مقدمه

حشرهکشهای شیمیایی به دلایل متعدد از جمله قدرت کنترل سریع حشرات سالهای متمادی بر علیه آفات گوناگون مصرف شدهاند ولی مشکلاتی نظیر مقاومت آفات و افزایش آگاهی جوامع بشری نسبت به اثرات سوﺀ زیست محیطی آنها باعث شده است که مصرف بسیاری از این ترکیبات منسوخ و یا محدود شود و در حال حاضر برای کنترل آفات استفاده از عوامل بیولوﮊیکی از جمله عوامل بیماریزای حشرات بیشتر مد نظر میباشد (٧). در این راستا بکارگیری باکتری Bacillus

از اهمیت خاصی برخوردار است (١).

مکاتبه کننده: علی اصغر پورمیرزا

این باکتری از مهمترین عوامل بیماریزای حشرات بوده و فرمولاسیونهای آن ٩٢ درصد مصرف حشرهکشهای بیولوﮊیک جهان را تشکیل میدهد (١٧). باکتری B.t. با تولید نوعی پروتئین سمی اثر حشرهکشی شدید روی لارو برخی از حشرات به ویژه بالپولکداران دارد (١) ولی فرمولاسیونهای آن در طبیعت پایداری کمی دارند و این سبب میشود تا مصرف آنها محدود گردد (٥، ٢٠). از میان عوامل طبیعی پرتوهای فرابنفش نور خورشید مهمترین عامل کاهش دهنده اثر فرآوردههای B.t.

میباشد (٣، ٤، ٩، ٢٠). پژوهشگران تلاش کردهاند تا با کپسوله نمودن این باکتری اثرات منفی پرتوهای نور خورشید را کاهش

٨٥٦ مجله علوم کشاورزی ایران، جلد ٣٤، شماره ٤، سال ١٣٨٢

دهند و در این راستا با تولید فرمولاسیونهای کپسوله شده باکتری حاوی مواد همراه توانستهاند اسپورها و کریستالهای آنرا از اثرات سوﺀ تابش خورشید تا حدودی حفظ نمایند (٣، ٨، ١٤، ١٥، ١٦). در بین حفاظتکنندههای باکتری، قرمز کنگو مؤثرترین ترکیب معرفی شده است (١٩) ولی کاربرد آن توجیه اقتصادی ندارد (٦). مقاومت آفات در برابر B.t. میتواند عامل محدودکننده دیگری در افزایش میزان مصرف آن باشد و بنابراین لازم است که با افزایش کارایی باکتری از سرعت بروز پدیده مقاومت نیز کاسته شود (١٠، ١٣). با توجه به اهمیت افزایش کارآیی B.t. در کنترل حشرات، در دانشگاه ارومیه در سال ١٣٧٨ امکان بکارگیری مواد همراه ارزان قیمت در تولید فرمولاسیونهای کارآمد و پایدارتر B.t. در برابر نور خورشید مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

پروانههای مومخوار بزرگ در سال ١٣٧٨ از زنبورداری دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه جمعآوری گردید و در اتاق پرورش با دمای ٢ ±٣٠ درجه سانتیگراد، رطوبت نسبی ٥±٥٥ درصد، ١٤ ساعت روشنایی و ١٠ ساعت تاریکی برای نسلهای متعدد برروی غذای مصنوعی پرورش داده شد (١١) و آزمایشها نیز در همین محل انجام یافتند.

برای تشخیص سن لاروی اندازه عرض کپسول سر و وزن لارو مد نظر قرار گرفت و برای سهولت کار از لارو سن پنجم استفاده گردید.

نمونه اولیه باکتری B.t. در محیط کشت مایع تکثیر و شمارش اسپورها در شرایط سترون انجام شد و با رقیقسازی محلول حاوی ٩- ١٠تهیه گردید.

آزمایشهای مقدماتی زیستسنجی حداقل و حداکثر غلظت باکتری فاقد مواد همراه برای ایجاد ٢٠ و ٨٠ درصد تلفات در لارو سن پنجم را به ترتیب ٥٠٠٠ و ٥٠٠٠٠ قسمت در میلیون مشخص نمود با استفاده از فواصل لگاریتمی غلظتهای٣١٥٤٨، ١٩٩٠٥، ١٢٥٥٩ و ٧٩٢٤ قسمت در میلیون نیز تعیین گردید.

برای هر غلظت از ١٠ عدد لارو استفاده شد و آزمایش به روش استاندارد (١٠) و در ٣ تکرار انجام یافت.

برای تهیه هشت فرمولاسیون کپسوله شده، ابتدا ٨ عدد

تشتک پتری انتخاب و در داخل هر یک ٣ گرم محیط کشت حاوی باکتری ریخته شد سپس با توجه به نوع فرمولاسیون، طبق جدول (١) مواد همراه با نسبتهای یک درصد قرمز کنگو (CR)، ٥ درصد ملاس چغندرقند (M) و ٥ درصد حنا (H) به آنها اضافه گردید و سپس ٣ گرم نشاسته (St) پیش ﮊلاتینه به هر یک افزوده شد و وزن مواد داخل هر تشتک پتری مشخص گردید.

جدول ١- مقادیر به کار رفته از مواد همراه در هر فرمولاسیون

برحسب گرم

حنا ملاس چغندرقند قرمز کنگو فرمولاسیون
١٥/٠ ١٥/٠ ٠٣/٠ ١
٠ ١٥/٠ ٠٣/٠ ٢
١٥/٠ ٠ ٠٣/٠ ٣
١٥/٠ ١٥/٠ ٠ ٤
٠ ٠ ٠٣/٠ ٥
٠ ١٥/٠ ٠ ٦
١٥/٠ ٠ ٠ ٧
٠ ٠ ٠ ٨

مقدار باکتری به کار رفته در هر فرمولاسیون طوری انتخاب شد که از اختلاط هر فرمولاسیون به نسبت ١٠ درصد با غذای مصنوعی، میزان باکتری موجود در ماده غذایی برابر با ٢٠٠٠٠

قسمت در میلیون بود. در کپسوله نمودن باکتری از قرمزکنگو، ملاسچغندرقند و حنا به تنهایی یا مخلوط با یکدیگر استفاده شد. در تهیه ٨ فرمولاسیون غیر کپسوله ،مواد همراه به تنهایی یا در اختلاط با هم به ٣ گرم از محیط کشت حاوی باکتری اضافه گردید. بنابراین در کل ١٦ فرمولاسیون تهیه شد.

برای تابشدهی فرمولاسیونها ابتدا هر یک از ١٦ فرمولاسیون به ٣ گروه تقسیم گردید بدین ترتیب هر گروه ١٦ تایی دارای ٨ فرمولاسیون کپسوله شده و ٨ فرمولاسیون کپسوله نشده بود. کلیه تشتکهای پتری در مقابل نور خورشید قرار داده شدند و روی تشتک های پتری گروه I در شیشهای گذاشته شد تا از عبور پرتو فرابنفش B جلوگیری شود. پس از ٢٤ ساعت روی گروه II فرمولاسیونها با در شیشهای پوشانیده شد. روی گروه III فرمولاسیونها ٤٨ ساعت بعد از شروع آزمایش با در شیشهای مسدود گردید.

٨٥٧

زارعی و همکاران: تولید کپسولهای نشاستهدار باکتری …

برای بررسی اثر کشندگی فرمولاسیونها روی لارو، آزمایش فاکتوریلی با طرح بلوکهای کامل تصادفی که فاکتور A نوع فرمولاسیون و فاکتور B طول زمان تابشدهی بود در ٥ تکرار انجام یافت و در هر تکرار از ٩ عدد لارو سن پنجم استفاده شد.

داخل ظرف یکبار مصرف ١٠ گرم ماده غذایی حاوی مقدار مشخصی از یک فرمولاسیون ریخته شده و سپس لاروها به ظرف منتقل گردیدند و تلفات بعد از ١٢٠ ساعت یادداشت شد.

جهت بررسی میزان کارآیی فرمولاسیونها در مقابل تابش خورشید ازدرصد OAR١ استفاده گردید. این مقادیر طبق رابطه

١٠٠× درصد تلفات بعد از تابش %OAR= درصد تلفات قبل از تابش

محاسبه شد. برای بررسی اثر مواد همراه در وزن لاروها، آزمایشی با طرح کرتهای کاملا تصادفی با ٤ تیمار و یک شاهد

ﻭ در ٥ تکرار انجام گردید و در هر تکرار از ٦ عدد لارو سن پنجم استفاده شد. قرمز کنگو، ملاس چغندرقند، نشاسته و حنا با نسبتهای بیان شده به ماده غذایی اضافه گردیده و لاروها روی آنها پرورش یافتند و بعد از یک هفته وزن هر لارو تعیین گردید.

در تعیین میزان جذب پرتو فرابنفش توسط مواد همراه از طیفسنج دیجیتالی استفاده شد. از قرمز کنگو، ملاس چغندرقند و حنا به ترتیب غلظتهای ١، ٥ و ٥ درصد محلول استاندارد با آب تهیه گردید و طیفسنج برای طول موجهای بین ٢٠٠ تا ٤٠٠ نانومتر تنظیم شده و با رسم نمودار میزان جذب پرتو فرابنفش برای هر کدام مشخص گردید.

در بررسی پایداری فرمولاسیونها به ١ گرم از هر فرمولاسیون ٣٠ میلیلیتر آب اضافه گردیده و سپس به خوبی تکان داده شد. پس از ١٠ دقیقه میزان رسوبدهی تعیین گردید

ﻭ به فرمولاسیونهایی که رسوب داده بودند ١ گرم شکر اضافه گردیده و دوباره تکان داده شد پس از ١٠ دقیقه میزان رسوبدهی مجددا مورد ارزیابی قرار گرفت.

نتایج

شمارش اسپور با غلطت ٦-١٠ و در ٥ تکرار صورت گرفت و میانگین تعداد اسپور موجود در هر میلیلیتر از محیط کشت
٧ ١٠ × ٥ عدد بر آورد شد.

مقدار ٥٠ LC باکتری فاقد مواد همراه بعد از ١٢٠ ساعت برای لارو سن پنجم ١٩٣٩١ قسمت در میلیون برآورد گردید و معادله رگرسیونی لگاریتم غلظت باکتری (x) و پروبیت در صد تلفات لارو (y) با ٢ r مساوی ٨٥ درصد به صورت x٥/٣+٢y=

برآورد شد.

نتایج تاثیر فرمولاسیونها بر روی لارو نشان داد که در گروه

I، فرمولاسیونهای کپسوله شده و کپسوله نشده حاوی ملاس و حنا به ترتیب ٨٠ و ٨/٧٧ درصد تلفات در لارو ایجاد کردند. در گروه II فرمولاسیون کپسوله شده دارای ملاس و حنا با ٣/٧٣ درصد بیشترین تلفات را بوجود آورد. در گروه III فرمولاسیون کپسوله شده حاوی ملاس و حنا ٩/٦٨ درصد تلفات در لارو ایجاد نمود. بین فرمولاسیونها (فاکتور (A تفاوت معنیدار مشاهده گردید و طول زمان تابش پرتو فرابنفش (فاکتور (B در کارآیی فرمولاسیونها تاثیر معنیداری داشت و این دو فاکتور روی یکدیگر اثر متقابل معنیدار نشان دادند (جدول ٢).

جدول ٢ – تجزیه واریانس آزمایش فاکتوریل پس از تبدیل درصد

تلفات به آرک سینوس x

منابع تغییر درجه مجموع مربعات میانگین مجموع نسبت F
آزادی مربعات

بلوک ٤ ٢٢٠/١٢ ٠٥٥/٣ ns ١٤/٠
فاکتور A (فرمولاسیون) ١٥ ٠٢٤/١٢٧١٥ ٦٦/٨٤٧ ٭٭ ٠٨/٣٩
فاکتور B (زمان تابش) ٢ ٨٥٤/٤٧١٠ ٤٢/٢٣٥٥ ٭٭ ٦٠/١٠٨
اثر متقابل ٣٠ ٨٣٦/٤٢٩٥ ١٩/١٤٣ ٭٭ ٦٠/٦
اشتباه ١٨٨ ٢١٧/٤٠٧٧ ٦٨٧/٢١
کل ٢٣٩ ١٥١/٢٥٨١١ ٧٠/٠٩CV=%

:ns در سطح پنج درصد معنیدار نیست.

در تجزیه و تحلیل دادهها برای تعیین مقادیر ٥٠LC از برنامه رایانهای SPSS و گزینه Probit استفاده شد. نتایج به

٭٭

: در سطح یک درصد معنیدار است.

دست آمده از آزمایش فاکتوریل و طرح کرتهای کاملا تصادفی با نرم افزار MSTATC تجزیه و تحلیل گردید.

گروهبندی میانگین تیمارها به روش آزمون چند دامنه دانکن نشان داد که فرمولاسیونهای دارای (نشاسته پیش ﮊلاتینه+ ملاس+ حنا)، (قرمزکنگو+ حنا + ملاس) و (نشاسته

۱٫ Original Activity Remaining

٨٥٨ مجله علوم کشاورزی ایران، جلد ٣٤، شماره ٤، سال ١٣٨٢

پیش ﮊلاتینه+ حنا+ ملاس+ قرمز کنگو) در یک گروه قرار گرفته

ﻭ حداکثر تلفات را بر لارو وارد ساختند و فرمولاسیون باکتری بدون مواد همراه با فرمولاسیون حاوی فقط حنا، یک گروه را تشکیل داده و کمترین تلفات را در لاروها ایجاد نمودند. در گروهبندی سطوح زمان تابش (فاکتور (B معلوم گردید که تیمارهای مربوط به گروههای I، II و III به ترتیب در سه دسته متمایز a، b و c قرار میگیرند و بیشترین تلفات لارو مربوط به گروه I بوده و کمترین تلفات لارو در گروه III میباشد. بررسی اثر متقابل نشان داد که فرمولاسیونهای (نشاسته + حنا) متعلق به گروه I و (نشاسته + قرمز کنگو) مربوط به همین گروه بیشترین تلفات و فرمولاسیونهای (B.t.) مربوط به گروههای II

ﻭ III کمترین تلفات را به لارو وارد کردند. مقدار کم ضریب تغییرات حاکی از دقت مطلوب آزمایش میباشد.
در بررسی کارآیی فرمولاسیونها در برابر تابش خورشید، جدول ٣ نشان میهد که در گروه II فرمولاسیون ردیف ١ که ١ روز تحت تابش نور خورشید دارای پرتو فرابنفش بود کارآیی

خود را کاملا حفظ نموده و میزان تاثیر آن نسبت بهشاهد(.(B.t

٦/٢ برابر میباشد. پس از آن فرمولاسیونهای ردیفهای ٥، ٢، ١٠، ٣، ٩، ٦، ١٣ و ٤ کارآیی خوبی را نشان دادهاند و میزان تاثیر نسبی آنها از ٣٨/٢ تا ٥٢/٢ برابر تیمار شاهد بوده است از این جدول در مورد گروه III معلوم میگردد فرمولاسیون ردیف ١ پس از آنکه ٢ روز تحت تابش نور خورشید دارای پرتو فرابنفش بوده است کارآیی خود را کاملا حفظ نموده و میزان تاثیر نسبی آن ٢/٥ برابر شاهد میباشد و پس از آن فرمولاسیونهای ردیفهای ٥، ٢، ٣، ٩، ١٠، ٦، ١٣ و ٤ تاثیر خوبی را نسبت به تیمار شاهد داشتهاند و این مقادیر از ٤٨/٤ تا ٠٤/٥ برابر متغییر میباشد.