روش های سنتی اصلاح نباتات مبتنی بر دستکاری ساختار ژنتیکی

فصل اول

مقدمه و كليات

فصل اول
مقدمه:
روشهاي سنتي اصلاح نباتات مبتني بر دستكاري ساختار ژنتيكي گياه كامل و از طريق توليد جنسي است. در سالهاي اخير روشي براي دستكاري ژنتيكي در سطح سلولي پيدا شده است كه روشهاي اصلاحي را بطور منحصر بفرد كامل مي كند. موجوديت پيدا كردن روشهاي كشت بافت و سلول را مي توان به پيشرفتهاي ناشي از دانش كشت سلولي و زيست شناسي مولكولي دانست (۴ و ۵۱)

بيوتكنولوژي يا فناوري زيستي مجموعه اي از فنون را تشكيل مي دهد كه امكان بكارگيري، توانايي و كارآيي سلولهاي موجودات زنده اعم از حيواني يا گياهي را فراهم مي سازد. در سالهاي اخير با انجام تحقيقات متعدد در حوزة بيوتكنولوژي كشاورزي اين بخش داراي جايگاه مهم و باارزشي شده است و اين امكان را در رابطه با گياهان زراعي فراهم نموده است كه بسيار مطالب كارآتر از روشهاي كلاسيك اصلاح نباتات با استفاده از تكنيكهاي مختلف از قبيل دست ورزي ژنتيكي (Genetic manipulation)، كشت بافت و سلول گياهي در شرايط In Vitro و غيره، گياهاني با سازگاري متناسب تر و بيشتر به شرايط محيطي و همچنين سازگار با نياز انسانها توليد نمايد.

تكنيك كشت بافت و سلول گياهي در شرايط In Vitro ازجمله فنون بيوتكنولوژي است كه كاربرد آن به اوايل سالهاي ۱۹۵۰ مي رسد. بر اساس اين تكنيك، سلول گياهي يا بافت از اندامهايي مثل ريشه، ساقه، برگ و گل آذين يا هر اندام ديگري از گياه جدا شده و در شرايط كاملاً استريل و گندزدايي شده، در درون لوله هاي آزمايش محتوي محيط غذايي مصنوعي قرار گرفته و با تأمين نيازهاي نوري و حرارتي مناسب تبديل به يك گياه كامل مي گردد. اين تكنيك همانطور كه اشاره شد امكان توليد هزاران گياهچه مشابه گياه مادري را در مدت زمان بسيار كوتاهي و در فضاي فيزيكي بسيار محدودي فراهم مي‌سازد كه با انتقال اين گياهچه ها به سطح گلخانه و مزرعه توليد

انبوهي از گياهان مورد نظر را مي توان باعث شد. در اصلاح نباتات با استفاده از تكنيك كشت بافت و نيز توليد كالوس يا گياهچه ها در مقياس وسيع و انجام گزينش در بين نمونه ها مي توان از ارقام مقاوم به استرسهاي محيطي را توليد نمود. فنون فوق فرصتهاي مناسبي در بخشهاي مختلف تحقيقاتي، اقتصادي بوجود آورده است كه با تقويت بخش دولتي و فعال نمودن بخش خصوصي كارايي اين بخشها را براي تأمين و توليد محصولات اساسي كشور را، بطور قابل ملاحظه اي مي توان افزايش داد. (۵۱ و ۹۸)

تاريخچة اهميت كشت بافت:
مفهوم كشت بافت گياهي خلاصة عبارت كشت پروتوپلاست گياهي، سلول گياهي، بافت و كشت اندام گياهي است. كشت بافت و سلول گياهي بر اساس نظرية شوان مبني بر دارا بودن خاصيت توتي پوتنسي سلولها پايه گذاري شد. توتي پوتنسي خاصيتي است كه بر اساس آن يك سلول داراي توان تبديل شدن به موجود كامل است. در سالهاي اخير، تكنيك كشت بافت گياهي به يك ابزار بسيار قدرتمند براي تكثير و اصلاح بسياري از گونه هاي گياهي تبديل گشته است. اين تكنيك با ابراز نظرية گوتليب هابرلاندت در مورد خاصيت توتي‌پوتنسي در سلول گياهي در آغاز قرن بيستم آغاز گرديد. هارلاند پيشنهاد نمود كه روشهاي جداسازي و كشت اندام گياهي بايد توسعه

يابد و ادعا نمود كه اگر محيط و مواد غذايي سلولهاي كشت شده، دستورزي شده باشند، آن سلولها بايد صفات ارثي مربوط به مراحل رشد و نموي گياه اوليه را تكرار نمايمد. ديدگاه هابرلاند در حقيقت قابل توجه بود زيرا وي حتي بيان داشت كه خارج از سلولهاي سوماتيكي زنده، جنينهاي مصنوعي به صورت غير جنسي رشد و نمو مي يابند.(۵) احتمالاً وايت نخستين كسي بود در سال ۱۹۵۴ مسئله كشت سلولي را به روشني بيان كرد. او بيان داشت كه تفاوتهاي بين سلولهاي ديگر در آن ارگانيسم مي باشد. لذا امكان دارد بتوان با جدا نمودن سلول، پتانسيل نهفته توتي پوتنت را به آنها بازگردانيد. البته احتمال دارد كه اين خاصيت در سلول براي هميشه از دست رفته باشد. اسكوگ و ميلر در ۱۹۵۷ پيشنهاد نمودند كه اثرات متقابل كمي بين اكسين و سيتوكينين نوع رشد و مراحل مورفولوژيك را كه بايد در گياه رخ دهد، تعيين مي كنند. مطالعات آنها در توتون نشان داد كه نسبت بالاي اكسين به سيتوكسين باعث القاي رشد ريشه مي شود؛ درحاليكه نسبت بالاي سيتوكسين به اكسين باعث القاي رشد ساقه ميگردد، هرچند كه اين الگو پاسخ كلي و عمومي نيست. (۱ و ۵ و ۹ و ۹۸)

دستورزي نسبت اكسين به سيتوكينين در بسياري از گونه ها و جنسها براي ريخت زايي موفقيت آميز بوده است. كارهايي كه توسط مورل (۱۹۶۰) روي ازدياد اركيده انجام گرديده است، آغازي براي كاربرد تكنيك كشت بافت گياهي براي تكثير و اصلاح بسياري از گونه هاي گياهي بود كه منجر به توسعه و گسترش استفاده از محيطهاي كشت جديد با غلظتهاي بالاي نمك توسط موراشيگ و اسكوك گرديد.
در سال ۱۹۶۶ نيز گوها و محشوري امكان ايجاد تعداد زيادي از گياهچه هاپلوئيد از دانه داتوره بوسيله كشت بساكهاي نابالغ را ثابت كردند. (۹۸)
در سال ۱۹۷۰ اولين امتزاج موفقيت اميز پروتوپلاست در محيط كشت تحقق يافت. در همين سال انتخاب موتانهاي بيوشيميايي در شرايط آزمايشگاهي صورت گرفت. در ۱۹۷۴ توليد گياهان هيبريد حاصل از امتزاج پروتوپلاستهاي هاپلوئيد به نتيجه رسيد. (۱ و ۹۸)
تحقيقات در زمينه كشت بافت گياهي از سال ۱۹۷۵ به بعد بطور چشمگيري افزايش يافت و از دهة ۱۹۸۰ به بعد به عنوان بخش مهمي از بيوتكنولوژي گياهي مورد توجه بسياري از دانشمندان قرار گرفته است بطوريكه در سال ۱۹۷۷ توسط چلتون و همكاران ادغام موفقيت آميز DNA پلاسميد Ti از Agrobacteriam tumefaciens به گياهان صورت گرفت. (۹۸ و ۱۰۰)

در حال حاضر كشت بافت به عنوان پيش نياز مهندسي ژنتيك از اهميت ويژه اي برخوردار است. از طرفي كشت بافت بعنوان مكمل روشهاي كلاسيك متداول در اصلاح نباتات بكار مي رود نه جايگزين آن (۸۶ و ۱۰۰)

اساس گياه شناسي براي كشت بافت:
ظرفيت طبيعي گياهان به منظور تكثير توسط فرآيندهاي غيرجنسي، اساس تكثير در تكنيك كشت بافت است. كشت بافت به سادگي به ما كمك مي كند تا از پتانسيل طبيعي موجود در گياه براي رشد و تكثير استفاده كنيم كه البته تكنيكي بسيار كارآمد و قابل پيش بيني است (۶۲ و ۹۶)

اهداف مورد نياز با استفاده از تكنولوژيهاي جديد كشت بافت و مهندسي ژنتيك:
• تكثير سريع گياهان جهت استفاده در تحقيقات اصلاحي ژنتيكي.
• توليد گياهان هاپلوئيد و داي هاپلوئيد
• ايجاد هيبريداسيون سوماتيكي بين گونه اي و بين جنسي
• ايجاد موتاسيونهاي القايي

• حفظ و نگهداري منابع گياهي از طريق كشت بافت
• انتقال ژنهاي خارجي مطلوب به سلولهاي مورد نياز از طريق كشت بافت و مهندسي ژنتيك
• توليد گياهان عاري از ويروس
• ايجاد لاينهاي مقاوم به امراض و بيماريها
• ايجاد لاينهاي مقاوم به شوري و خشكي
• تهيه لاينهاي مقاوم به علف كشها

فصل دوم

خصوصيات زراعي

فصل دوم
تاريخچه:
طبق نظر واويلوف دانشمند روسي، مبدأ يونجه مركز خاور نزديك آسياي صغير، قفقاز ايران و مناطق كوهستان روسيه است. مركز جغرافيائي يونجه را غالباً كشور ايران مي دانند. بايد گفت كه يونجه مدتها پيش از زماني كه از آن در تاريخ ذكري به ميان آمده است، كشت مي شد و هم اكنون نيز بطور وحشي در اكثر نقاط دنيا رشد مي يابد. مطالعات خانم سينكايا (sinskaya) نشان مي دهد كه يونجه از لحاظ مبدأ داراي دو مركز است. نخستين مركز آن ناحيه كوهستاني قفقاز بود كه ارقام جديد يونجه هاي اروپائي از آن بدست آمده است. دومين مركز مستقل پيدايش را آسياي مركزي مي دانند.

تاريخچه يونجه، سرگذشت مهمترين گياه علوفه اي دنيا و اولين گياه علوفه اي اهلي شده است كه بشر اوليه اهميت و ارزش آن را بعنوان غذاي دام تشخيص داده است. از نظر تكاملي، توجه به كشت يونجه بطور چشمگيري موفقيت آميز بوده است كه علت اين امر شايد وجود سيستم ريشه اي مناسب آن است كه طي قرون متمادي و تكامل همزيستي باكتري ريزوبيوم و ريشه يونجه، گياه يونجه به يك منبع ازت سرشاري دست يافته است كه نياز اين گياه به اين عنصر غذايي را مرتفع مي نمايد. از طرفي ريشه يونجه بعلت عميق و راست بودن، توانايي كافي در جذب رطوبت از اعماق خاك را داراست كه گياه را در شرايط خشكي از خطر نجات مي دهد. همچنين گياه يونجه در اثر خشكي و سرما به حالت ركود و خواب رفته و بعد از وجود شرايط مناسب به رشد خود ادامه خواهد داد. ساقه هاي خزنده يونجه (stolon) و ريشه هاي خزنده زيرزميني (Rizom) و طوقه به خاك نشسته يونجه مقاومت گياه را در مقابل سرما و يخبندان افزايش مي دهد. (۶ و ۶۲)

اهميت اقتصادي:
غذاي دامهاي نشخوار كننده، سيستم پيچيده اي را در دنيا از تظر توليد غذائي به نمايش مي‌گذارد. ۷۵ درصد غذاي توليد شده دنيا را حيوانات نشخواركننده مصرف مي كنند.

۸۰-۶۰ درصد غذاي حيوانات نشخواركننده را علوفه تامين مي نمايد. ۱۸ درصد غذاي بشر و ۳۶ درصد از پروتئين مصرفي انسان را علوفه تامين مي كنند و از اين لحاظ بهترين وسيله براي تقويت غذائي بشر مي باشد. يونجه گياهي است كه بيشترين توليد در ميان علوفه ها را در دنيا به خود اختصاص داده است. در دنيا يونجه بعنوان غذاي دام بطور مستقيم بصورت چراگاه و يا در دامداريهاي صنعتي مورد استفاده قرار مي گيرد و بعنوان منبع هيدرات كربن و پروتئين دام مورد استفاده قرار مي گيرد.
كشور ايران داراي ۲۰ ميليون هكتار زمين قابل كشت است كه ساليانه حدود ۱۰ ميليون هكتار به حال آيش گذاشته مي شود و حدود ۵/۸ تا ۹ ميليون هكتار به زير كشت مي رود. ۶/۵ ميليون هكتار به كشت گندم و بقيه به ساير محصولات شتوي و صيفي اختصاص دارد كه ۲۸۴۹۳۶ هكتار آن را يونجه تشكيل مي دهد. (۶ و ۶۴)

گياهشناسي يونجه:
گياهي است چند ساله داراي ريشه اي راست و مستقيم كه به نام ريشه اوليه يونجه معروف است. اين ريشه بعد از قرار گرفتن بذر در خاك و جذب رطوبت، بدون انشعاب است. به موازات تشكيل اين ريشه قسمت زير لپه يا هيپوكوتيل در زير سطح خاك نمودار مي شود. و با طويل شدن آن باعث جوانه زدن و خارج شدن از سطح خاك مي شود كه در اين مرحله گياهي است حساس نسبت به كمبود آب، افزايش بيش از حد آب، شوري خاك و سله بستن. وقتي زير لپه يونجه از سطح حاك نمودار گردد، در اين موقع يونجه جوانه زده فقط داراي دو لپه يا كوتيلدون است كه بصورت برگهاي متورم به نظر مي آيند و بعد از مدتي از بين رفته و برگهاي اصلي از مركز آن بوجود مي آيند كه داراي دمبرگي طول مي باشند كه معمولاً قلبي شكل بوده و شباهتي به برگهاي اصلي يونجه ندارد. كه بعد از طي زمان نخستين برگ مركب ۳ برگچه اي نمايان مي شود.

علاوه بر ريشه اصلي، ريشه هاي جانبي نيز از سلولهاي حاشيه استوانه مركزي ريشه اصلي نمودار مي شود. كه عامل موفقيت يونجه در مقابل عوامل نامساعد وجود سيستم مناسب ريشه مي باشد. بعد از كشت چند هفته از رشد و نمو گياه و وجود رابطه همزيستي ريشه گياه با باكتريهاي ريزوبيوم يونجه ديگري نيازي به ازت خاك ندارد. علاوه بر آن ريشه عميق و راست يونجه موجب حذب رطوبت از اعماق تا ۵ متر نيز مي شود. كه امتياز باارزشي در مقاومت به خشكي است. ساقه هاي خزنده روي زمين (استولون)، ريشه هاي خزنده زيرزميني (ريزوم) از قسمتهايي هستند كه در طول مدت رشد و نمو اين گياه به وجود مي آيند.

ساقه اصلي يونجه چهارگوش به نظر مي رسد و مغز آن از سلول هاي پارانشيمي نسبتاً بلند و فشرده پر شده است و داراي انشعابات بسيار زياد و ظريفي است كه هر كدام برگهاي مركب زياد دارد. ساقه يونجه در نزديك سطح خاك، انشعابات زيادي توليد كرده كه به مرور زمان چوبي و ضخيم مي‌شود و به طوقه تبديل مي گردد. كه از اين محل ساقه هاي كوتاه منشعب و ضخيم بوجود مي آيد كه تبديل به ساقه هاي بلند و اصلي يونجه مي شود. تعداد ساقه ها بين ۵ تا ۴۰ عدد است كه از ناحيه طوقه خارج مي شود و از هر ساقه بعد از چيدن يا رسيدن، ساقه ديگري توليد مي شود. بعد از گذشت چند سال طوقه بصورت توده انبوهي درمي آيد كه در داخل خاك و يا خارج از خاك قرار مي گيرد. ساقه هاي هوائي راست، سبزرنگ و پوشيده از كرك هاي نرم است. ارتفاع اين ساقه ها در ارقام مختلف، در برداشت هاي مختلف، در مناطق گوناگون و در خاكها، با يكديگر متفاوت است.

برگ هاي يونجه مركب، رنگ برگچه هاي يونجه سبز تيره، تخم مرغي، سطح زيرينشان پوشيده از كرك است. برگچه و سطح برگ مركب يك دمبرگچه كوتاه دارد ولي برگچه هاي جانبي فاقد دمبرگچه مي باشند. در قاعده دمبرگ دو گوشوارك يا استيپول وجود دارد كه به دمبرگ متصل هستند، هر كدام زائده اي باريك و بلند در انتها و نيز دندانه هائي ظريف و كوچك در قاعده دارد. برگچه هاي يونجه كشيده، طويل و تقريباً در انتهاي آن مضرس است. برگچه ها داراي يك رگبرگ اصلي يا رگبرگچه هستند كه تا راس برگچه امتداد مي يابد و از اين رگبرگچه اصلي، رگبرگچه هاي فرعي منشعب مي شود.

گل يونجه داراي خصوصيات ويژه اي است. رشد و نمو گل يونجه، از انتهاي شاخه ها با تغيير حالت از رشد و نمو رويشي به زايشي آغاز مي شود. اين تغيير حالت در فصل بهار از دهمين تا چهاردهمين گره از طوقه يونجه و در فصا تابستان از ششمين تا دهمين گره صورت مي گيرد. بنابراين مفهوم آن اين است كه يونجه هايي كه در بهار به گل مي نشينند داراي رشد و نمو زيادتري هستند و ارتفاع ساقه آنها هم بيشتر است ولي يونجه هائي كه در تابستان به گل مي نشيند ارتفاع كمتري دارند. هر گل داراي يك كاسه، يك جام، ده پرچم و يك مادگي است. كاسه گل شامل پنج كاسبرگ متصل است كه به پنج قسمت يا دندانه تقسيم مي شود و طول هر قسمت تقريباً برابر طول

كاسه است. جام گل شامل ۵ گلبرگ به نامهاي درفش، بال و ناو به هم پيوسته است. رنگ گل يونجه معمولي شبهي از رنگ ارغواني يا بنفش است. رنگ گل يونجه داسي مديكاگو فالكاتا، زرد تيره و رنگ يونجه مديكاگو لوپولينا، زرد رنگ است. رنگ گل ارقام مختلف گونه هاي جنس ميكاگوممكن است سفيد، بنفش، زرد و يا رنگارنگ باشد. مادگي يونجه شامل يك برچه با تخمدان فوقاني، خامه صاف و ميان تهي و كلاله مشخص است. تخمك ها بطور متناوب در طول شكاف شكمي تخمدان تشكيل مي شوند. معمولاً ده تا دوازده تخمك در تخمدان يونجه رشد مي كند، ولي تعدادشان ممكن است بين شش تا هيجده عدد تغيير كند. درون گل يونجه، ده پرچم قرار دارد كه نه عدد آنها به هم متصل و دهمين پرچم، نزديك به درفش آزاد است. ميله هاي پرچم مادگي را احاطه مي كنند. (۶)

آب و هوا:
گياه يونجه بهترين رشد را در مناطقي دارد كه هواي آن مناطق، خشك، آفتابي، گرم و نيز آب زيادي در دسترس داشته باشد. كه در شرايط ايران جلگه خوزستان، دشت مغان و منطقه جيرفت مطلوب به نظر مي رسد. بطور كلي در ايران مي توان سه منطقه مختلف آب و هوائي را براي رشد و نمو يونجه در نظر گرفت: مناطق خشك، نيمه خشك و مرطوب. مستعدترين مناطق براي رشد و نمو يونجه، در صورت وجود آب كافي مناطق خشك و پس از آن مناطق نيمه خشك و در آخر مناطق مرطوب است.
يونجه در مقابل تغييرات دماي محيط حساس نيست و قادر است دماي ۵۰ تا ۶۰ درجه سانتيگراد زير صفر و ۵۰ درجه سانتيگراد بالاي صفر را تحمل نمايد. يونجه با ريشه هاي عميقي كه دارد مي تواند در مناطق نسبتاً خشك و كم آب مقاومت كند.

كشت يونجه در ارتفاعات مختلف انجام مي گيرد. از ارتفاع ۲۴۶۵ متري در آبعلي ۱۶۴۴ متري در همدان تا ارتفاع ۱۰۰۰ متري در ابرقو كشت مي شود. كشت يونجه در ارتفاع پايين تر مثل ابادان و اهواز (۱۳ متر) و حتي پايين تر از سطح درياي آزاد در رشت، امكان پذير مي باشد.
يونجه در محل هاي گوناگوني و در خاكهاي مختلف رشد و نمو مي يابد. در نيم كره شمالي تا نيم كره جنوبي از مناطق كوهستاني تا مناطق جلگه در خاكهاي سنگين تر خاكهاي سبك و شني رشد مي يابد.

بغير از مرحله جوانه زدن در ساير مراحل رشد به شوري خاك مقاوم است. در خاكهاي آهكي نيز يونجه رشد خوبي مي تواند داشته باشد. (۶)

كاربرد بيوتكنولوژي در اصلاح يونجه:
چگونه بيوتكنولوژي بايد براي توسعه يك برنامه پيشرفته اصلاحي يونجه بكار برده شود تا واريته هاي بهتر، متناسب براي تحويل در توليد مثل با حداكثر خاصيت هتروزيگوسيتي ايجاد شود، موضوعي است كه اخيراً مورد توجه دانشمندان قرار گرفته است. در اين مقوله، بهبود نژادهاي والديني و بكارگيري هيبريداسيون مي تواند تغيير و تبديل در واريته را در جهت اهداف مشخصي افزايش دهد. موارد زير جزو بارزترين راهكارهاي بيوتكنولوژي براي بهبود يونجه است (۶۴ و ۱۰۳ و ۱۰۴ و ۸۹)

مهندسي ژنتيك:
ژنهاي بالقوه براي مهندسي ژنتيك عبارتند از: ژن پروتئيني
Bacillus thuringiensis براي كنترل حشرات بال پولكي، ژنهاي پروتئيني پوشش ويروس، ژن مقاومت به علف كش، ژنهاي بازدارنده آنزيم (تجزيه كننده) پروتئين براي بهبود كميت و كيفيت و از بين بردن آنزيمهاي هضم كننده پروتئيني قارچي و شكارچي حشرات (Abelson, 1989, Ryan, 1939)، ژنهاي پروتئيني بازدارنده آنزيم (تجزيه كننده) پلي گالاكتوز براي جلوگيري از فعاليت endo-polygalacturonase ميكرو ارگانيسم هاي از بين برنده ديواره سلولي (Degra et al 1988)، ژن glutamin-synthetose anti-sense براي افزايش محصول، ژنهاي آنزيم كننده، كيتين براي هيدروليز كردن جلد حشرات تغذيه كننده (Abelson , 1989) و مواردي از قبيل مقاومت به آلومينيوم. وراي

سهولت دسترسي، محدوديت عمده در تركيب ژنهاي مورد نظر به درون واريته هاي تجارتي همان پروسه اي خواهد بود كه بوسيله آن واريته هاي يونجه اصلاح مي شوند. واريته هاي يونجه با تركيب تعداد زيادي افراد اصلاح شده و واريته تركيبي را بوجود مي آورند. اين پروسه سهم ژنتيكي فرد را در جمع به حداقل مي رساند.
(۱۰۳ و ۸۳)
هيبريداسيون گسترده:
تكنيكهاي پروتوپلاسم و درآوردن جنين براي هيبريداسيون يونجه هاي زراعي گونه هاي يونجه يك ساله Medicago با لگومهاي ديگر مثل اسپرس (Onobrychis vicifolia Scop) و شبدر (Lutus corniculatus L.) بكار مي رود. يكي از برجسته ترين كارهاي اين شيوه انتقال مقاومت مي باشد (مقاومت به نفخ). (۸۷ و ۹۲)

فصل سوم

كشت بافت

فصل سوم
بررسي منابع:

كشت بافت يونجه:

اولين گزارش مربوط به كشت بافت يونجه توسط ساندروز وبينگهام در سال ۱۹۷۲ انتشار يافت. آنها گزارش كردند كه كالوس مي تواند تخمدان نارس ، ميان گرهها، هيپوكوتيل و حتي پرچم نارس توليد شود. همچنين همة گياهان توليد شده داراي كروموزومهاي سوماتيكي برابر گياهان دهنده بودند. بعد از اين تحقيق راندمان باززايي رو به پيشرفت گذاشت. آرسيوني و همكاران(۱۹۹۰) تعداد ي از گزارشات كشت بافت يونجه كه شامل نوع گونه، كالتيوار، ريزيونجه، محيط كشت القاء كالوس و يا محيط كشت رشد ، محيط باززايي و نوع باززايي را گردآوري كردند. (۸)
در سال ۱۹۷۲ سانددرز و بينگهام توليد كالوس را در محيط نيمه جامد بررسي كردند. تحقيقات آنها نشان داد كه اضافه كردن NAA، تيروزين يا سيتوكينين هركدام به تنهايي يا به صورت تركيب، كالوس زايي را افزايش مي‌دهد. بهترين توليد كه روي محيط بدست آمد شامل مواد غيرآلي و ويتامينها ازجمله ۱۰۰mg/l اينوزيتول و ۲gr/l عصارة مخمر بود. توانايي كالوسهاي تازه براي باززايي بستگي به سطوح مختلف هورموني داشت ولي طول مدت روز در تمايز اثري نشان نداد. از كشت بساكهاي بالغ، قسمتهاي ميان گره، هيپوكوتيل، بذور و تخمك بالغ، كالوس و گياه باززايي شده بدست آمد.
در واقع آزمايشات دقيق تأثير هورمونها در سطح القاء كالوس اولين بار توسط دانشمندان فوق بررسي شد، آنها مشاهده كردند كه وقتي ۲-۴-D در محيط آغازيدن وجود نداشت جوانه اي هم تشكيل نشد. بنابراين ۲-۴-D تنها هورموني است كه مسئول همراهي القاء كالوس و اندامزائيهاي بعدي باشد. (۸۹ و ۸۴)
در سال ۱۹۸۷ وان و ليانگ تحقيقي در مورد اثرات كاينتين در كالوسهاي يونجه انجام دادند:

محيطهاي كالزايي B5، B2K، ۱۷۹۵۱ براي مطالعات اثرات كينتين مورد استفاده قرار گرفت و مورفولوژي، هيستولوژي و باززايي در يونجه ها بررسي شد. حضور كينتين در القاء كالوسهاي ضروري تشخيص داده شد. كالوسهايي كه توسط كينتين توليد شده بودند در محيط B5 و ۱۷۹۵۱ داراي سلولهاي متراكم بودند كه حاوي ناحية مريستمي بودند و تمايز بالايي در گياهچه هاي حاصل از محيط باززايي نشان دادند. اكثر كالوسهاي توليد شده داراري سلولهاي تخصصي و ساختمان قابل انعطاف بودند. بعد از انتقال كالوسها به محيط هورمون دار كالوسهاي حاصل باززايي شدند. در اين آزمايش از دمبرگهاي دومين يا سومين برگهاي رأس ساقه استفاده شد. (۹۹ و ۱۰۰)
كالوس را مي توان براي مدت زمان طولاني يا كوتاه مدت حفظ كرد. اين توانايي اكثراً به ژنوتيپ وابسته است. بعضي وقتها كشتهاي طولاني مدت را مي توان بوسيلة افزودن سطوح بالاي سيتوكينين وادار به جنين زايي كرد. اين موضوع بوسيلة استوارك و همكاران گزارش شده است. (۸)

مطالعه اي در سال ۱۹۸۵ روي جنين زايي و باززايي يونجه توسط مك كنزي و ناگاجان انجام شد. ده كولتيوار و لاينهاي حاصل از دو گونة يونجه M.sative و M.media براي توانايي جنين زايي انتخاب شدند و گياهچه هاي حاصل از ريشه و هيپوكوتيل در سه محيط جداگانه كشت شدند. اين سه پروتوكول داراي مقادير متفاوت از نمكها، ويتامينها و هورمونها بودند. پروتوكولي كه مقادير زيادي از ۲-۴-D و مقدار كمي از سيتوكسين داشت بيشترين كالوس جنين زا را توليد كرد. دولاين اصلاحي M.media كه درصد بينابيني از نظر جنين زايي داشت درصد بسيار بالايي از باززايي را داشت. ريشة خزنده M.media بيشترين درصد جنين زايي را توليد كرد.

۳- جنين زايي
در سال ۲۰۰۲، Pasternak T.P و همكاران اثرات اكسين و pH را در فعاليت تقسيم سلولهاي جنين زا در پروتوپلاست حاصل از برگهاي يونجه بررسي كردند. اثرات جنين زايي در مقادير پايين (M 1) و بالاي (M 10) از ۲-۴-D تفاوت بود. سلولهاي مواجه با ميزان بالاي ۲-۴-D داراي سيتوپلاسم متراكم گرديد. كوچك باقي ماندند و توانستند به خوشه هاي سلولهاي پيش جنيني تبديل شوند. در حالي كه سلولهاي مواجه با ۲-۴-D پايين طول شدند ولي از بين رفتند يا كلني تمايز نيافته دادند. در اين بررسي ها از محيط m.s استفاده گرديد.

در سال ۲۰۰۰، Iantcheva و همكاران ميزان تشكيل جنين و باززايي را در محيطهاي مايع در گونه هاي ديپلوئيد Medicago شامل برگ و دمبرگ ۵ گونة M.ciliaris و M.murex و M.ombicularis و M.polymorpha و M.truncatula بررسي كردند. جنين ها به راحتي در محيط حاوي ۱mg/l يا ۲-۴-D 4mg/l بدست آمدند. آنها از محيط القاء B5 استفاده كردند و از غلظتهاي متفاوت ۴۰ و ۱۱ و ۴ و ۳ و ۲ و ۱ و ۰٫۴ ميلي گرم در ليتر از ۲-۴-D تكميل شده با

۰٫۲m/l كاينتين، ۱mg/l آدنين و ۵۰۰mg/l ميواينوزيتول استفاده كردند. مشاهده شد كه حضور ۰٫۰۵mg/l و NAA براي بلوغ جنين سوماتيكي لازم است. رشد جنين گلبولي شكل تا رسيدن به مرحلة تورپدو و در محيط B5 با ۲-۴-D 4mg/l انجام گرفت.
Walker و SATO در سال ۱۹۸۱ مقاله اي تحت عنوان مورفوژنز در كالوسهاي Medicago sative و نقش يون آمونيوم در جنين زايي سوماتيكي منتشر كردند. آنها اظهار داشتند كه وجود يون آمونيوم چه براي توليد ريشه چه براي جنين زايي سوماتيكي در شرايط In vitro ضروري است. مقدار يون لازم حدود
m 12.5 در محيط باززايي بود. بيش از m 50 يون آمونيوم به عنوان بازدارنده عمل كرد.

Arcyoni و همكاران در سال ۱۹۸۲ جنين زايي سوماتيكي را توسط كشت سوپانسيون پروتوپلاست و كشت مزوفيل برگ يونجه هاي M. corulea و M.glutinosa بررسي كردند. شرايط رشد گياه، سن گياه و ايزولاسيون پروتوپلاست بررسي شد و نتايج بدست آمده حاكي از آن بود كه ميزان مناسبي از اكسين و سيتوكسين در جنين زايي در گونه هاي مختلف M.corulea مؤثر است.

Kao و Myctayiuk (1980) كشت سوسپانسيون را در ۹ گياه يونجه انجام دادند و نتايج نشان داد كه شرايط غذايي متفاوت براي جنين زايي مورد نياز است (ازجمله سطوح مناسب هورموني و نمكهاي معدني) هفت گياه از نه گياه قابل تبديل به گياه كامل بودند.
– در سال ۱۹۸۵ Brown و همكاران نقش زمينة ژنتيكي را در جنين زايي سوماتيكي يونجه بررسي كردند. از ۷۶ كوليتوار يونجه متعلق به دو گونه sativa و falcate بدون توجه به پروتوكول، ريز نمونه و محيط هاي كشت، پاسخ متفاوتي بدست آمد.

در سال ۱۹۸۷ Meyyer و همكاران اثرات نيتروژن و ساكارز را در جنين زايي كلونهاي حاصل از M.sativa بررسي كردند. يك نياز مبرم به آمونيوم براي جنين زايي و تمايز مشاهده شد. اسيد آمينه ها نه تنها براي تمايز ضروري تشخيص داده نشدند بلكه به عنوان مهاركننده هم عمل كردند. به جز ۱-۲g/l كازئين هيدروليز شده يا ۴٫۴mM گلوتامين با ۳۰mM پرولين كه در شرايط خاص ۲۰-۳۰% در افزايش جنين نقش داشت. ساكاروز زياد يا كم مانع جنين‌زايي بود. كلونهاي انتخاب شده از سه كولتيوار از M.sativa يك پاسخ مشابه به باززايي نشان دادند.

۴- باززايي
Ray و Bingham در سال ۱۹۸۹ باززائي در يونجه هاي ديپلوئيد را مورد مطالعه قرار دادند. اين مطالعات نشان داد باززايي توسط ژنهاي محدودي كنترل مي شود. Bertnard و همكاران (۲۰۰۱) روش نواري را براي جنين زايي يونجه گزارش كردند و نشان دادند در روشي كه برگها همه قطعه قطعه شده و در محلول آنزيمي به همراه مانيتول بجاي ساكاروز (به عنوان اسمز نگهدارنده) نتايج كشت پروتوپلاست موفق تر بوده و جنين زايي در B5 موفقيت آميز بوده است.

تحقيق ديگري توسط عليرضا مطلبي آذر و علي جعفري مفيد آبادي (۱۳۷۹) برروي كالزايي، جنين زايي و باززايي در جمعيتهاي يونجه ايراني انجام گرفت. آنها مجموع چهار روش موفق را بررسي كردند روش اول روش مك كوي و واكر بود كه در آن از زير نمونه هيپوكوتيل و محيط كشت پايه SH استفاده كردند. محيط القاء كال شامل
۲ ۲-۴-D+5NAA+2Kin محيط القاء جنين شامل۱۱ ۲-۴-D و ۱Kin بود. محيط باززايي Boi2y و در محيط بدون هورمون ۳۰ روز توليد باززايي كرد. در روش ونزل و براون از زير نمونه دمبرگ در محيط كشت MS استفاده شد. محيط القاء كال شامل ۲Kin+5 2-4-D محيط القاء جنين شامل ۵ ۲-۴-D+2Kin و محيط باززايي MS بود. محيط القاء كال ۲ ۲-۴-D و ۰٫۲۵Kin در محيط القاء جنين شامل ۱۰ ۲-۴-D و ۱Kin محيط باززايي MS بدون هورمون بود. در روش آرسيوني و همكاران از ريزنمونه لپه استفاده شد و محيط كشت پايه MS، محيط القاء كال ۲ ۲-۴-D و ۰٫۲۵Kin و محيط القاء جنين ۰٫۲۵Kin و ۲ ۲-۴-D و محيط باززايي MS بدون هورمون بود. هر چهار روش پاسخ مناسبي در بر داشتند.

در سال ۱۹۸۴ آقاي ميتن (۷۳) و همكارانش بررسي ۳۵ كاليتوار يونجه را آغاز نمودند. در اين آزمايشات تقريباً از هر يك از كولتيوار تعداد ۲۰ ژنوتيپ انتخاب گرديد و بدور آنها استريل شده و در محيط آگار كشت داده شدند. سپس هيپوكوتيل بذور جوانه زده را در محيط كشت SHNAAK كشت نمودند. بافت كالوس در هفته هاي ششم تا هشتم بوجود مي آيد. وقتي حداقل ۲ گرم كالوس ايجاد شد آزمايش باززائي با روش Qalker و Sato آغاز مي شود. كالوس هاي هر ژنوتيپ با هم مخلوط نموده و ۱۰ نمونه ۱۵۰ ميلي گرمي از هر كدام در محيط كشت SH حاوي ۵۰ ميكرومول ۲-۴-D و ۵ ميكرومول كينينن است، كشت مي گردد. بعد از ۳ روز بافت را به محيط بلايدس جاوي ۱۰۰ ميلي گرم در ليتر اينوسيتول و ۲ گرم در ليتر عصاره مخمر منتقل مي شود و در شرايط ۰C37 و فتوپريود ۱۶ ساعت با شدت نور Jm-2s-16 نگهداري مي‌شود. بعد از ۲۱ روز تعداد جنينهاي تكامل يافته شمارش مي شوند. و اگر جنين تشكيل نشده بود ابعاد اندامهاي سبز نيمه ارگانيك يادداشت مي شود.

در سال ۱۹۸۵ آقاي مي جر و همكارانش (۶۹) براي بررسي گياهان يونجه ديپلوئيد از ۱۹ كالتيوار استفاده نمودند. تعداد ژنوتيپ هاي مورد استفاده در هر كالتيوار متفاوت و بين ۵ تا ۵۸ ژنوتيپ بود. براي ضدعفوني سطحي بدور يونجه از اتانول ۷۰ درصد استفاده شد كه به مدت ۱ دقيق درون محلول قرار مي گيرد. و بعد به مدت ۱۰ دقيق در محلول ۱۰۰ ميلي‌ليتري Hgcl2 2/0 درصد كه قطره اي از Tween80 دارد ضدعفوني مي گردد. سپس ۵ بار با آب مقطر شستشو مي گردند. بذور ضدعفوني شده را در

محيط كشت MS بدون مواد تنظيم كننده رشد و حاوي ۲ درصد ساكارز و آگار ۸/۰ درصد كشت مي دهند. تمام محيطهاي كشت را در حرارت ۰C121 به مدت ۲۰ دقيق انكوباسيون مي نمايند. PH محيط كشت قبل از اتوكلاو شدن ۸/۵ مي باشد. بذور در تاريكي و در حرارت ۰C25 جوانه زده وقتي هيپوكوتيل ها به طول تقريبي ۵ سانتيمتر بعد از مدت ۲-۳ هفته رسيد آنها را به شرايط فتوپريود ۱۶ ساعته به مدت ۲-۳ روز منتقل مي نمايند. هيپوكوتيل ها را به ابعاد ۵ تا ۸ ميلي متري بريده كوتيلدونها را برداشته و ساقه ها در همان محيط در ظروف ۱۰ سانتيمتري پلي كربناته كشت مي دهند. به ازاي هر گياهك، ۳ اكسيدانت روي يكي از دو محيط كشت القاء كالوس درون پتريديش هاي ۲×۶۰ ميلي متري پلاستيكي قرار گرفتند. پتري ديش ها توسط پارافيلم مسدود شده و كليه كشت ها در شرايط ۰C25 و در تناوب نوري ۱۶ ساعته با شدت نور فلورسنت m mol m-2s-1 25 نگهداري شدند پروتكل هاي محيطهاي كشت قراردادي براي جنين زائي سوماتيكي عبارتند از:

پروتكل I- براي القاء كالوس، ۳۰ روز در محيط كشت UM حاوي ۲۵/۰ ميلي گرم در ليتر كينتين و ۲ ميلي گرم در ليتر ۲-۴-D قرار مي گرفتند و سپس براي تشكيل جنين به مدت ۳۰ روز در محيط كشت MS حاوي ۰۵/۰ كيلي گرم در ليتر BA و ۰۵/۰ ميلي گرم در ليتر NAA قرار مي گرفتند.
پروتكل II- براي تنشكيل كالوس، ۳۰ روز در محيط كشت B5h حاوي ۲/۰ ميلي گرم در ليتر كينتين و ۱ ميلي گرم در ليتر ۲-۴-D و براي القاء جنين، ۲۱ روز در محيط كشت SH حاوي ۱ ميلي گرم در ايتر كينتين و ۱۱ ميلي گرم در ليتر

۲-۴-D و در نهايت براي نمو و تكامل جنين ها در محيط كشت Boi2y قرار مي گرفتند.
پروتكل مجدداً با اكسپلانت هاي پتيول از كشت ساقه كليه ژنوتيپ هاي قابل باززائي و تعدايد از ژنوتيپ هاي غيرقابل باززائي، تكرار شدند. در آزمايشاتي كه از پتيول استفاده شده بود ۳ تكرار و هر تكرار حاوي ۵ پتيول ۵ تا ۸ ميلي متري در هر پتريديش استفاده گرديد. جنين هاي سوماتيكي در محيط كشت SH را به آن ۰۲/۰ ميلي گرم در ليتر ۲ip و IAA اضافه گرديده بود و يا در محيط كشت MS پايه كه به آن ۲ درصد ساكارز اضافه شده بود كشت گرديد.

آقاي براون در سال ۱۹۸۵ به منظور مطالعه اثر متقابل محيط كشت × كالتيوار ۴ پروتكل مختلف بكار بردند. براي مطالعه اثر متقابل كالتيوار × اكسپلانت از دو اكسپلانت هيپوكوتيل و كوتيلدون استفاده نمود. در اين آزمايش براي استريل نمودن اكسپلانت ها از اتانول ۷۰ درصد به مدت ۲۰ ثانيه و از محلول هيپركلريت كلسيم ۷ درصد كه به ازاي
CC200 حاوي يك قطره Tween-80 است، به مدت ۲۰ دقيقه استفاده گرديد و سپس با آب مقطر ۳ بار شستشو داده شد و براي ايجاد گياه از جنين سوماتيكي بزرگ و سبز شده استفاده شد كه با انتقال به محيط كشت She حاوي ۱۰ گرم در ليتر ساكارز، ۰۲/۰ ميلي‌گرم در ليتر ايزوپنتيل آدنين اين امر امكان پذير گرديد. جنين هاي فوق را در ظروف پلي‌كربناته ۴ اينچي حاوي ۵۰ ميلي ليتر محيط كشت و به تعداد ۵ جنين در هر ظرف قرار مي دهيم. (۲۶)
۳-۳- اثرات زمينه ژرم پلاسم در باززائي:
براون (۱۹۸۴) معتقد است كه در يونجه بيشترين اختلاف ژنتيكي مشاهده شده در كالتيوارهاي موجود مي‌تواند از۹ منبع ژرم‌پلاسم كه بين سالهاي ۱۸۵۰ تا ۱۹۴۷ در‌ آمريكاي شمالي بوجود آمده ناشي شده باشد. تقسيمات منابع‌ ژرم‌پلاسم بر اساس تعدادي از صفات صورت مي گيرد اما بيشتر بر اساس تقسيمات جغرافيائي انجام مي‌پذيرد. تمام ۹ منبع ژرم پلاسم قسمتي از تركيب M.falcate×M.sativa هستند. كه به آساني با هم تلاقي مي يابند و نسبت به ميزان نسبي ژرم پلاسم M.falcate و M.sativa تغيير مي‌يابند. بعلاوه ۹ منبع ژرم پلاسم مطابق با فشار سلكسيون طبيعي كه در طي قرون متمادي اعمال شده است، تغيير مي يابند.

اگر كالتيوارهاي مورد بررسي در آزمايشات مختلف بر اساس ميانگين واكنش جنين زائي مرتب شوند و بوسيله منابع ژرم پلاسم تفكيك شوند، الگوي مشخصي نمايان مي شود. در اتين آزمايشات معلوم شده است كه محدوده گسترده اي از كالتيوارهاي داراي حداقل چند ژنوتيپ كه قدرت باززائي دارند، مي باشند، و بعضي از ژنوتيپ ها كه توليد جنين نمي‌كنند، توليد اندامهاي سبز و ساختمان نيمه ارگانيك مي نمايند. تجربه نشان داده است كه وجود اندامهاي فوق نشانگر پتانسيل پائين باززائي ژنوتيپ ها مي باشد. كالتيوارهائي كه واكنش باززائي متوسطي دارند هم توليد جنين مي كنند و هم توليد اندامهاي سبز و نيمه‌ارگانيك. (۲۶ و ۳۱)

در بررسي مي جر و همكارانش در سال ۱۹۸۵ كه ۱۹ كالتيوار يونجه را بررسي نمودند چنين نتيجه گيري گرديد كه درصد ژنوتيپ هائي كه توليد كالوس مي كنند از ۵۳ درصد در لاين S2128 زيرگونه Caerula تا ۱۰۰ درصد در لاين MH2 زيرگونه xvaria متغير بود. در اين بررسي از دو محيط كشت UM و B5h استفاده گرديد كه محصول كالوس در B5h بيش از UM بود. بطور كلي ارقامي كه پتانسيل باززائي بالائي هستند در هر دو محيط عملكرد بالائي هستند و بالعكس ارقامي كه داراي عملكرد پائين هستند در هر دو محيط واكنش ضعيفي نشان مي دهند. ميزان كالوس حاصل از پتيول با هيپوكوتيل مشابه هم بود. در اين آزمايش اكثريت لاين ها يا قابليت باززائي كمي داشتند و يا واكنشي نشان نمي دادند. بهترين واريته از نظر توليد جنين سوماتيكي كالتيوار F2 از زيرگونه Falcata بود. در اين كالتيوار جنين هاي سوماتيكي بعد از ۱۵ تا ۲۵ روز در م

حيط كشت UM قابل تشخيص بودند. در بعضي از موارد چنين بنظر مي رسيد كه جنين ها بجاي ايجاد شدن از كالوس مستقيماً از قطعات اكسپلانت بوجود مي آيد. در اين كالتيوار كالوس هاي اوليه ۶۰ تا ۷۰ درصد از ژنوتيپ ها پس از ۳۰ روز توليد جنين هاي زيادي مي كردند كه تعداد آنها در محيط كشت UM بيش از B5h بود ژنوتيپ هاي F2 كه در كشت هاي كالوس اوليه توليد جنين نكرده بودند، پس از انتقال به محيط كشت القا و جنين نيز توليد جنين ننمودند. در اين كالتيوار بين ژنوتيپ هاي مورد بررسي تفاوت معني داري از نظر وامنش جنين زائي رخ داد. بطوري كه بعضي ژنوتيپ ها كالوس ترد، بيضي بدون جنين يا جنين هاي كم و بقيه كالوس نرم و آبدار نمودند. در اين بررسي برخي ژنوتيپ هاي كالتيوار MH4 زيرگونه Xvaria، كالوس هاي اوليه، توليد جنين هاي بيشتري نمودند.

در تحقيقات Eltjo.G.M.Meijer كه بررسي يونجه هاي ديپلوئيد بود اگرچه لاين هاي ۴ زيرگونه مورد تحقيق، پتانسيل باززائي كمي نشان مي دادند، ولي نتايج حاصل در مقايسه با گزارش Brown (1985) و Mitten (1984) در زمينه اثر منبع ژرم پلاسم روي توليد جنين هاي سوماتيكي يونجه تفاوت قابل ملاحظه اي وجود ندارد. در تحقيقات Eltjo تعداد زيادي از رقم و لاين هاي تتراپلوئيد مورد بررسي. يا قابليت باززائي نداشتند و يا توليد جنين هاي سوماتيكي كمي مي نمودند. ميزان كم باززائي امكان تحقيق وجود رابطه بين قابليت باززائي و منابع ژرم پلاسم را امكان پذير نمي نمود. درچند در اين مطالعه بيشترين باززائي در هيبريد falcata cacrula و كالتيوار Falcata مشاهده شد، در صورتي كه در مطالعات Mitten (1984) رقم بومي Ladak و در تحقيقات Brown

(۱۹۸۵) Ladak و زيرگونه falcate را بعنوان منابع برتر شناسائي نمودند. در اين مطالعه يك استثناء وجود داشت، Regen-B كه خود از يك رقم تتراپلوئيد Regen-S كه داراي پتانسيل باززائي بالائي است بوجود آمده است. با اين وجود Regen-S حامل ژنهاي زيان آوري است كه در حالت ديپلوئيد فراواني اين ژنها افزايش مي يابد. بنابراين افزايش ژنهاي نامطلوب مي توانست علت واكنش ضعيف و دور از انتظار Regen-B باشد (۳۳).

آقاي براون در سال ۱۹۸۸ به اين نتيجه رسيد كه طور قابل توجهي ۸۰ درصد كالتيوارهائي كه داراي باززائي هستند از نظر فنوتيپي بعنوان تيپ هاي ريشه خزنده طبقه بندي مي شوند. آقاي موري در سال ۱۹۵۷ رفتار ريشه هاي خزنده و مسير تكاملي ساقه هاي نابجا را كه از قطعات ريشه بوجود مي آيند شرح داده است. اين كالتيوارها بوسيله جداسازي جانبي، انشعاب مكرر ريشه ها و نمو ساقه هاي نابجا در فواصل ريشه ها مشخص مي شوند. واضح است كه منشاء ساقه هاي نابجا، فلوژن نزديك ريشه هاي جانبي است. راجع به تظاهر ژنتيكي رفتار ريشه هاي خزنده اطلاعات كمي موجود است. بهرحال آقاي بورتون (۱۹۳۷) معتقد است كه اين صفت ممكن است

توسط تعداد زيايد ژن كنترل شوند و آقاي رام باق معتقد است، منشاء اين ژنها از منابع ژرم پلاسمي M.falcate و يا Ladak مي باشد. بينگهام (۱۹۷۵) نيز ارتباط بين صفت ريشه هاي نابجا و باززائي را گزارش كرده است. اما نظريه بينگهام، نظريه براون را تأئيد نمي كند. اين همبستگي نشان مي دهد كه ممكن است ارتباطي بين ظرفيت تشكيل جنين هاي سوماتيكي و تكامل ساقه هاي نابجا در فواصل ريشه وجود داشته باشد. بهرحال تحقيقات آقاي رام باق (۱۹۸۲) نشان مي دهد كه هرچند صفت خزندگي ريشه از ژرم پلاسم M.falcate به ارث مي رسد، اما بنظر مي رسد كه ارتباط مستقيمي با تشكيل جنين هاي سوماتيكي نداشته باشد.
اگر بين اين دو صفت رابطه وجود داشت، بايستي انتظار داشت كه هر دو صفت همراه با سلكسيون، بر له و عليه آنها، كاهش و افزايش نشان دهد. واكنش جنين زائي سوماتيكي در محدوده سلكسيون ريشه ها خزنده اختلاف معني داري با شاهد ندارند. (۲۴)

در تحقيقات براون (۱۹۸۸) مشخص كرديد مفهوم ارتباط تشكيل جنين با زمينه ژنتيكي اين است كه تكثير كالوس خوب ممكن است لازمه توليد خوب باشد. بهرحال ارتباط مشاهده شده بين باززائي و ژرم پلاسم بنظر مي رسد كه براي باززائي و كالوس وجود نداشته باشد. اين مسئله در بررسي هاي مي جر و همكارانش ۰۱۹۸۵) به اين صورت تعريف مي شود كه كالتيوارهائي كه داراي بهترين باززائي بودند در زمينه ژرم پلاسمشان با هم تفاوت داشتند و در بررسي ژرم پلاسم وحشي يونجه توسط داجاك و همكارانش (۱۹۸۷) كه روي مواد حاصل از پروتوپلاست صورت گرفت اثر ژنوتيپ هاي با باززائي بالا بوسيله فقدان توليد كالوس مشخص مي شوند (۲۴ و ۲۶)

در باززائي Medicago sativa ژنوتيپ ويژه و فقط تعداد كمي ژنوتيپ در بعضي كالتيوارها براي توانائي شان جهت باززائي گياه از ريز نمونه جداسازي شده است. (۱۶)
پتانسيل باززائي به نتايج يك گياه ساراناك منتقل گرديد كه نشان مي دهد باززائي قابل توارث مي باشد. از گزينش دوره اي براي تجمع آللهاي كنترل كننده صفات ژنتيكي مطلوب براي توليد رقم “Regen S” كه فراواني باززائي بالائي دارد مورد استفاده قرار گرفته است. در جريان توسعه و ايجاد يونجه “Regen S” از ميان ۱۲ درصد از ژنوتيپ هايي كه از كشت هيپوكوتيل باززائي كرده بودند، در اولين نسل گزينش يك كلني «دوپريت Duprait» و چهار كلني «ساراناك» انتخاب گرديد. پنج گياه از طريق آميزش بين گونه اي با يكديگر تلاقي داده شدند و نتايج حاصل به منظور بررسي باززائي مورد آزمون قرار گرفتند. اولين نسل گزينش در افزايش فراواني ژنوتيپ هاي توليد شده در نسل دوم تا سطح ۵۰ درصد مؤثر بوده اند. در نسل دوم ۲۵ گياه با باززائي شده گزينش گرديده و آميزش يافتند تا جمعيت سومين نسل و نسلهاي بعدي گزينش را بوجود آورند. در اين تسل ۶۷% ژنوتيپ ها با باززائي كردند و ۷۵ گياه با بازائي شده آميزش يافتند تا “Regen S” را بوجود آوردند. در حين سه نسل گزينش دوره اي فراواني باززائي از ۱۲ درصد تا

۶۷% افزايش يافت كه اين مورد وراثت پذيري بالاي صفت را نشان مي دهد. يكي ديگر از استرين هاي قادر به باززائي يونجه بنام “Regen Y” مي باشد كه داراي توارث «صفت باززائي بالا» مي باشد. وراثت پذيري بالاي باززائي همچنين جهت اصلاح كلون يونجه HG2 براي استفاده در كشت سوپانسيون و گزينش سلول سوماتيكي بكار برده شده است

(۲۳ و ۲۴)
ريش و بينگهام (۱۹۸۰) نتيجه گرفتند كه مدل دو ژن غالب، تمايز جوانه را كنترل مي كند ]۸۹[. در سطح تتراپلوئيد، وان و همكاران (۱۹۹۸) نتيجه گرفتند كه جنين زائي سوماتيكي تحت كنترل دو ژن غالب با اثرات تكميلي است. ميجر براون (۱۹۸۷) اظهار داشتند كه دو مسير متمايز توسعه اي ۰نموي) براي جنين زائي سوماتيكي در يونجه وجود دارد. نتايج آنها از مطالعات مقايسه اي ژنوتيپ هاي گزينش شده از كالتيوار رنجلندر، رابلر، ورنال تا Regen-S، يك جمعيت يونجه با جنين زائي بالا كه بوسيلة دگر كشني ژنوتيپ هاي جنين زا كه از كالتيوار Dupuits و Saranac (بينگهام و همكاران ۱۹۷۵) (۲۰) توسعه يافته، بدست آمده است. (۷۱).
برخي از نتايج عمومي كه در باززائي از كالوس و مطالعات مستقل صورت گرفته در برگيرنده محدودة كاملي از ژرم پلاسم يونجه است. اين موارد عبارتند از:

۱- باززائي يك خصوصيت ژنتيكي است و وراثت پذيري بالائي دارد.
۲- اكثر كالتيوارها، لاينها و منابع ژرم پلاسم حاوي ژنوتيپ هايي با توانائي باززائي هستند.
۳- فراواني ژنوتيپ هاي داراي خاصيت باززائي در اكثر ارقام حدود ۱۰% است.
۴- ارقامي نظير لاداك و رنجلندر وجود دارند كه توانائي باززائي استثنائي دارند.
۵- ارقامي با توانائي باززائي مي توانند توسط روشهاي اصلاحي مرسوم ايجاد گردند.

۶- ارقامي كه از ريشه آنها جوانه هاي فرعي يا نابجا بوجود مي آيد (يونجه هايي با ريشه هاي خزنده) باززائي بالائي دارند.
۷- برخي ژنوتيپ هاي M.falcate و M.corula قادر به باززائي هستند.
۸- رانده مان باززائي (تعداد جنين به ازاء هر پلات آزمايشي) را مي توان توسط بهبود محيط كشت افزايش داد.
۹- باززائي در يونجه اصولاً از طريق جنين زائي سوماتيكي صورت مي گيرد.
۱۰- اساساً هر بافت ريز نمونه بدست آمده از ژنوتيپ باززائي كننده كه كالوس تشكيل دهد مي تواند به گياه باززائي شود (۲۴).

انواع كشت بافت گياهي:
كشت بافت را مي توان بر اساس نوع بافت كشت شده به انواع زير تقسيم نمود:
۱- كشت جهت توليد كالوس:
اگر يك بافت تمايز يافته از گياه جدا شده و تحت شرايط آزمايشگاهي كشت گردد و توليد توده تمايز نيافته اي به نام كالوس نمايد آنرا كشت كالوس گويند. (۱)
۲- كشت جنين:

در اين نوع كشت پس از حذف پوستة بذر، جنين از بذر رسيده يا بذر نارس جدا شده و به عنوان جنين رسيده يا جنين نارس كشت مي گردد. (۱)
۳- كشت اندام گياهي:
شامل كشت برگ، دانه كامل، دانه نصفه، مريستم، نوك ساقه، ريشه، پرچم، تخمدان و ساير اندامها مي باشد. (۱)
۴- كشت سلولي يا كشت معلق:
سلولهاي منفرد كه با استفاده از آنزيمها يا با روشهاي مكانيكي از يك بافت گياهي يا كالوس بدست مي آيند و در محيط مايع در حين تكان دادن كشت مي گردد. (۱)

۵- كشت پروتوپلاست:
به كشت پروتوپلاستهايي كه در اثر هضم آنزيمي ديواره سلولي آن بوجود آمده اند اطلاق مي شود. (۱)
كشت سوسپانسيون:

از نظر تعريف به مجموعه اي از سلولها كه در يك محيط كشت مايع شناور بوده و رشد و تكثير پيدا مي كنند سوسپانسيون سلولي گفته مي شود. سوسپانسيون سلولي معمولاً با انتقال قطعاتي از كالوس به يك محيط كشت مايع بوجود مي آيد. البته اين محيطهاي كشت بايد مرتباً توسط يك تكان دهنده تكان داده شوند كه اين كار باعث هوادهي به سلولها شده و از تجمع مواد رسوبي جلوگيري مي كنند (۸۱) اولين بار در سال ۱۹۵۶ اي. ام. شانتر، كشت تعليقي نمونه اي از ريشه هويج را گزارش نمود. وي توانست از اين نوع كشت بافت، گياهچه اي جديد ايجاد كند. ظروف حاوي اين نوع كشت سلولي را معمولاً در دستگاههاي چرخنده و يا تكان دهنده قرار مي دهند، تا از چسبيدن سلولها به همديگر جلوگيري شود. مواد متشكله مادة غذايي محلول كاملاً شبيه موادي هستند كه در مادة غذايي نسبتاً جامد براي رشد كالوسها بكار برده مي‌شود با اين تفاوت كه شامل آگار نمي باشد. ]۸۱ و ۴۸[

اگر تكه هاي كالوس به محيط غذايي مايع منتقل شوند و محيط كشت شيكر مرتباً تكان داده شود، ممكن است سلولهاي منفرد يا توده هاي متشكل از چند سلول در محيط جدا شوند. اين سلولها در اثر تقسيم مجموعه سوسپانسيون سلولي را تشكيل مي دهد. همچنين، ممكن است از يك سلول منفرد و يا توده كوچكي از سلولها كه بصورت مكانيكي جدا شده اند، گياهچه توليد نمود. بازيابي گياه از كشتهاي سوسپانسيون سلولي مشكل تر از بازيابي گياه از بافت كالوس مي باشد. كشت معلق معمولاً از كالوس تهيه مي شود زيرا سلولهاي آن به آساني از هم جدا شده و به راحتي باززايي صورت مي گيرد. ]۴۸ و ۴۹[
مراحل رشد كشت سلولي:

پس از اينكه نمونه گياهي مثلاً كالوس در محيط كشت مايع قرار گرفت، در ابتدا براي مدتي هيچگونه رشد و افزايش قابل توجهي در تعداد سلولها مشاهده نمي‌گردد. به اين مرحله، مرحلة ركود اوليه گفته مي شود. سپس تعداد سلولها به صورت تصاعدي افزايش يافته و سپس افزايش سلولي به صورت خطي ادامه مي يابد پس از آن سرعت تقسيم سلولي بتدريج كاهش يافته و وارد مرحله ثابت مي شود. (۹۷ و ۹۹)
زمان واكشت هنگامي است كه تعداد سلولها در حد ماكزيمم در واحد حجم باشد.
ضمناً اگر تعداد سلولها در محيط كشت خيلي كم باشد تكثير بلندي صورت مي گيرد يا متوقف مي شود (۹۷)
براي واكشت تا مقداري از سلولهاي سوسپانسيون را به محيط كشت تازه اضافه مي كنيم يا اينكه مقداري از محيط كشت تازه تهيه شده و استريل را به محيط كشت قبلي مجموعه همراه با مجموعه سوسپانسيون اضافه مي كنند]۹۸[
مبحث كشت سوسپانسيون در يونجه براي توليد بذر مصنوعي مورد توجه قرار گرفت.]۷۱ [

بذر مصنوعي يونجه و كاربرد آن:
بذر مصنوعي پديده نويني است كه مشابه بذور بوتانيكي مي باشد و شامل يك جنين سوماتيكي است كه با يك پوشش حفاظتي احاطه شده است. پوشش بذر مصنوعي بايستي خطري براي جنين نداشته باشد و جنين را در مراحل كشت، حمل و نقل و نگهداري، حفاظت نمايد و همچنين اجازه رشد به جنين بدهد بدون اينكه تغييراتي را پديد آورد. بذور مصنوعي ممكن است حاوي مواد غذايي به شكل اندوسپرم مصنوعي و نيز مواد لازم براي رشد و نمو باشد. پوسته دومي نيز ممكن است براي ممانعت از خشك شدن كپسول بكار رود. (۱۹ و ۲۰ و ۲۱)

بسياري از گياهان كه از طريق كشت بافت و سلول تكثير مي شوند، اغلب نمي توانند بوسيله بذر تكثير يابند. بعلت كاهش ثبات ژنتيكي صفات مطلوب در اين گياهان نمي توان از بذور آنها استفاده نمود. براي غلبه بر اين مشكل، تكثير از طريق كشت بافت مي تواند مفيد واقع شود. اما در اغلب گياهان زراعي استفاده از اين تكنيك پرهزينه است.
در ضمن استفاده گلخانه اي، تكثير قلمه و ساقه نيز پرهزينه بوده و بوسيله گياه مادري محدود مي شود يا بعبارتي تعداد محدودي از هر گياه بدين روش مي توان تهيه نمود در صورتي كه اين محدوديت بوسيله استفاده از سيستم بذر مصنوعي از بين مي رود. (۱۹ و ۲۰ و ۲۱ و ۷۱)
كاربرد بيوتكنولوژي:

بيوتكنولوژي كاربردهاي بالقوه زيادي براي بهبود و اصلاح يونجه ارائه مي‌دهد. ژنهاي زيادي در يونجه كه براي مهندسي ژنتيك پيشنهاد شده و روي آن كار صورت گرفته زياد مي باشد. ژن مقاومت به علف كش، ژن هضم كننده آنزيمهاي هضم پروتئين ژن مقاومت به آلومينيم و … كه توسط مهندسي ژنتيك مورد مطالعه قرار گرفته است. (۱، ۷ و ۹)
كاربرد ديگر بيوتكنولوژي، انتخاب سلولي است، وقتي يك صفت در سطح يك سلول بروز مي كند. در يونجه لاين هاي سلولي مقاوم به ايتونين و سموم فوزاريوم شناسائي و از آنها استفاده شده است. همچنين شناسائي و كاربرد لاين هاي سلولي مقاوم به شوري خشكي كه بطور عمده اي در يونجه مورد بحث قرار مي گيرد. (۱۹ و ۲۳ و ۳۷ و ۳۸)
جدايي جنين و تكنيك هاي كشت پروتوپلاسم براي هيبريداسيون سوماتيكي يونجه بكار مي رود. با اين روش مي توان بين گونه هاي يكساله Medicago و ساير حبوبات مثل اسپرس هيبريدهائي تهيه نمود كه در حالت معمولي امكان آن نمي رود. (۱۹ و ۲۳ و ۴۷)

پتانسيل بذور مصنوعي:
جنين هاي سوماتيكي يا بذور مصنوعي متدي را براي ايجاد گياه فراهم مي كنند كه از طريق كشت بافت ميسر مي شود. (۷۱)

كاربرد بذر مصنوعي:
دليل عمده بهبود بذور مصنوعي رسيدن به ايجاد ثبات و عمل كرد مطلوب است. تكنيكهائي مثل تكثير رويشي و توليد بذور هيبريد و قلمه كه بطور قابل ملاحظه اي يكنواختي را افزايش مي دهند، در بسياري از واريته ها مطلوب نبوده و يا پرهزينه است. تكنولوژي بذور مصنوعي مي تواند منابع موجود در سيستم هاي تكثير گياهي مثل ريزازديادي و قلمه را فراهم نمايد. سودمندي عمده بذور مصنوعي توليد در مقياس بالا و با هزينه كم مي باشد. اگرچه سيستم بذور مصنوعي مي تواند بسياري از نواقص متدهاي ديگر جبران كند، اما پذيرش اين تكنولوژي به اهميت گياه و هزينه توليد، بستگي دارد (۷۳)

از نظر تئوري، توانائي كاربرد يك پروپاگول (propagule) كوچك چند ميليمتري به جاي يك گياه يا نهال بزرگ چند سانتيمتري، انعطاف پذيري زيادي را براي تكثير در مقياس يالا فراهم مي كند. هرگاه يك پروپاگول به اندازه يك بذر قابل توليد باشد، انتخاب گونه ها براي ازدياد كلني هاي گياهي وسعت يافته و محصولات براي عملكرد و شرايط محيطي مي توانند بهبود يابند. اندازه پروپاگول ها براي نگهداري كشت، حمل و نقل و … بخوبي وقتي تعداد زيادي از آنها مورد نياز باشد، مهم است در صورتي كه مواد گياهي بزرگتر براي طي مراحل فوق سخت تر و پرهزينه تر خواهد بود. با كشت مستقيم پروپاگول ها در خاك مراحل قبل از كشت كه معمولاً جهت سازگاري بكار مي رود، خودبخود حذف خواهد شد.

بذور مصنوعي براي تكثير هيبريدهائي كه با دست گرده افشاني شده اند، ژرم‌پلاسم گياهي و گياهاني كه دست ورزي ژنتيكي شده اند، بخصوص براي تكثير ژنوتيپ هاي تاپايدار و عقيم بكار مي رود، استفاده از بذور مصنوعي، نيازمندي به تشكيل ثبات ميتوزي در تغييرات ژنتيكي را حذف مي كند و ممكن است براي حفاظت نيز سودمند باشد. بذور مصنوعي وقتي كه باروري بذر كاهش مي يابد، مثل هيبريداسيون بين گونه اي و بين جنسي، در تركيب مواد ژنتيكي مختلف مناسب خواهد شد. در اين تلاقي ها كه يا بصورت جنسي و يا غيرجنسي صورت مي گيرد، مثل استخراج سيتوپلاسمي، توليد سيبريد، انتقال ژن منفرد، تكنيك بذر مصنوعي مفيد خواهد بود. (۲۰ و ۲۱ و ۲۳ و ۴۵)

آقاي Redenbaugh و همكارانش (۱۹۸۴ و ۱۹۸۶) كشف كردند كه هيدروژل‌هائي مثل آلژينات سديم مي تواند براي توليد بذور مصنوعي بكار روند. فراواني توليد گياه از بذور مصنوعي يونجه ۸۶ درصد در شرايط invitro و ۲۰ درصد در شرايط گلخانه اي بود. آقاي Vamdkawd در سال ۱۹۸۴ در يك كنفرانس در ژاپن مي گويد: اگر يك جنين كاذب از هر سلول كشف شده بوجود آيد، مي توان بوسيله بعضي از تيمارها، آنها را نگهداري نمود و بفروش رساند و كشاورز نيز به آساني مي تواند از آنها استفاده كند و اين بذور مي توانند جانشين بذور حقيقي شوند و با اين تغيير سيستم هاي اصلاح نباتات نيز تغيير مي يابد. او مشاهده نمود كه محدوديت هاي زيادي در اين متد وجود دارد. آقاي

Walgate مي گويد ما مي توانيم هميشه جنين هاي سوماتيكي يونجه را در يك نوع لعاب بپوشانيم و به رويش ۱۰۰ درصد برسانيم ولي جزئيات كار خويش را ارائه ننمودند. Syluie binachi نيز مشخص مي كند كه جنين هاي سوماتيكي يونجه انتخابي مي توانند با آلژينات سديم كپسوله گردند. البته جنين هاي سوماتيكي ساير محصولات نيز داراي پتانسيل كپسوله شدن هستند، اما نتايج حاصله از اين محصولات بخوبي كپسولهاي يونجه نيست. Lutz و همكارانش روي جنين هاي هويج كار كردند. آنها جنين هاي سوماتيكي هويج را با لايه ژلاتين كپسوله كردند. و اين جنين هاي مصنوعي، جوانه زده و از كپسول خود خارج شدند. نتيجه تحقيقات آنها اين بود كه عامل محدود كننده توليد گياه در اين سيستم، كيفيت پائين جنين هاي سوماتيكي است.

 

امكانات مورد نياز براي كشت بافت و سلول گياهي:
اندازه و وضعيت كشت بافت و وسعتي كه آماده شده، بوسيله طبيعت ناشناخته و فراهم بودن سرمايه تعيين مي شود. بهرحال يك آزمايشگاه كشت بافت وسايل و آمادگي هاي زير را فراهم خواهد كرد (الف) شستشو و نگهداري وسايل شيشه اي وسايل پلاستيكي و ديگر لوازم آزمايشگاهي (ب) تدارك، استريل كردن و نگهداري محيطهاي كشت (ج) استريل ساختن مواد گياهي (ح) حفظ و نگهداري كشت ها در شرايط كنترل شده از نظر دما، نور و در صورت امكان رطوبت (هـ) مشاهده كشت ها

حداقل دو آزمايشگاه و يا دو اطاق مجزا بايستي بدين منظور فراهم كرد. يكي براي شستشو و نگهداري وسايل آزمايشگاهي و تدارك محيطهاي كشت كه به آن اطاق محيط كشت (Media room) مي گويند و ديگري اطاق يا آزمايشگاهي است كه بمنظور نگهداري كشت ها فراهم مي شود كه به آن اطاق كشت (Culture room) گويند. اطاق كشت بايستي داراي يك ميز مشاهده كشت مجهز به بيونوكولر بوده و به قدر كافي داراي نور بسته به شرايط محيطي آزمايشگاه، كابينت انتقال استريل بايستي در اطاق كشت، در گوشه آزمايشگاه معمولي و يا بصورت اطاق انتقال ويژه، تعبيه شود.
وسايل معمول مورد نياز براي تهيه محيط كشت شامل موارد زير مي باشد:

الف- جاي ظروف با ارتفاع مناسب براي كارهاي ايستاده.
ب- فريزر با برودت بسيار بالا براي نگهداري محلول ذخيره، محلول ها يانزيم، شير و نارگيل و …
ج- يخچال براي نگهداري مواد مختلف شيميايي، مواد گياهي، نگهداري كوتاه مدت محلول هاي ذخيره و …
د- تنگ پلاستيكي براي ذخيره آب مقطر.
هـ – ترازو.
و- هات پليت (hot plate) با همزن مغناطيسي براي حل مواد شيميائي.
ز- PH متر.
ح- يك هواكش يا پمپ خلاء براي تسهيل در امر استريلاسيون.
ط- ديگ بخار براي گداختن آگار.
ي- اتوكلاو يا خوراك پز فشاري خانگي براي استريلاسيون محيطهاي كشت.
يخچال . فريزر وسايل فوق را مي توان در سالن يا اطاقي خارج از اطاق محيط كشت قرار داد. ترازو نبايستي در اطاق محيط كشت نگهداري شود.
اطاق كشت:

بحث و نتيجه‌گيري

فصل چهارم
بحث و نتيجه گيري:
انتخاب ارقام يونجه:
جهت مقايسه كال زايي، جنين زايي و باززايي گياه از بذور جمعيتهاي قره يونجه، رنجر و واريته سنتتيك دانشكده كشاورزي تبريز استفاده شد.
محيط القاء كال:

در مورد ريز نمونه هاي برگ و هيپوكوتيل حدوداً ۴ روز بعد از قرار دادن ريزنمونه ها در محيط القاء كال، اولين علايم آغازيدن كال روي ريز نمونه ها مشاهده شد. به اين صورت كه ابتدا هيپوكوتيل متورم و سپس اپيدرم لايه لايه شده و سلولهاي زيرلايه اپيدرمي شروع به تقسيم كرده و كال زايي آغاز شد. پس از ده روز براحتي كال در زير نمونه ها قابل مشاهده بود. (شكل ۳و۴و۵) در مورد ريزنمونه بذر پس از ۷ روز از قرار دادن ريزنمونه ها در محيط القاء كال اولين علائم آغازيدن كال روي ريزنمونه ها مشاهده شد به اين ترتيب كه بذرها متورم شده و سپس كال زايي آغاز شد پس از ۱۴ روز براحتي كال در ريزنمونه ها قابل مشاهده بود. بعد از ۲۰ روز، كال رشد كرده از ريزنمونه هاي برگ و هيپوكويتل آمادة بازگشت شد و كالهاي حاصل از ريزنمونه بذر پس از ۳۰ روز آماده بازگشت شد. كالوسهاي بدست آمده كرمي و ترد بودند (شكل ۶ و ۷). قبل از بازگشت از آنجا كه همة نمونه ها در محيط SH، ۱۰۰ درصد جنين‌زايي داشتند، فقط قطر كالها به عنوان فاكتور مورد اندازه گيري بررسي شد.