سير تحويل تصفيه و تخليص سرمهاي درماني

در اوايل سرمهاي درماني كه توسط پادزهر اسب تهيه مي شد به صورت خام به مصرف مي رسيد. بدين ترتيب كه پس از تزريق دزهاي معيني از زهر به بدن حيوان و اندازه گيري ميزان پادزهر توليد شده، عمل خون گيري از اسب انجام قرار مي گرفت.
سپس خونهاي گرفته شده در استوانه هاي شيشه اي كه داخل سرپوش فلزي آنها وزنه سربي آويزان شده بود، مي گرفت.
چند ساعت پس از خونگيري وزنه سربي به آ‎رامي رها مي گرديد و خونابه به تدريج در ظرف يك تا دو روز جدا مي شد و اين وزنه با فشار روي لخته مقدار بيشتري سرم را مجزا مي كرد، سپس سرم شفاف و عاري از گويچه ها را به كمك سيفون خارج كرده و با افزودن مقداري فنل محلول در اتر، سرم را براي چند ماه تا يك سال در سردخانه رها مي كردند. در اين مدت مقدار زيادي آلبومين و پروتئين هاي غير اختصاصي رسوب مي‌كرد و پس از حذف رسوبات، سرم شفاف را پس از تعيين عيار به حجم هاي حدودي ۵۰۰ تا ۱۰۰۰ واحد بين المللي تقسيم نموده و پس از تأييد آزمايش هاي لازم ستروني و بي ضرري و حسن اثر، محصول نهايي آماده عرضه و مصرف پزشكي مي‌گرديد.

چنين سرمي طبعاً داراي آلبومين ها و پروتئين هاي غير اختصاصي سرم اسب بود و ناگزير بدن بيمار پس از تزريق نسبت به تمامي پروتئين هاي موجود در سرم اسب حساس مي شد و استفاده از سرم اسبي براي بار دوم معمولا با عوارض و آلرژي توأم بود.
از اين رو در دهه هاي قبل از جنگ جهاني دوم مسئله تصفيه سرم و تخليص آن بسيار مورد توجه بود.
روش هاي متعددي براي تصفيه سرم به كار گرفته شده بود كه در زير به پاره اي از آن ها به طور اختصار اشاره مي شود.

در سال ۱۹۰۳ در انگلستان ايمري مسئله تصفيه سرم با آنزيم ها را مطرح كرد ولي از كار او استقبال زيادي نشد. چرا كه به ازاي از بين رفتن پروتئين هاي غير اختصاصي پاره اي از پروتئين هاي اختصاصي هم از بين مير فت. در سال هاي ۱۹۳۹-۱۹۳۶ پارفنچف دانشمند لهستاني بررسي هاي جالبي در ضميمه تصفيه سرم به كمك پپسين و سولفاتها در آمريكا به ثبت رساند.
در سال ۱۹۵۴ در انگلستان ككويك و همكاران آنها از اتر به عنوان رسوب دهنده پروتئين ها استفاده نمودند.

بنزهاف نيز روشي را ارائه كرد كه با دناتوراسيون حرارتي و Salting out كار تصفيه صورت مي گرفت.
سيستم سولفات سديم هاوو كه با افزايش تدريجي غلظت سولفات سديم در پلاسما بود نيز يكي از روش هاي تصفيه بود.
سيستم سولفات آمونيوم وودورث هم تا قبل از سيستم تصفيه با اتانل سرد يكي از كارآمدترين روش هاي تصفيه سرم درماني بود.
بعدها كوهن روش اتانل سرد را ابداع كرد كه جامع ترين روش در آمريكا بود، در اين روش با تغيير غلظت الكل اتيليك در سرما پروتئين هاي پلاسما به پنج جزء اصلي تقسمي مي شوند. مزيت استفاده از اين روش اين است كه به آساني مي توان موقع خنك كردن گلوبولينها با تبخير آزاد كرده و برطرف شوند و عيب اين روش هم اين است كحه تمامي اين مراحل بايد در سرما انجام شود. و عده اي از پروتئين هاي پلاسما پس از تماس دائم با الكل خاصيت ابتدايي خود را از دست مي دهئند و بي عمر مي شوند.

تصفيه و تخليص سرمهاي درماني:
از ميان تكنيك هاي متعدد تصفيه و و تخليص پروتئين ها، روش هاي رسوبي متداولترين و با سابقه ترين روش جداسازي پروتئين هاي پلاسما محسوب مي شوند كه در مقياس وسيع جهت توليد فرآورده هاي بيولوژيك مانند سرم هاي درماني كاربرد داشته اند.
در جداسازي پروتئين هاي پلاسما با تكنيك هاي رسوبي ميزان حلاليت داراي اهميت مي باشد كه به خصوصيات حلال و ساير اجزا مخلوط پلاسما مربوط است.
مهمترين عوامل موثر بر حلاليت پروتئين هاي عبارتند از: PH ، قدرت يوني، دما و ثابت دي الكتريك

رسوب دادن با تغيير PH:
يكي از ساده ترين روش هاي جداسازي پروتئين ها به طريقه تنظيم PH محلول در نقطه ايزوالكتريك پروتئين مورد نظر براي ايجاد رسوب مي باشد.
ولي از اين روش براي خارج كردن پروتئين هاي نامطلوب از مخلوط استفاده مي شود. و براي رسوب دادن پروتئين ها به دليل احتمال دناتوره شدن پروتئين ها كاربرد ندارد.
رسوب دادن توسط كاهش قدرت يوني:

برخي از پروتئين ها را مي توان با كاهش قدرت يوني رسوب داد ولي از آنجا كه براي اين كار بايد به محلول پروتئين ها اب اضافه شود، لذا با كاهش غلظت پروتئين هاي محلول، افزايش حلاليتئ آنها دور از انتظار نيست. از اين رو اين روش اغلب در مراحل پاياني خالص سازي، كه غلظت پروتئين ها در محلول به قدر كافي افزايش يافته، استفاده مي شود.
رسوب دادن با افزايش قدرت يوني:

پديده Salting out شالوده تعدادي از تكنيك هاي مهم جداسازي و تخليص پروتئين هاست كه با ايجاد غلظت بالايي از نمك خنثي در محلول پروتئيني و رسوب دادن بخشي از پروتئين ها موجب تفكيك و خالص سسازي و تغليظ آنها مي گردد و از رايج ترين روش هاي جداسازي به طريقه رسوبگيري به شمار مي رود.
مطالعه پديده Salting out پروتئين هاي سرم به كمك آناليز و سانتريفوژ نشاندهنده تاثير پيچيده نمك روي پروتئين ها است.
مشخص شده است كه بين حلاليت نمك و تاثير آن در رسوب پروتئين ها رابطه مستقيم وجود دارد. اين ايده مبناي نظريه دباي در توجيه پديده مذكور مي باشد كه به بيان ساده مي گويد:
يون هاي نمك اكثر ملكول هاي قطبي محيط (حلال) را به طرف خود جذب كرده و اطراف مولكول هاي پروتئين از آنها خالي مي گردد و متعاقباً بدنبال برخورد هاي تصادفي مولكول هاي پروتئين با يكديگر تجمع مولكولي ايجاد و رسوب تشكيل مي شود.

هرگاه نمك به محيط اضافه شود مولكول هاي حلال قطبي از اطراف پروتئين به طرف يون هاي نمك جذب مي شود و مولكول هاي پروتئين به طور تصادفي در مجاورت يكديگر قرار مي گيرند، در حالي كه لايه آب به شكل موثر وجود ندارد تا مانع جذب آنها به يكديگر شود، در نتيجه تجمع يافته و تشكيل رسوب مي دهند.
پروتئين هاي بزرگتر كه سطح بيشتري دارند (مولكول هايي با گروههاي غير قطبي) با مقادير نمك كمتري رسوب مي كنند و مولكول هاي كوچكتر كه گروههاي غير قطبي كمتري دارند در غلظت هاي زيادتر نمك رسوب مي نمايند.
به دنبال بررسي هاي كمي پديده Salting out رابطه اي خطي بين لگاريتم حلاليت يك پروتئين معين و قدرت يوني محلول در قالب معادله خط بيان مي گردد:

در رابطه فوق:
= حلاليت پروتئين = عرض از مبداء
= قدرت يوني محلول = شيب خط يا Salting out constont
براي يك پروتئين و نمك معين، مستقل از دما و PH است ولي به طور مشخص، تحت تاثير هر دو عامل ياد شده قرار دارد.
در روش هاي مبتني بر Salting out معمولا جداسازي يك پروتئين معين به صورت رسوب در PH نزديك نقطه ايزوالكتريك آن پروتئين بيشترين بازده را دارد. همچنين ممكن است در غلظت بالاي نمك پروتئين ها در بيش از يك PH حداقل حلاليت را نشان دهند كه مي تواند به دليل تشكيل نمك هاي نامحلول پروتئين در آن PH خاص باشد.
ميزان تاثير نمك در پديده مورد بحث به طبيعت آنيون و كاتيون ، حاصل از تفكيك يوني نمك خصوصاً به آنيون آن مربوط مي شود. موثرترين آنيون ها، آنيون هاي چند ظرفيتي و موثرترين كاتيونها، انواع يك ظرفيتي آنها مي باشند. ميزان كارآيي آنيون ها و كاتيون ها به صورت زير است:

آنيون ها :
كاتيون ها :
نمك هاي خنثي كه در اين تكنيك ها مصرف مي شود بايد حتي المقدور خالص بوده و از حلاليت بالايي برخوردار باشند، به هنگام حل شدن تغيير قابل ملاحظه اي در PH و دماي محلول ايجاد نكنند و ارزان باشند. نكته آخر اين چگالي محلول پس از افزودن نمك به نحوي تغيير ميابد كه سانتريفيوژ را با مشكل مواجه نمايد. از ميان انواع نمك هايي كه مصرف آنها متداول است سولفات آمونيوم به دليل ارزاني و حلاليت مناسب بيش از ساير نمك ها به كار گرفته شده است.
چگالي محلول اشباع آن در حدود ۲۳/۱ است كه ممكن است در عمل پس از اضافه كردن به محلول پروتئين چگالي آن با افزايش دهد و سانتريفيوژ را با مشكل مواجه نمايد و همچنين اندكي محلول را اسيدي مي‌كند كه در صورت لزوم مي توان از بافر مناسب استفاده كرد.