چکیده

-Lتریپتوفان یکی از اسیدآمینه هاي ضروري است که در صنایع غذایی به عنوان مکمل غذایی و قوام دهنده و در صنایع دارویی به صورت محلول هاي تزریقی در درمان افسردگی، اسکیزوفرنی و الکلیسم کاربرد دارد(.(۶ بهترین روش تولید صنعتی این اسیدآمینه استفاده از سلول هاي میکروبی تثبیت شده ي داراي فعالیت بالاي تریپتوفان سنتتاز براي تبدیل زیستی ایندول و -Lسرین به -Lتریپتوفان می باشد(.(۱در این پژوهش به تثبیت سلول هاي E.coli در آلژینات و بررسی میزان تولید -L تریپتوفان توسط این سلول ها پرداخته شده است و هدف گام برداشتن در مسیر تولید نیمه صنعتی این اسیدآمینه در ایران می باشد . از سلول هاي E.coli ATCC 11303 کشت داده شده بروي اسلنت محیط کشت کمپلکس، سوسپانسیون تهیه شد و به محیط کمپلکس مایع به عنوان محیط پیش کشت تلقیح شد سپس سوسپانسیون سلولی تهیه شده از محیط پیش کشت به محیط کشت حداقل داراي ایندول (فعال کننده ي -Lتریپتوفان سنتتاز) و ملاس چغندرقند(منبع کربن و انرژي ارزان قیمت) تلقیح شد و بیوماس سلولی در فاز سکون جمع آوري شد بیوماس در آلژینات تثبیت شد و دانه هاي حاوي باکتري به محیط واکنش حاوي ایندول، -L سرین و PLP انتقال داده شد و میزان تولید -L تریپتوفان از طریق ۱ TLCو۲ HPLCمورد ارزیابی قرارگرفت. میزان تولید برآورد شده در ۶،۲۴ و۴۸ ساعت پس از قرارگیري دانه ها در محیط واکنش به ترتیب ۰/۰۸، ۰/۹۵۵ و ۲/۱۱۴ mg/100ml بود. میزان تولید بدون بهینه سازي شرایط بسیار مناسب بود و با بهینه سازي می توان فرآیند را براي تولید نیمه صنعتی بهبود بخشید.

کلمات کلیدي: تریپتوفان سنتتاز، آلژینات، تثبیت، TLC، HPLC

کروماتوگرافی لایه نازک ۱
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا ۲

مقدمه

سنتز -Lتریپتوفان و سایر اسیدآمینه هاي ضروري در مقیاس صنعتی مورد توجه روزافزون واقع شده است. این اسیدآمینه ها فقط توسط گیاهان و میکروارگانیسم ها تولید می شوند بنابراین دستیابی به روش هاي کارا براي تولید این ترکیبات اهمیت زیادي دارد. امروزه بیشتر اسیدآمینه ها از طریق فرآیندهاي میکروبی بدست می آیند. برتري این فرآیندها به فرآیندهاي شیمیایی این است که در این فرآیندها اسیدآمینه هاي تولیدشده به فرم فعال L می باشند درصورتیکه در فرآیندهاي شیمیایی مخلوط راسمیک اسیدآمینه ها تولید می شود و یک مرحله ي اضافی براي جداسازي انانتیومرها نیاز است.

سه روش اصلی براي تولید میکروبی –Lتریپتوفان وجود دارد: تولید تخمیري مستقیم از کربوهیدرات ها، تولید تخمیري از یک پیش ساز، تولید آنزیمی از پیش سازهاي متنوع(.(۲ بهترین و مقرون به صرفه ترین روش تولید صنعتی -L تریپتوفان استفاده از سلول هاي تثبیت شده براي تبدیل زیستی -L سرین و ایندول به -Lتریپتوفان در واکنش یک مرحله اي است. مزیت استفاده از سلول هاي تثبیت شده، حفظ و ثبات فعالیت سلول ها بعد از اتمام واکنش و بنابراین امکان استفاده ي مجدد آن ها می باشد که به این ترتیب در هزینه و زمان لازم براي کشت مجدد و تهیه کاتالیزور زیستی براي انجام واکنش هاي بعدي صرفه جویی خواهد شد(.(۱ همچنین در این روش به دلیل استفاده از پیش سازهاي -L تریپتوفان و تولید آن طی یک واکنش یک مرحله اي، مسیر کامل بیوسنتز –Lتریپتوفان انجام نمی شود و نیاز به استفاده از موتاسیون هاي پیچیده براي کنترل مکانیسم تنظیمی نمی باشد. اولین بار از سلول هاي تثبیت شده در تولید ترکیبات مهمی مانند – Lمالیک اسید و -L آسپارتیک اسید در مقیاس صنعتی استفاده شد(.(۵ امروزه بسیاري از کمپانی ها ازجمله Deggusa در تولید -Lتریپتوفان از این روش استفاده می کنند.

مواد و روش ها

E.coli ATCC 11303 بروي اسلنت محیط کشت کمپلکس رشد داده شد و ۱/۵ mlسوسپانسیون سلولی، معادل ۱ مک فارلند، به ارلن مایر ۵۰۰ml اي حاوي ۱۰۰ml محیط کشت کمپلکس (به عنوان پیش کشت) تلقیح شد و در انکوباتور شیکردار در دماي ۳۷˚C و دور ۱۸۰ rpm به مدت ۶ ساعت انکوبه شد. رشد سلولی از طریق اندازه گیري دانسیته ي سلولی توسط اسپکتروفوتومتر در ۶۲۰nm هر یک ساعت ارزیابی شد و ۱۰ml از آن در انتهاي فاز لگاریتمی(ساعت (۶ برداشته شد و در ۱۲۰۰۰rpm به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفوژ گردید و دوبار با سالین %۰/۹ شستشو داده شد و در ۱۰ml سالین جمع آوري شد سپس ۸ml از این سوسپانسیون به ارلن مایر ۲۰۰۰ml اي حاوي ۵۰۰ml محیط کشت حداقل داراي ۰/۰۲۹۲۸g ایندول (به عنوان فعال کننده ي تریپتوفان سنتتاز) و ۸/۱۱g ملاس چغندرقند (به عنوان منبع کربن و انرژي ارزان قیمت) تلقیح شد و در شرایط مشابه بالا انکوبه شد بعد از ۱۴ ساعت انکوباسیون که سلول ها به فاز سکون رسیدند بیوماس سلولی توسط سانتریفیوژ در ۱۲۰۰۰rpm به مدت ۲۰دقیقه جمع آوري شد و دوبار با سالین %۰/۹ شستشو داده شد. ۳۰ ml محلول %۳ آلژینات سدیم در آب مقطر تهیه و استریل گردید و ۱/۵g از بیوماس سلولی به محلول آلژینات اضافه شد و توسط استیرر به مدت ۱۰دقیقه مخلوط یکنواختی حاصل شد این مخلوط از طریق سرنگ انسولین استریل به داخل محلول %۱/۵ کلرید کلسیم در حال استیرر چکانده شد و دانه هاي حاوي سلول هاي E.coli با آب مقطر شستشو داده شد و سپس به ارلن ۵۰۰ml اي حاوي ۱۰۰ml بافر تریس- ۰/۱M) HCl ، (pH8 داراي ۰/۲g ایندول، -L 0/2g سرین و ./۰۰۵g پیریدوکسال فسفات انتقال داده شد((۳ و در ۳۷˚C و ۱۸۰rpm انکوبه شد و از محیط تولید در ساعت ۶، ۲۴ و ۴۸ نمونه گیري شد وTLC ي نمونه ها با سیستم حلال اسیداستیک، آب و -n بوتانول انجام شد سپس نمونه هاي ساعت ۶، ۲۴ و ۴۸ بعد از آماده سازي به دستگاه HPLC تزریق شدند و میزان تولید -Lتریپتوفان در ۲۲۰nm سنجیده شد. دستگاه HPLC ي بکار رفته از نوع (Waters 600E) مجهز به دتکتور (Waters 486) UV و ستون فاز معکوس (۱۰۰×۴mm, MZ- C18