مقدمه

اهمیت جهانی و قدمت گندم((triticum aestivum برهیچ کس پوشیده نیست. دامنه وسیع سازگاری و مصارف متعدد، آنرا بعنوان مهمترین غله در جهان مطرح کرده است. از سوی دیگر محدودیت وجود ارقام سازگار به خشکی، شوری، سرما و مقاوم به آفات و بیماریها، تولید این غله را در کشورهای در حال توسعه و ایران با بحران مواجه نموده است. لذا نیاز به اصلاح این گیاه و بهره گیری از ارقام محلی، بومی و خویشاوندان وحشی آنها برهیچکس پوشیده نیست. برای بهره گیری از این قبیل مواد ژنتیکی، باید ذخایر توارثی جمع آوری و نگهداری شوند. البته این نکته نیز حایز اهمیت است که جمع آوری ذخایر توارثی، بدون اطلاع از روابط خویشاوندی فایده چندانی ندارد و استفاده از مواد ژنتیکی ارزیابی نشده در پروژه های به نژادی باعث بالا رفتن هزینه های پروژه و عدم موفقیت آن می گردد. بنابراین پس از جمع آوری مواد مختلف ژنتیکی، باید نسبت به ارزیابی آنها در سطوح مختلف مورفولوژیکی،پروتئینی و مولکولی اقدام نمود (

کریمی .(۱۳۶۸

امروزه یک از روشهای ارزیابی تنوع ژنتیکی در بین ذخایر توارثی، استفاده از انواع مختلف نشانگرهای

تصادفی، نیمه تصادفی و انتخابی DNA است که استفاده از چنین روشهایی مورد تایید جوامع مختلف علمی می
باشد. تفاوت موجود بین ردیف DNA کروموزومهای هر موجود زنده که از والدین به نتاج منتقل می شود، می
تواند بعنوان یک نشانگر بکار رود( قره یاضی .(۱۳۷۷

ما در این پژوهش از دو نشانگر مولکولی تصادفی(RAPD( Random amplified polymorphic DNAs

و نشانگرنیمه تصادفی ISJ ( Intron Splicing Junction) استفاده نمودیم.

در تکنیک RAPD یا چندشکلی قطعات حاصل از تکثیر تصادفی از یک نوع آغازگردارای توالی تصادفی برای تکثیر استفاده می کنیم. این آغازگر به طور تصادفی به نقاط مختلفی از ژنوم متصل می شود و باعث تکثیر آن نقاط می گردد. سپس فرآورده های حاصله را برروی ژل الکتروفورز لود می شوند تا تفاوتهای مهاجرتی آنها آشکار گردد. این تفاوتهای در مهاجرت نشاندهنده تفاوت در طول ناحیه تکثیر شده می باشد .(Williams et al 1990)

نشانگرRAPDدر بسیاری از گیاهان زراعی کاربرد دارد ولی برای تجزیه و تحلیل مولکولی گیاهانی با ژنوم بزرگ و پیچیده مانند گندم مناسب نیست. بنابراین استفاده از آغازگرهای تغییریافته، قدم مهمی برای جایگزینی آن به حساب می آید. نشانگر ISJ نشانگر جایگزین در این پژوهش بود(.(Gawel et al 2002 پرایمرهای این نوع نشانگر براساس نواحی اتصال اینترون- اگزون ( Intron-exon splicing junction) طراحی شده است که برای انگشت نگاری DNA جایگزین مناسبی نسبت به RAPD و سایر نشانگرهای پرهزینه می باشد .( Rafalski et al 2002) به نظر می رسد که این تکنیک برای تمامی گیاهان قابل استفاده باشد، زیرا این تکنیک براساس توالیهای حفاظت شده بوده و مکانهای اتصال بسیار اختصاصی را مورد هدف قرار می دهند. این توالیها می توانند مکانی برای اتصال آغازگرهای PCR باشند که برمبنای آن آغازگرهای نیمه تصادفی را طراحی نمود آنگاه می توان با استفاده از این آغازگرها PCR

انجام داد .(Nowoseielski et al 2002) این دسته ازآغازگرها دارای توالیهای ۱۰-۱۸ نوکلئوتیدی هستند که به نوبه خود شامل دودسته از آغازگرهای هدف گیرنده اگزون یا ET ( Exon Targeting) و هدف گیرنده اینترون یا IT( Intron Targeting) می باشند. چندشکلی ناشی از این نوع آغازگرها ناشی از تفاوت در تکثیر قطعاتی از ژنوم است که رونویسی می شوند(.( Rafalski et al 2002 پس از PCR آغازگرهای ET نواحی اگزونی و آغازگرهای IT نواحی مربوط به اینترون ژنها را تکثیر می کنند و از این نظر با هم متفاوت هستند(.(Nowoseielski et al 2002 آغازگرهایIT وET دارای دمای اتصال مشابه با دمای آغازگرهای RAPD بوده و می توانند در ترکیب با آنها مورد استفاده قرار گیرند. این قبیل آغازگرها دارای دو نوع توالی مشتمل بر نوکلئوتیدهای حفاظت شده و نوکلئوتیدهای تصادفی می باشند و به همین علت به آنها آغازگرهای نیمه تصادفی گویند(.(Gawel et al 2002 آغازگرهایET شامل دوناحیه هستند، قسمت اول(یا انتهای ( ۵ ΄ اختصاصی است و به نواحی حفاظت شده ای از مکان هدف اینترون اتصال می یابد، (در آغازگرهای IT انتهای ۳΄ اختصاصی است). بخش دوم آغازگر به طور تصادفی طراحی می شود (Weining et al .1991) در مقایسه با RAPD ، الگوی باندی حاصل از آغازگرهای نیمه تصادفی از پیچیدگی کمتر و چندشکلی بالاتری برخوردار است .( Rafalski et al 2002)

رافالسکی و تینگی تنوع ژنتیکی اینبرد لاینهای ذرت را با استفاده از آغازگرهای نیمه تصادفی مطالعه نمودند و برتری این آغازگرها را برآغازگرهای تصادفی اثبات نمودند(. ( Rafalski et al 1993 تاکنون پژوهشی در ایران برروی گندم نانوایی با استفاده از آغازگرهای نیمه تصادفی گزارش نشده است و این پژوهش در نوع خود اولین در ایران به حساب می آید.

مواد و روشها

۲۰ رقم و توده محلی گندم نانوایی از مرکز تحقیقات سیستان تهیه شد. نمونه های مربوطه در گلدانهای پلاستیکی و در محل مرکز زیست پژوهشی علوم سلولی و مولکولی ( بیوسنتر) کاشته شد. سپس DNA ژنومی از برگهای جوان با اندکی تغییرات به روش دلاپورتا و همکاران استخراج گردید(.( Dellaporta et al 1983 آنگاه با استفاده از ژل آگارز %۱ کیفیت نمونه ها ارزیابی شد که باندهای پررنگ و بدون کشیدگی مشاهده گردید. نسبت جذب نور UV در طول موج ۲۶۰ به ۲۸۰ نانومتر در محدوده ۱/۷ – ۱/۹ بود که حکایت از کیفیت مناسب نمونه ها داشت. برای تعیین کمیت نمونه ها از دستگاه بیوفتومترو الکتروفورز ژل آگارز براساس غلظتهای معین DNA فاژ لامبدا استفاده نمودیم. سپس غلظت تمامی نمونه های DNA را برروی ۳۰ نانوگرم بر میکرولیترتنظیم کردیم. در مرحله بعد نسبت به بهینه سازی شرایط PCR اقدام نمودیم. در نهایت مقدار مناسب DNA در هر واکنش ۳۰ میکرولیتری برابر ۱۰ نانوگرم،کلرید منیزیوم ۳/۵ میلی مولار و آنزیم ۲ واحد در هر واکنش تعیین گردید که در کلیه آزمایشات از این مقادیر استفاده شد. ۲۸ آغازگر تصادفی و نیمه تصادفی برای تکثیر مورد استفاده گردید. در این میان ۷ آغازگر IT و ۱۱ آغازگر ET و ۱۰ آغازگر RAPD بکار رفتند. برنامه مربوط به آغازگرهای نیمه تصادفی عبارت بود از: ۵۰ ثانیه در ۹۴ درجه سانتیگراد، ۵۰ ثانیه در ۵۰ درجه برای آغازگرهای ۱۵ تایی و ۵۰ ثانیه در ۵۳ درجه برای آغازگرهای ۱۸ تایی، ۹۰ ثانیه در ۷۲ درجه که برنامه مذکور به تعداد ۳۸ سیکل تکرار گردید و در نهایت نیز یک برنامه تکمیلی بسط به مدت ۸ دقیقه در ۷۲ درجه انجام گرفت. برای آغازگرهای تصادفی نیز از برنامه ای مشابه فوق استفاده گردید و فقط دمای اتصال برابر ۳۴ درجه در نظر گرفته شد. تجزیه و تحلیل های مربوطه توسط نرم افزارهای آماریNTSYS 2.02 ، SPSS 12.00 و SAS 8.00 انجام گرفت.