چکیده

گونه داتوره طیف گسترده ای از آلکالوئیدهای تروپان را تولید می کند. هیوسیامین و اسکوپولامین از مهمترین این آلکالوئیدها مـی باشند که از نظر صنعت داروسازی مهم هستند. اخیرا تولید ترکیبات فعال ژنتیکی در ساختار ریشه های مویین توجه زیـادی را بـه خود جلب کرده است. لذا با کشت ریشه مویین که نتیجه تراریزش باکتری Agrobacterium rhizogenes است مـی تـوان در مدت زمان کوتاهی مقدار زیادی از متابولیت های ثانویه را در این گیاه تولید کرد. در این پژوهش تاثیر سویه های مختلف بـاکتری A4) Agrobacterium rhizogenes، A13، ۱۵۸۳۴ ، ۲۶۵۶، (MSU با OD=1 بر میزان تولید ریشه های مویین بررسـی شده است. نتایج حاصل از آنالیز داده ها بیانگر تفاوت سویه های باکتری از نظر درصد تولید ریشه مویین است. سویه A4 با تولید ۸۶/۶ درصد ریشه مویین به عنوان بهترین سویه جهت القای ریشه مویین شناخته شد و سویه ۲۶۵۶ کمترین میـزان ظهـور ریشـه ۱۵/۳۸) درصد) را داشته است. لذا نتایج این بررسی نشان داد که میزان ظهور ریشه مویین به سویه آگروباکتریوم رایزوژنـز وابسـته است. تایید ماهیت تراریختگی ریشه های مویین نیز از طریق آنالیز PCR با استفاده از آغازگرهای ژن rolC انجام شد.

واژگان کلیدی: داتوره، ریشه مویین، آگروباکتریوم، آلکالوئید، اینوکسیا

۱

مقدمه

متابولیتهای ثانویه نقش مهمی در سازگاری گیاهان با محیط اطراف بر عهده دارند و از طرف دیگر منبع مهمی از مواد دارویی فعال نظیر آلکالوئیدها هستند .آلکالوئیدهای تروپانی که از مهمترین آن ها می توان به هیوسیامین و اسکوپولامین اشاره کرد، از جمله مهمترین ترکیبات موجود در تعدادی از گیاهان خانواده ی سولاناسه می باشند. اثرات آنتی کولینرژیکی این ترکیبات، کاربرد آن هارا در پزشکی متداول کرده است ( تریز و ایونس، .(۳۵۰ :۱۹۹۶ گونه داتوره طیف گسترده ای از آلکالوئیدهای تروپان را تولید می کند (لاناسنوا و تمینن، (۱۱۳ : ۱۹۹۳ که سنتز مصنوعی این ترکیبات مشکل بوده یا از لحاظ اقتصادی مقرون به صرفه نیست. در این موارد استفاده از کشت سلولی و ریشه های مویین می تواند یک گزینه مناسب برای تولید متابولیت های ثانویه در مقیاس وسیع محسوب گردد (راویشانکار و ونکاتارامون، .(۱۱۷ :۱۹۹۸

بهره برداری از کشت ریشه های مویین یا تراریخته که باعث می شود تولید انبوهی از ریشه های توسعه یافته ایجاد شود، یک رویکرد نسبتا جدید بیوتکنولوژی گیاهی در شرایط آزمایشگاهی است که در سال های اخیر توجه رو به افزایشی داشته است. با وجودی که مکانیزم عمل باکتری اگروباکتریوم که باعث تغییر ژنتیکی می شود بیش از سی سال است که شناخته شده است اما ظرفیت زیادی از کشت ریشه های تراریخته برای مدت زیادی نادیده گرفته شده بود. با این حال، در اواسط دهه ۱۹۸۰ نکاتی از توانایی بالقوه ریشه های مویین از طریق یک سری تحقیقات به دست آمد که تمرکز خود را به طور عمده در تولید آلکالوئید ها معطوف کرده بودند (پاین و همکاران، .(۴۷۴ : ۱۹۸۷ سیستم آگروباکتریوم اولین سیستم تراریختی موفق در گیاهان است که کاربرد آن در سال ۱۹۸۳ موانع مهندسی ژنتیک گیاهی را شکست (دلاریوا و همکاران، .(۴۲۳ :۱۹۸۸ باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز بخشی از پلاسمید محرک ریشه زایی را به سلول گیاهی منتقل کرده و باعث ایجاد ریشه های مویین در سطح ساقه و سایر اندام های گیاهی می گردد (چنگ و همکاران .( ۲۴۳ :۱۹۹۴

توانایی A. rhizogemes در القای ریشه های مویین در محدوده ای از گیاهان میزبان پیشنهاد کننده سیستم امیدوار کننده ای برای مطالعه تولید متابولیت های ثانویه می باشد. تا به امروز کشت های ریشه مویین برای بیش از ۱۰۰ گونه گیاهی از جمله چندین گونه گیاهی در خطر انقراض بدست آمده است (جورجیو و همکاران، .(۱۱۷۵ :۲۰۰۷ به هر حال در شرایط آزمایشگاهی

۲

مشخص شده است که بیش از ۴۵۰ گونه گیاهی شامل طیف گسترده ای از دولپه ای ها و تک لپه ای ها و تعدادی از بازدانگان به باکتری فوق الذکر حساس می باشند (کریستی، .(۶۸۷ :۲۰۰۱

ارتقای کاربرد ریشه های مویین در بیوتکنولوژی گیاهی به دلیل چند ویژگی منحصر به فرد آنها بوده است. سرعت رشد زیاد آنها به همراه زمان دو برابر شدن کوتاه، آنها را به سوسپانسیون های سلولی غیر سازماندهی شده شبیه کرده است، اما بر خلاف سوسپانسیون های سلولی ریشه های مویین کاملا تمایز یافته بوده و تمایل به تولید متابولیت های ثانویه با همان خصوصیات گونه ای که از آن به دست آمده اند را دارا می باشد. حتی در مواردی که فقط متابولیت های ثانویه در قسمت های هوایی گیاه تجمع می یابند نشان داده شده است که تجمع همان متابولیت ها در ریشه های مویین انجام می شود (همیلی و لیگت، ۱ :۱۹۹۷، لیو و همکاران، .(۲۷۱ :۱۹۹۹

سهولت بدست آوردن ریشه های مویین و قابلیت آنها در سنتز ممتد ترکیبات شیمیایی مختلف سبب مزیت آنها به عنوان منبع تولید متابولیت های ثانویه با اهمیت گردیده است. معمولا ریشه های مویین قادر به تولید همان ترکیبات شناخته شده در ریشه های گیاه والدینی بدون کاهش فراوانی غلظت مشاهده شده در کشت های سوسپانسیون سلولی یا کالوس می باشند. از لحاظ مورفولوژیک ریشه های مویین شباهت زیادی به ریشه های اصلی دارند به استثنای این که طویل تر، منشعب تر، فاقد زمین گرایی و چیرگی راسی می باشند. یکی از ویژگی های کلیدی دیگر ریشه های مویین قابلیت رشد سریع آنها در غیاب تنظیم کننده های رشد گیاهی خارجی می باشد. از این نظر که تولید متابولیت های ثانویه معمولا در بافت های تمایز یافته بیشتر و از لحاظ ژنتیکی ثبات بیشتری دارد، ریشه های مویین تکنیکی جایگزین برای استفاده از کشت های سوسپانسیون سلولی جهت تولید متابولیت های ثانویه فراهم آورده است. مطالعات متعددی نیز نشان داده است که ریشه های مویین قادر به تولید ممتد بدون ناپایداری ژنتیکی بیوسنتزی متابولیت های ثانویه می باشند. این می تواند با این حقیقت مرتبط باشد که عدد کروموزومی در ریشه های مویین مانند والدین بوده و به سادگی توسط تنوع سوماکلونال مانند حالتی که در مورد کشت سوسپانسیون سلولی دیده می شود متاثر نمی گردد (راماچاندرا و راویشنکار.(۱۰۱ : ۲۰۰۲ علاوه بر این، تحولات اخیر در سیستم های بیوراکتور راههای افزایش کشت ریشه های مویین در مقیاس وسیع تر و صنعتی را ارائه می دهد (گوئیلین و همکاران، .(۳۴۱ :۲۰۰۶

۳

اغلب مطالعات صورت پذیرفته با استفاده از ریشه های مویین در ارتباط با تولید ترکیبات ثانوی با ارزش دارویی بوده است و در طول حدود ۲۰ سال گذشته از کشت های ریشه مویین به عنوان ابزاری قوی جهت مشخص کردن مسیرهای متابولیک، مراحل آنزیمی و تنظیم متابولیسم ثانویه استفاده شده است. اما به هر حال استفاده از آن فقط به تولید متابولیت ها محدود نشده است. ریشه های مویین همچنین برای جدا کردن فراورده های طبیعی جدید با فعالیت دارویی و باززایی گیاهان تراریخته با صفات سودمند به کار رفته اند (تورگروسا و بوکت، .(۵۳ :۱۹۹۷ همچنین می توان از ریشه های مویین تراریخت و پروتئین های نو ترکیب تولید کرد، بنابراین پتانسیل عظیمی برای صنعت داروسازی دارند. با توجه به اهمیت ریشه های مویین این پژوهش در جهت بررسی تاثیر سویه های مختلف باکتری Agrobacterium rhizogenes بر میزان تولید ریشه های مویین بررسی شده است.

مواد و روش ها

مواد گیاهی: برگ گیاهان ۶ تا ۸ هفته ای کشت شده در گلخانه پس از استریل شدن به عنوان ریزنمونه استفاده شد.

باکتری: در این آزمایش از سویه های A4، A13، ۱۵۸۳۴ و ۲۶۵۶ کشت شده در محـیط کشـت Yeast Maltose ) YMB (Broth حاوی ۱۰۰ میلی گرم در لیتر آنتی بیوتیک ریفامپسین و سویه MSU کشـت شـده در محـیط کشـت YMB (جـدول شماره (۱ فاقد ریفامپسین که در شیکر انکوباتور با دمای ۲۸ درجه سانتی گراد و مدت زمان ۲۴ ساعت رشـد داده شـده بودنـد بـا

OD=1 استفاده شدند.

جدول (۱) ترکیبات محیط کشت YMB مورد استفاده برای کشت باکتری

ترکیب مورد استفاده مقدار (میلی گرم بر لیتر)
K2HPO4.3H2O 655
MgSO4.7H2O 200
4

NaCl 100
D. mannitol 1000
Yeast extract 400

هم کشتی با باکتری: ریزنمونه های برگی استریل به صورت وارونه درون پتری های حاوی محیط کشت MS قرار گرفتند و بـا استفاده از سرنگ انسولین و به روش نیشتر زدن باسوسپانیون باکتری تلقیح شدند. عمل نیشتر زدن بیشتر در رگبرگ ها و حاشـیه های برگ انجام شد. تهیه سوسپانسیون باکتری نیز از کشت های تازه باکتریایی بعد از سانتریفیوژ صورت گرفت.

حذف باکتری: ۲ تا ۳ روز بعد از تلقیح، هنگامی که هاله ای از باکتری ها اطراف ریزنمونه ها رشد نمودند، سپس به محیط کشت

MS حاوی ۵۰۰ میلی گرم در لیتر آنتی بیوتیک سفوتاکسیم انتقال داده شدند تا از رشد مجدد باکتری ها جلوگیری شود.

تایید تراریختگی ریشه های مویین با استفاده از آنالیز :PCR جهت تایید تراریختگـی ریشـه هـای مـویین از آزمـون

PCR اختصاصی برای ژن rolC پلاسمید Ri باکتری استفاده شد. بدین منظور ابتدا DNA ی ریشه های مویین و ریشـه هـای معمولی گیاه داتوره با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت دنازیست، استخراج شده وسپس طبیعت تغییر یافته ی ریشه هـای مویین توسط ظهور ژن های rolC در ژنوم گیاهی از طریق PCR و باآغازگرهای اختصاصی آن ها مورد بررسی قرار گرفت.

آغازگرهایی که برای تکثیر ژن rolC استفاده شد عبارتند از :

۵′-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3′

۵′-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3′

نتایج و بحث

تاثیر نژاد های مختلف باکتری بر ظهور ریشه های مویین تراریخت: تمامی این نژاد های بـاکتری قـادر بـه تولیـد

ریشه مویین بودند با این تفاوت که در ریزنمونه های تراریخت شده با سویه هـای A4، A13، ۱۵۸۳۴ و MSU حـدود

۵

۱۵ تا ۲۰ روز بعد از هم کشتی، اولین ریشه های مویین در محل تلقیح ظاهر شدند، در حالیکـه در ریزنمونـه هـایی کـه توسط سویه ۲۶۵۶ تلقیح شده بودند، ریشه های مویین تراریخت بعد از چهار هفته شروع به ظهـور نمودنـد (شـکل .(۱ نتایج حاصل از آنالیز داده ها بیانگر اختلاف معنی دار سویه های مختلف باکتری از نظر درصد تولید ریشـه هـای مـویین است (سطح ۵ درصد). درصد ظهور ریشه های مویین در سویه های مختلف بـاکتری متفـاوت بـود و مقـدار آن در A4
86.66) درصد)، ۶۶٫۶۶) A13 درصد)، ۷۵٫۹۵) ۱۵۸۳۴ درصد)، ۱۵٫۳۸ ) ۲۶۵۶ درصد) و ۴۵) MSU درصد) بـود. در این بین بیشترین میزان ظهور ریشه مویین مربوط به سویه A4، و کمترین آن مربوط به سویه ۲۶۵۶ می باشـد (شـکل .(۲ این نتایج نشان داد که نوع سویه باکتری بطور معنی داری در میزان تولید ریشه مویین موثر است و بستگی به قدرت بیماریزایی آنها دارد. نتایج بدست آمده در این آزمایش مطابق با یافته های سایر محققین مـی باشـد. در ازمـایش انجـام شده توسط فارسی و همکاران در سال ۱۳۸۳ بر روی گیاه داتوره استرامونیوم اختلاف معنی دار در تولیـد ریشـه مـویین بین دو سویه A4 و LBA9402 مشاهده شد، به گونه ای که سویه A4 به میزان ۸۰ درصد و LBA9402 حدودا ۴۰ درصد تولید ریشه مویین داشتند. در آزمایش دیگری که بر روی گیاه پـروانش Catharanthusroseus انجـام گرفتـه بود، اختلاف معنی دار در میزان ظهور ریشه مویین بین پنج نژاد A4، A13، ۱۵۸۳۴، R1000 و MSU مشاهده شـد (حمیدی و همکاران، .(۱۳۹۲

۶

شکل (۱) ریشه مویین خارج شده از محل تلقیح پس از هم کشتی و رشد آن ها

۸۶٫۶۶ (a) 100

۷۵٫۹۵ (b)
66.66 (c)

۴۵ (d)

۱۵٫۳۸ (e)

۵ ۱ ۲ ۳ ۴

۸۰ درصد
۴۰
ریشهظهور
۶۰
۲۰ مویین
۰

سویه باکتری

شکل (۲) اثر سویه باکتری بر درصد تولید ریشه مویین

تایید ماهیت تراریختی ریشه های مویین با استفاده از آنالیز : PCR نتایج آنالیز PCR نیز حضور قطعه ۶۱۲bp مربوط به ژن rolC را در ریشه های مویین تایید نمود. در ریشه های مویین تراریخت، باند اختصاصی ۶۱۲bp برای ژن

rolC بر روی ژل آگارز مشاهده گردید (شکل .(۳ در صورتیکه انجام PCR با همین پرایمر و DNA سلول های ریشه طبیعی

۷