چکیده
به منظور بررسی پلی مورفیسم ژن SCD1 در جمعیت گاومیش خوزستان، از تعداد َِ نمونه گاومیش از شهرهای شوشتر،
دزفول، دشتآزادگان و شادگان خون گیری به عمل آمد و استخراج DNA با استفاده از کیت DIAtom DNA perp

صورت گرفت . با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و تکنیک PCR قطعه ًًُ جفت بازی اگزون ِ ژن SCD1 تکثیر یافت. سپس با استفاده از آنزیم NCO1 مورد هضم آنزیمی قرار گرفت((RFLP و به کمک الگوهای باندی بر روی ژل آگارز َ٪ تمامی نمونه ها تعیین ژنوتیپ شدند. نتایج حاصل از باندهای الکتروفورزی تمامی ژنوتیپ های مورد آزمون را مونومورف((VV نشان داده به طوری که در هیچ یک از نمونههای تعیین ژنوتیپ شده، آلل دیگری مشاهده نشده است.بنابراین نتایج حاصل از این تحقیق، عدم وجود تعادل هاردی واینبرگ را برای جایگاه SCD1 نشان داد.

کلمات کلیدی: گاومیش، SCD1، PCR-RFLP، پلیمورفیسم

مقدمه
شیر نشخوارکنندگان یکی از مهمترین غذاهای انسان بوده که حاوی نسبت های بالایی از اسیدهای چرب کوتاه زنجیر و اسید لینولئیک مزدوج (CLA) است کهاحتمالاً در نتیجهی ترشح مؤثر پیش سازهای این اسیدها از پلاسما میباشد (ْ). بیشتر این اسیدهای چرب، اشباع شده اند زیرا اسیدهای چرب غیر اشباع (UFA) توسط میکروارگانیسم های شکمبهای هیدروژنه میشوند(ُوَ). در حیوانات نشخوارکننده یکی از آنزیم های کلیدی مؤثر بر ترکیب اسیدهای چرب شیر و بافت بدن، استرول کوآنزیم آ دسچورازٌ (SCD1) میباشد. این آنزیم با ایجاد پیوند دوگانه در موقعیت کربن شماره ُ در اسید چرب عمل میکند و در حقیقت اسیدهای چرب اشباع ًٌ تا ٌَ کربن را به اسیدهای چرب غیر اشباع با یک پیوند دوگانه تبدیل میکند(ُ)؛ همچنین بیشترین اسید لینولئیک مزدوج (CLA) ساخته شده در غده پستانی حیوانات نشخوارکننده، توسط این آنزیم سنتز میشود(ِ). یک راه متناوب برای مطالعه کیفیت تغذیهای چربی شیر آنالیز تفاوتها در فعالیت SCD1است(ُ). از
آن جا که امروزه تحقیقات ژنتیک در حیوانات مزرعه ای، عمدتا بر روی شناسایی ژن های تاثیر گذار بر صفات مهم اقتصادی
تمرکز می کند ،شناسایی و مطالعه ی آنها نهایتا منجر به بهبود برنامه های اصلاح نژادی می گردد( ّ) لهستان یکی از مهمترین
این ژنها، ژن SCD1 بوده که در برگیرندهیتقریباً ٌِ-ٍُ کیلوباز(ٌْکیلوباز در گاو) و شامل ّ اگزون و ِ اینترون
میباشد(ٍو ًٌ) . همچنین دو آلل A و V در ژن SCD1نیزقبلاً شناسایی شده است(ِ). (تانیکوچی و همکاران
ًًٍُ)دریافتند که پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی ( (T/C در ناحیه ای از ژن SCD1 در گاو وجود دارد که موجب
جایگزینی اسید آمینه والین بجای اسید آمینه آلانین می شود و دریافتند که آللهای CوT با درصد بالای اسیدهای چرب غیر
اشباع با یک پیوند دوگانه (MUFA) موجود در چربی درون ماهیچه ای در گاوهای سیاه ژاپنی رابطه دارد. ژن SCD1دارای

جهش A293Vاست که جایگاه روی کروموزوم BTA26 می باشد.بررسی چندشکلی ژن SCD1 روشی است که با

استفاده از آن، می توان حیواناتی را انتخاب کرد که دارای مقادیر بیشتری از اسیدهای چرب مفید در شیریا بافت خود میباشند

که این امر در نهایت باعث سودمندی اصلاحگر و جامعه میگردد(ٌ). همچنین به دلیل همبستگی اسید های چرب اشباع با
وقوع بیماری های قلبی و عروقی در انسان، افزایش محتوای اسیدهای چرب غیر اشباع در شیر می تواند بسیار مفید باشد(َ).مطالعات انجام شده نشان می دهد که گاومیش دارای سطوح بیشتری از اسید لینولئیک در شیرش میباشد که یکی از
دلایل این امر می تواند بخاطر سطح متفاوت آنزیم SCDدر غدهی پستانی یا وجود چندشکلی در ژن SCD، تغییر ساختار

آنزیم و تغییر عملکردش باشد(ٌ) هدف از این تحقیق آنالیز پلی مورفیسم ژن SCD1 در گاومیش های خوزستان می باشد.

مواد و روشها
برای انجام این تحقیق، از ًِ رأس گاومیش در استان خوزستان خونگیری به عمل آمد.. خونگیری از ورید وداج گردن
به میزان ٍ تا َ سی سی در لوله های خلاء دار حاوی ماده ضد انعقاد((EDTA انجام گرفت. نمونه های جمع آوری شده در

مخزن حاوی یخ نگهداری و به آزمایشگاه مرکزی دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان منتقل شدند و تا زمان استخراج دی. ان. ای در دمای ًٍ- درجه سانتیگراد نگهداری شدند استخراج دی. ان. ای با استفاده از کیت DIAtom DNA perp انجام گرفت.

از آنجایی که تعیین خلوص دی. ان. ای مورد مطالعه از اهمیت خاصی برخوردار است، لذا برای بررسی کمیت و کیفیت تعیین مقدار دی. ان. ای از روش های الکتروفروز استفاده میشود. در این آزمایش به منظور تکثیر قطعهی ًًُ جفت بازی پس
از استخراج دی. ان. ای از نمونه خون کامل گاومیش خوزستان، واکنش زنجیرهای پلیمراز( (PCR با ترکیب مواد زیر انجام

گرفت. بافر PCR ِ/ٍ میکرولیتر، پرایمر (رفت) ٌ میکرولیتر، پرایمر (برگشت) ٌمیکرولیتر، آنزیم تک پلیمراز ٍ/ً میکرولیتر، dNTP ِ/ً میکرولیتر، Mgcl2 ِْ/ً میکرولیتر، DNA َ میکرولیتر، آب استریل ًِ/ٌّ میکرولیتر (ْ). . جهت تکثیر قطعه مورد نظر از ژن SCD1 به کمک تکنیکPCR از دو پرایمر اختصاصی طراحی شده توسط Kgwatalala و همکاران استفاده گردید.توالی پرایمرهای مورد استفاده عبارتند از:
:

:۵′-CCC ATT CGC TCT TGT TCT GT-3′ توالی آغازگر رفت

:۵′-CGT GGT CTT GCT GTG GAC T-3′ توالی آغازگر برگشت

جهت بهینه کردن واکنش های PCR الگوهای حرارتی به روش شیب حرارتی و در نهایت الگوهای حرارتی زیر با َِ
چرخه ایده آلترین شرایط برای تکثیر ناحیه مورد نظر انتخاب شد: دمای واسرشت اولیه ُُ درجه سانتیگراد به مدت ِ

دقیقه، دمای واسرشت ثانویه ُُ درجه سانتیگراد به مدت ٌ دقیقه،دمای اتصال َِ درجه سانتیگراد به مدت ٌ دقیقه، دمای تکثیر ٍْ درجه سانتیگراد به مدت ٌ دقیقه و دمای تکثیر نهایی ُُ درجه سانتیگراد به مدت ًٌ دقیقه. به منظور بررسی کیفیت محصولات PCR وجود یا عدم وجود و یا مقادیر تولید محصول با استفاده از الکتروفورز محصول PCR در ژل

آگارزٌ% است. هضم آنزیمی محصولات :PCR در روش PCR-RFLP پس از انجام عمل PCR و تکثیر ناحیه ًًُ جفت بازی که نقاط پلیمورف به صورت وجود یا حذف جایگاه برشی برای آنزیم های محدودالاثر خاصی وجود دارند، بایستی قطعه تکثیر یافته را در معرض آنزیم مناسب قرار داد تا تشخیص آلل ها امکان پذیر گردد. محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز توسط آنزیم NCO1 مورد هضم قرار گرفت.