مواد و روشها

آشت سلول

سلولBSC 1 به تکثیر ویروس روتا حساس می باشد. بنابراین براي تهیه بذر ( Seed) ویروس و تولید انبوه ویروس از این رده سلولی استفاده شد سلولها در محیط DMEM حاوي %۱۰ سرم آه حاوي ۵ ×۱۰۴-۱×۱۰۵ سلول در هر میلی لیتر بود آشت داده شدند و در دماي ۵ ۳۷ ۰ C درصدCO2 انکوبه گردید. پس از گذشت ۲۴-۴۸ ساعت مونولایر آاملی از آشت سلول جهت تلقیح ویروس آماده گردید.
تهیه ویروس

دراین پژوهش از ویروس روتا ( SA11 )ٍsimian 11 rotavirus استفاده شد. از رقتهاي مختلف ویروس بذر حاوي ۵µg/ml تریپسین به آشت سلول اضافه شد و روزانه بروزCPE یادداشت گردید و با استفاده از فرمول Reed and Muenchتیترویروس تعیین گردید
تولید آنتی بادي در خرگوش

مقدار ۰/۵ میلی لیتر محلول پروتئین هاي سلول آلوده با ۰/۵ میلی لیترFCA مخلوط گردید و در ۶- ۸ جاي مختلف پشت خرگوش به صورت زیر جلدي تزریق شد. یک ماه بعد دو ترزیق یادآور با فاصله ۱۵ روز با ۰/۲۵ میلی لیتر از محلول پروتئین با ۰/۲۵FIC میلی لیتربه طور عضلانی در هر دو ران خرگوش انجام شد
آزمایش ایمونوفلوئورسانس غیر مستقیم

آزمایش ایمونوفلوئورسانس غیر مستقیم با استفاده از آنتی بادي جذب شده با سلول BSC1 بر رويCoverslip انجام شد. آزمایش ایمونوفلوئورسانس غیر مستقیم با استفاده از آنتی بادي جذب شده با سلول BSC1 بر رويCoverslip انجام شد.

.در این آزمایش از سرم خرگوس ایمونیزه نشده به عنوان آنترل منفی همچنین از آنتی سرم تهیه شده علیه ویروس روتا به عنوان آنترل مثبت استفاده شد وبر روي سلول آلوده به ویروس روتا آزمایش ایمونوفلوئورسانس غیر مستقیم انجام شد

PCR
تکثیر cDNA با روش PCR و با استفاده از ,۱۰XPCR buffer TaqDNA Polymerase ,10mMdNTP,
50mMMgcl2 پرایمرهای اختصاصی۱۰Pomol RWF, 10PomolRWR ,و طبق برنامه( ۱ دقیقه ۹۶ oC Denaturation و ۳۰ ثانیه۱Annealing 62 0 C و دقیقه۱۰ ,Extension 72 0 C دقیقه (Final Extension 72 0 C درThermal cycler انجام شد.
آلونینگ در ناقلهای پلاسمیدي
ساخت پرایمر براي آلونینگ ژنnsp4 روتا ویروس انسانی سویه Wa، آه cDNA آن از دآتر Palombo دریافت شده بود. به گونه اي طراحی شد آه جایگاه هاي مناسب جهت برش DNA با آنزیم Bam HI و ) KPnI آه درون ژن nsp4وجود نداشت) فراهم گردید براي آلونینگ ژنnsp4 از آلونینگ وآتور(pBS-KS (+ استفاده شد. پس از تایید آلونینگ ژن آامل قطعه ۱۰ ویروس روتا، پلاسمید نوترآیب توام با پلاسمید بیانی(pQE-30 , ( Expression Vector توسط دو آنزیم Bam HI و KPn1 بریده سپس در آنار مارآر با استفاده از ژل آگارز، الکتروفورز شد.DNA توسط
آیت Agarose gel DNA extraction kit استخراج شد . . با استفاده ازDNA خالص شده واآنش اتصال (
( Ligation به طور شبانه در دماي۱۴- ۱۶ o C انجام شد
ا

تعیین توالی

براي تعیین توالی نوآلئوتیدهاي ژن آلون شد، باآتري حاوي پلاسمید نوترآیب آشت داده شد و توسط روش خاتمه زنجیره DNA نشاندار با رنگ فلوئورسنت با استفاده از دستگاه Applied Biosystem تعیین توالی شد( توسط شرآت MWG آلمان).
بررسی بیان پروتئین

۱۰ میلی لیتر محیط L. B مایع همراه با آنتی بیوتیک مناسب به داخل فلاسک ۵۰ میلی لیتري ریخته شد یک آلنی از آشت تازه برداشته و به داخل آن تلقیح شد و دردماي ۳۷ ۰ C یا(۳۰oC در انکوباتور شیکردار به طور شبانه انکوبه گردید. براي القاء جهت بیان پروتئین، IPTG به غلظت نهایی ۱ mMبه آن اضافه شد. رشد باآتري ها به مدت ۴-۵ ساعت ادامه یافت.
خالص سازي پروتیین نوترآیب
رسوب باآتري به ازاي هر گرم وزن مرطوب در ۲-۵ میلی لیتر از بافر لیز آننده حل شد آشت باآتري سانتریفوژ گردید و رسوب حاصله در ۵ میلی لیتر بافر دناتوره آننده، حل گردید یک میلی لیتر از محلول ۵۰ درصد Ni-NTA به ۴ میلی لیتر از مایع رویی حاصله از لیز باآتري اضافه گردید و به مدت یک ساعت در دماي اتاق شیکر شد. ستون دو بار با ۴ میلی لیتر از بافر شستشو، شسته و مایع خروجی براي بررسی SDS-PAGE جمع آوري شد.پروتئین با ۰/۵ میلی لیتر بافر جداسازي elution buffer از رزین جدا گردید.
آزمایش الایزا
ابتدا براي تعیین غلظت مناسب آنتی ژن و رقت مناسب آنتی سرم از پلیت چکربورد استفاده شد. براي Coat آردن پلیت الایزا با نمونه آماده شده پروتئینی، ابتدا در بافر آربنات – بی آربنات pH : 9/6-0/1M رقیق گردید. بدین ترتیب آه مقدار ۲۰۰ میکرولیتر نمونه با غلظت ۸۰ میکروگرم در میلی لیتر بافر آربنات بی آربنات به تمامی حفرات ستون اول پلیت الایزا اضافه شد. به حفرات ستون اول پلیت، آنتی سرم( تهیه شده علیه لیزات سلول آلوده به روتاویروس آه با سلول BSC1 جذب شده است) با رقت ۱ : ۵۰ در بافرTBST اضافه شد.
بررسی ایمنی پاسیو موضعی روده اي
جهت بررسی اثر آنتی بادي از راه دهان، مقدار ۱۰۰l از ۱۰ ۶/۵ TCID50/ml ویروس SA11 به طور

خوراآی به سه گروه نوزادان موش ۴- ۵ روزه داده شد به یک گروه آنتی بادي علیه NSP4 انسانی به گروه دیگر سرم خرگوش ایمونیزه نشده به عنوان آنترل داده شد . خوراندن آنتی بادي ها با فاصله یک ساعت پس از تلقیح شروع شد و به مدت ۴۸ بعد ادامه یافت. به ۵ نوزاد موش دیگر نیزمحیط آشت (آه ویروس ها در آن تهیه شده بود)داده شد. ۶-۲۴ ساعت پس از تلقیح نوزادان موش با فشار ملایم در ناحیه شکم از نظر وجوداسهال مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج و بحث:
– بیان Nsp4 نو ترآیب سویه Wa
بیان ژن nsp4 تحت آنترل پروموتر.T5 از آلیه آشت هاي ( در حضور یا عدم حضور( IPTG الکتروفورز پروتئین (SDS- PAGE)و وسترن بلاتینگ انجام شد. شکل ۱بیان پروتئین NSP4 را در آلون هاي آه با IPTG القاء است(ستون هاي شماره ۵ و۳ )در مقایسه با آلون ( القاء نشده با(IPTG (ستون شماره (۲ و آلون حاوي پلاسمید pQE-)30 القاء شده با (IPTG نشان می دهد. با توجه به مارآروزن مولکولی پروتئین و حرآت آن برروي ژل، وزن مولکولی پروتئین بیان شده NSP4 حدود ۲۰ آیلو دالتون تعیین شد. بیان پروتئینNSP4 با استفاده از وسترن بلاتینگ و با استفاده از آنتی بادي تهیه شده علیه عصاره سلول آلوده با روتاویروس میمونی سویه SA11 مورد تایید قرار گرفت..

۵ ۴

شکل(.(۱ الکتروفورز عصاره باآتري (سویه ( α DH5 حاوي پلاسمید نو ترآیبpYS46 بیان آننده پروتئین NSP4 و پلاسمیده ؛pQE-30 توسط ژل ۱۳/۵ SDS-PAGE درصد. ستون شماره ۱ مارآروزن مولکولی پروتئین. ستون شماره ۲

.عصاره باآتري ) pYS46 القاء نشده).ستون هاي شماره ۵و۳ عصاره باآتري) pYS46 القاء شده با (IPTG آه پروتئین NSP4 در آن به صورت باند حدود ۲۰ آیلو دالتونی با پیکان مشخص شده است. ستون شماره ۴ عصاره باآتري حاوي پلاسمید pQE-30 فاقد قطعه خارجی (القاء شده با .(IPTG