگر RAPD، ۲۲ نشانگر SSR و ۲۰ نشانگر ISSR برای کشف اختلافات ژنتیکی بین دو گیاه مهم حبوبات (لوبیای سودانی۱ و نخود زراعی) با استفاده از صفات مختلف استفاده شدند. توسط نشانگرهای ISSR، SSR و RAPD بهترتیب ۹۵، ۹۳ و ۸۷ درصد چندشکلی بهدست آمد. در کل الگوهای نواربندی DNA نشان داد که تنوع ژنتیکی بین گونهها بیشتر از تنوع درون گونهها بود. محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) نوارها در RAPD، SSR، و ISSR بهترتیب ۰/۴۹، ۰/۶۱ و۰/۷۰ بهدست آمد ( Datta et al., .(2010 در یک بررسی نه آغازگر RAPD در هفت ژنوتیپ نخود زراعی استفاده شدند. تعداد نوارهای ایجادشده در هر آغازگر در دامنه ۱۱-۳ قرار داشت. تجزیه خوشهای ژنوتیپها را در دو گروه مجزا کرد. بیشترین شباهت بین ژنوتیپها ۶۵/۱ درصد و کمترین شباهت ۳۳/۳ درصد بود ۴۹ .(Mahmood et al., 2011) ژنوتیپ نخود با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره تجزیه شدند . پنج جفت آغازگر استفاده شده ۵۰ آلل مختلف را تولید کرد. تنوع ژنتیکی توسط شاخص تنوع (DI) که در دامنه ۰/۸۸۵ تا ۰/۹۰۴ و محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) که در دامنه ۰/۹۷۲ تا ۰/۹۹۱ قرار داشت ارزیابی شد .(Jomová et al., 2009) از تجزیه نشانگر AFLP برای ارزیابی تنوع ژنتیکی میان نخود زراعی و گونههای وحشی جنس Cicer استفاده شد. از مجموع پنج آغازگر استفادهشده ۲۱۴ نوار مشاهده شد که ۹۸/۶ درصد از این نوارها چندشکل بودند. تجزیه خوشهای ژنوتیپها را در سه گروه متمایز قرار داد .(Nguyen et al., 2004) در بررسی دیگری تنوع ژنتیکی ۲۸ ژنوتیپ نخود (با مبدأهای مختلف) توسط نشانگر AFLP ارزیابی شد. میانگین سیزده نوار چندشکل در هر آغازگر مشاهده شد. تجزیه خوشهای ژنوتیپهای مورد بررسی را در چهار گروه متمایز کرد. نتایج نشان داد که بیشترین تنوع ژنتیکی در ایران، افغانستان و لبنان بود. براساس نشانگرهای DNA میتوان نتیجه گرفت که سه مرکز اصلی تنوع نخود، افغانستان-پاکستان، ایران-ترکیه و سوریه-لبنان است .(Talebi et al., 2008)
در مطالعه حاضر، تنوع مولکولی ۵۶ لاین اصلاحشده نخود زراعی بررسی شد. مطالعه انجامگرفته روی این لاینها، حاکی از تنوع فنوتیپی چشمگیر از نظر خصوصیات زراعی و تحمل سرما بوده است ( Naderi et .(al., 2013 بهطوریکه از نظر صفات عملکرد دانه، وزن صددانه، ارتفاع بوته و تحمل سرما و یخزدگی تفاوت معنیداری بین لاینها وجود داشت. گروهبندی لاینها براساس ویژگیهای تحمل تنش سرما، آنها را به چهار گروه متمایز، حساس تا کاملاً متحمل طبقهبندی کرد. با توجه به تأثیر عوامل محیطی در برآوردهای تنوع حاصل از نشانگرهای مورفولوژیک، در این مطالعه از نشانگرهای مولکولی ISSR بهمنظور ارزیابی تنوع ژنتیکی لاینهای مذکور استفاده شد. بدیهی است برآوردهای تنوع ژنتیکی با استفاده از چندشکلی های بین لاینها در سطح DNA میتواند اطلاعات مفیدی در زمینه وضعیت ژنتیکی ژرمپلاسم نخود مورد مطالعه ارائه کند.

مواد و روشها
در این بررسی مواد گیاهی شامل ۵۶ لاین نخود تیپ کابلی از مجموعه ژنوتیپهای اصلاحی مرکز بینالمللی تحقیقات کشاورزی در مناطق خشک۲ با عنوان خزانه بینالمللی نخود متحمل به سرما ۳ بود که پیش از این در دانشگاه محقق اردبیلی ارزیابی شده است (جدول .(۱ برای استخراج DNA، نمونههای برگی از بوتههای انتخابی در مرحله چهار تا پنجبرگی با استفاده از روش (Doyle & Doyle, 1990) CTAB با اندکی تغییر استخراج شد. برای تعیین کمیت و کیفیت نمونههای DNA استخراجشده از الکتروفورز ژل آگارز ۰/۸ درصد استفاده شد. در نهایت بعد از اطمینان از کمیت و کیفیت DNAهای استخراجشده برای استفاده در واکنش زنجیرهای پلی مراز (PCR) با غلظتی برابر ۲۰ نانوگرم در میکرولیتر رقیق شدند. در این پژوهش برای تکثیر قطعات DNAژنومی از ۳۴ آغازگر ISSRتهیه شده از شرکت Bioneer کره جنوبی استفاده شد
)جدول. ۲ (اجزای واکنش زنجیرهای پلیمراز برای حجم۲۰ میکرولیتر حاوی بافر ۲(۱X)PCR10X میکرولیتر،۲۰) DNA نانوگرم در میکرولیتر) ۴ میکرولیتر، کلرید منیزیم ) ۲ میلی مولار) ۰/۸ میکرولیتر، آغازگر ۰/۴) میکرو مولار) ۱/۶ میکرولیتر، ۰/۱ dNTP میلیمولار ۰/۲ میکرولیتر، آنزیم DNATaq پلی مراز ۱/۳ واحد ۰/۲۶ میکرولیتر و آب مقطر دیونیزه ۱۱/۱۴ میکرولیتر بود. تکثیر در دستگاه ترموسایکلر و چرخه PCR به این شرح صورت گرفت: مرحله اول: واسرشتهسازی اولیه بهمدت ۵ دقیقه در دمای ۹۴ درجه سانتیگراد، مرحله دوم: ۴۰ چرخه واسر شته سازی به مدت ۱ دقیقه در دمای ۹۴ درجه سانتیگراد، اتصال آغازگرها به رشتههای الگو بهمدت ۱ دقیقه در دمای تستشده ۵۶-۴۶) درجه سانتیگراد) و بسط رشته DNA توسط پلیمراز بهمدت ۱ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد، مرحله سوم: بسط نهایی بهمدت ۵ دقیقه در ۷۲ درجه سانتیگراد.

فراورده های تکثیرشده توسط PCR با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز ۱/۵ درصد جداسازی و به روش رنگآمیزی با اتیدیوم بروماید آشکارسازی شدند. برای مشخص شدن اندازه قطعات تکثیرشده از نشانگر وزن مولکولی SM0191 شرکت Fermentas با اندازه قطعات ۵۶۴ تا ۲۱۲۲۶ جفت باز استفاده شد. برای عکسبرداری از ژلها از دستگاه UV-tec استفاده شد.