مقدمه:

Rituximab با نام هاي تجاري Riyuxan و MabThera یک آنتی بادي مونوکلونال کایمریک بر علیه پروتئین CD20 است که در ابتدا بر روي سطح سلولهاي B سیستم ایمنی بدن یافت شد وبراي درمان بیماریهایی که با تعداد زیاد سلولهاي B، سلولهاي B با فعالیت بیش از حد یا سلولهاي Bنا کار آمد مشخص شده اند، شامل بسیاري از لنفوماها “لوسمی “رد پیوند بافتی و اختلالات اتوایمیون می شود۱] و.[۲ لنفوماي غیر هوچکین (NHL)یک بدخیمی لنفوسیتها است که در %۸۰ موارد منشاء آن از سلولهاي B می باشد. با گسترش آنتی بادیهاي منوکلونال (mAbs) ایمیونوتراپی با آنها و نشاندار کردن آنها با مواد رادیواکتیو جهت سلولهاي لنفوما به عنوان هدف آغاز شد. در بیماران مبتلا به لنفوم فولیکولار مقاوم یا عود کننده، آنتی بادیهاي مونوکلونال نظیر Rituximab بطور موفقیت آمیزي مورد استفاده قرار گرفته اند.[۳]کلرآمینT یا نمک سدیم n کلرو-۴ متیل- بنزن سولفون آمید، عامل اکسید کننده بوده که I⁺ کاتیونیک را از Iˉ(Iodide)ایجاد می کند تا بر روي ریشه تیروزین آنتی بادي ها قرار گیرد و اولین بار توسط Hunter و Greenwood براي یدیناسیون پروتئینها به کار رفته است .[۴] کلرآمینT در محلولهاي مایی، هیپوکلرو اسید تشکیل داده که اسید حاصل اکسیداسیون ملایم مورد نیاز را فراهم می کند. شرایط واکنش یدیناسیون به راحتی با تغییر غلظت مواد واکنش دهنده، درجه حرارت و زمان قابل کنترل می باشد. واکنش یدیناسیون به روش کلرآمینT ، با اضافه کردن عامل احیاء کننده (معمولا” سدیم متا بی سولفیت) به مقدار اضافی خاتمه می یابد.[۵]

Franker و Speck اولین بار یدوژن را به عنوان معرف یدیناسیون پروتئین ها به کار بردند .[۶] یدوژن یا ۱,۳,۴,۶-tetrachloro-3α,۶α- Diphenylglycourilبینهایت پایدار بوده و در آب تقریبا” نا محلول است و باعث یدیناسیون سریع در فاز جامد در محلول هاي مایی ید و پروتئین ها می شود. یدوژن در کلروفرم یا متیلن کلراید حل می شود و سپس از دیواره هاي داخلی ظرف تبخیر شده و در دسیکاتور نگهداري می شود. مخلوط یدیناسیون حاوي آنتی بادي و Na131I در بافر مناسب به ظرف پوشش داده شده با یدوژن اضافه می شوند. واکنش به صورت Interfaceبه مدت ۵ تا ۱۵ دقیقه ادامه یافته و سپس با انتقال مخلوط واکنش به ظرف دیگري خاتمه می یابد. بنابراین نیازي به اضافه نمودن معرف احیاء کننده یا سانتریفیوژ مخلوط واکنش نمی باشد.[۷]

روش کار:

آنتی بادي آنتی CD20 از شرکت اف هافمن- لارویش بازل سوئیس که توسط شرکت شیمی درمانی سبحان رشت بسته بندي و توزیع می شود بصورت ویال حاوي ۱۰۰ میلی گرم آنتی بادي در ۱۰ میلی لیتر تهیه شد.در آیودیناسیون به روش کلرآمین-T، به تیوب حاوي ۱ میلی گرم آنتی بادي بافر فسفات ۰/۵ مولار با pH=7، ۵ میلی کوري سدیم ایوداید-۱۳۱ ، محلول ۲ میلی گرم در میلی لیتر بافر فسفات ۰/۰۵ مولار اضافه و به مدت ۴۵ ثانیه بهم زده شد، به منظور متوقف کردن واکنش محلول ۲ میلی گرم سدیم متا بی سولفیت در یک میلی لیتر از بافر فسفات ۰/۰۵ مولار و محلول ۱۰ میلی گرم در پتاسیم ایوداید در یک میلی لیتر بافر فسفات ۰/۰۵ مولار به ظرف واکنش افزوده شد. این مخلوط بلافاصله به منظور جداسازي به ستون سفادکس G-25 منتقل شد و با فاز متحرك فسفات بافر سالین با pH=7شستشو داده شد.پایداري آن در فواصل زمانی ۱و۳ و ۲۴ ساعت با استفاده از روش کروماتوگرافی کاغذي و فاز متحرك فسفات بافر سالین بررسی شد. به منظور بررسی توزیع بیولوژیکی آنتی بادي نشاندار شده با ید-۱۳۱ از موش سوري استفاده شد. آزمایش در سري هاي ۳ تایی موش سوري انجام گردید به این منظور به هر موش ۱۰۰ میکرولیتر آنتی بادي نشاندار شده با اکتیویته ۱۰۰ میکرو کوري تزریق شد و در زمانهاي ۴ ، ۲۴ و ۴۸ ساعت بعد از تزریق موشها با استفاده از گاز دي اکسید کربن کشته شدند و خون، قلب، کبد، کلیه ها، طحال، معده، روده، تیرویید، ریه ها، دم و بقیه بدن جدا و در دستگاه شمارنده گاما شمارش شدند، سپس درصد دوز تزریق شده در گرم بافت محاسبه گردید. ایمونوراکتیویته از روش Lindmoمحاسبه شد. تعداد ۶× ۱۰۷ از سلولهاي RAJI (آنتی ژن CD20در سطح این سلولها به مقدار زیاد یافت میشود) شمرده و داخل ۱ سی سی محیط کشت شناور شد. در ۵ ظرف دیگر تعداد سلولها را به ترتیب نصف تعداد سلولها در ظرف قبل ریخته، ترکیب -Ritoximab131Iبر روي سلولها اثر داده شد. بعد از گذشت ۲ ساعت سلولها سانتریفیوژ و چند بار شسته شدند تا فقط اکتیویته متصل به سلولها باقی بماند. منحنی اکتیویته متصل به سلولها بر علیه عکس تعداد سلولها رسم می شود که شیب این منحنی درصد آنتی بادي هاي نشاندار فعال پس از نشاندارسازي را نشان می دهد.در روش یدوژن ، به لوله پوشش داده شده، ۱ میلی گرمآنتی بادي و ۳۰ میلی کوري سدیم ایوداید( ید-(۱۳۱و بافر سدیم

فسفات ۰/۵ مولار pH=7.4اضافه شد. پس از ۱۰ دقیقه بافر سدیم فسفات ۰/۰۵ مولار حاوي ۱ مولار سدیم کلراید pH= 7.4 اضافه و مخلوط به منظور خاتمه واکنش به ویال دیگري منتقل و به مدت ۱۰ دقیقه در دماي محیط انکوبه شد، سپس بافر سدیم فسفات ۰/۰۵ مولار حاوي %۰/۵ سرم آلبومین گاوي pH= 7.4به مخلوط اضافه و بر روي ستون سفادکس G-25با استفاده از همین بافر جداسازي گردید (راندمان نشاندار سازي .(%۹۴ پایداري و بررسی ایمینوري اکتیویتی مطابق روش کلرآمین-T انجام شد. توزیع بیولوژیکی مشابه روش کلرآمین-T در فواصل زمانی ۳ و ۲۳ ساعت انجام گردید.

نتایج:

راندمان نشاندار سازي یک میلی گرم آنتی بادي با ۵ میلی کوري ید- ۱۳۱ به روش کلر آمین-T ، %۸۶ و در روش یدوژن با ۳۰ میلی کوري ید-%۹۴ ۱۳۱ بود و آزمایش پایداري نشان داد که آنتی بادي نشاندار شده با روش کلرآمین-T در فسفات بافر سالین در دماي ۴ درجه سانتیگراد تا ۲۴ ساعت بعد از نشاندارسازي تا %۷۰ (نمودار (۱ و در روش یدوژن تا %۸۲ (نمودار (۲ پایداري خود را حفظ کرده است.

نمودار -۱پایداري آنتی بادي نشاندار شده با ید-۱۳۱ به روش کلرامین-T در زمانهاي ۱و۳و۲۴ ساعت در ۴ درجه سانتیگراد

نمودار -۲ پایداري آنتی بادي نشاندار شده با ید-۱۳۱ به روش یدوژن در زمانهاي ۱و۳و۲۴ ساعت در ۴ درجه سانتیگراد

درصد بالاي آنتی بادي در خون نسبت به سایر اندامها در هر دو روش نشانگر نسبت بالاي Target/Nontargetمی باشد(نمودار ۳ و .(۴