مقدمه
ازهنگامي كه ذرات ويروسي براي اولين بار در سال ۱۹۶۲ در بافتهاي خوراكي biporus Agaricus توسط هولينگزمشاهده شد. ويروسها و ذرات شبه ويروسي (VLPs ) متجاوز از ۱۰۰ گونه مختلف متعلق به گروههاي عمده قارچها گزارش شده است. همچنين هولينگز در۱۹۷۸ تخمين زد كه قارچ ويروسها ممكن است درحداقل ۵۰۰۰ گونه از قارچهاوجودداشته باشد.استفاده ازواژه ذرات شبه ويروسي به جاي ويروس درمواردي بكارمي رود كه«قارچ ويروس» جدا نشده ومشخصات آن نيز تعيين نشده است .

اغلب مي توان آنها را در آلودگيهاي رايج قارچي مشاهده كرد كه دربعضي صفات خاص شبيه ويروسهاي متداول هستند و در ژنوم آنها نيز شباهتهايي با پلاسميدها وجود دارد. غالباً داراي RNA دورشته اي و چند قسمتي بوده كه اين قطعات معمولاً جداگانه ولي درون ذرات شبيه هم قرار دارند.
قارچ ويروسها اغلب داراي ذرات ايزومتريك به قطر nm48-25 هستند ولي ذرات باسيلي فرم، ميله اي فرم و ذرات گرد خال مانند(Herpeslike) نيز گزارش شده است.انتقال آنها اغلب طي تقسيمات سلولي و تركيب سلولي و توليد اسپور در ميزبان قارچ صورت مي گيرد. هنوز ناقل طبيعي كارايي براي آنها شناخته نشده است كه شايد به همين دليل داراي دامنه ميزباني محدودي در بين گونه ها و جنسهاي قارچها مي باشند.

نكته قابل توجه اين است كه مايكوويروسها سبب آلودگيهاي پنهان در قارچهاي ميزبان خود مي شوند, همچنين در آلودگيهاي ويروس در مخمرها همراه بودن پروتئينهاي كشنده كاملاً محرز است.
اخيراً ازآنها دركنترل بيولوژيك وايجاد نژادهاي كم تهاجم قارچي(Hypovirulent) وهمچنين فعاليتهاي بيولوژيكي آنتي ويروسي و آنتي توموري و … استفاده مي شود.

تاريخچه :
ازهنگامي كه ذرات ويروسي براي اولين بار در سال ۱۹۶۲ در بافتهاي خوراكي biporus Agaricus توسط هولينگزمشاهده شد. ويروسها و ذرات شبه ويروسي (VLPs ) متجاوز از ۱۰۰ گونه مختلف متعلق به گروههاي عمده قارچها گزارش شده است. همچنين هولينگز در۱۹۷۸ تخمين زد كه قارچ ويروسها ممكن است درحداقل ۵۰۰۰ گونه از قارچهاوجودداشته باشد.

دلايل نا شناخته ماندن آنها :
مايكوويروسها به چهار دليل از ويروسهاي روي گياهان و حيوانات و باكتريها ديرتركشف شدند.
۱٫ بسياري از قارچهاي تحت تأثير ويروس علائمي از خود نشان نمي دادند.
۲٫ در مورد قارچهاي رشته اي ممكن است تحقيق كردن در مورد آنها يا ايزوله كردن آنها از منابع طبيعي سخت باشد. زيرا ايزوله هاي آنها يا خوب رشد نمي كنند و يا در شرايط آزمايشگاهي كولونيهايي مي دهند كه با كلونيهاي ايجاد شده توسط آنها در طبيعت متفاوت است.

۳٫ انتقال آزاد سلولي يا خالص سازي ويروس مشكل است و بايد تحت شرايط كنترل شده دقيق صورت گيرد تا طي تلقيح ويروس خالص سازي شده, همان آلودگي ناشي از اسپورهاي قارچي هوازاد آلوده به اين ويروس در ميزبان زراعي را ايجاد كنند.
۴٫ بيماريهاي قابل انتقال قارچي نظير victoria Helminthosporium را يك بيماري ويروسي مي دانستند در صورتيكه با تكنيكهاي ويروس شناسي قابل شناسايي نبودند. با وجود اينكه علائم آنها شبيه بيماري ويروسي نبود دانشمندان آن را بيماري ويروسي تصور مي كردند كه اتفا قاً از روي همين علائم و تضادها اولين مايكوويروسها كشف شدند.

 

كليات:
انواع مورفولوژيكال متعددي از اجسام شبه ويروسي در قارچها يافت شده اند و مقدار كمي از اينها ( VLPs ) از قواعد ويروسها تبعيت مي كنند . استفاده از واژه شبه ويروس به جاي ويروس در مواردي بكار مي رود كه «قارچ ويروس» جدا نشده و مشخصات آن نيز تعيين نشده است . و واژه ويروس براي ذراتي كه از نظر مورفولوژيك مشابه ويروس هستند, خالص سازي شده و ژنوم اسيد نوكلئيك در يك پوشش پروتئيني در آنها مشاهده شده است . با وجود اينكه در مواردي عفونت زايي هم ندارند.

جدولي در سال ۱۹۸۶ ارائه شد كه شامل حدود ۲۰۰ (VLPs ) در متجاوز از ۱۰۰ گونه قارچ بود. به دو دليل اعتقاد داشتند كه تعدادواقعي ( VLPs ) از اين مقدار ممكن است كمتر باشد:
۱٫ بعضي از VLP ها ممكن است داراي ژنوم دوقسمتي باشند به عنوان مثال, VLP هاي ايزومتريك ظاهراً با ابعاد اندازه گيري شده مختلف كه در

آزمايشگاههاي مختلف اندازه گيري شده اند در واقع مشابه هستند اين موضوع با اندازه گيري ابعاد ذرات,از يك نژاد مشابه Penicillium chrysogenum كه ابعاد آن از ۴۰ ـ ۳۵ نانو متر متغير است مشخص مي شود . متغيرهاي زيادي هستند كه اندازه گيري ابعاد اين ذرات را توسط ميكروسكوبهاي الكتروني تحت تأثير قرار مي دهند. از جمله اين عوامل متغير مي توان به ۱ـ رنگ استفاده شده ۲ـ درجه خلوص ويروس

۳ـ تجمع ذرات ويروس ۴ـ استاندارداهايي كه در كاليبراسيون استفاده مي شود, را نام برد.از اين رو زمانيكه اين ذرات با اندازه هاي مختلف متعدد از يك گونه خاص قارچ گزارش شدند اغلب كاملاً مشخص نيست كه دقيقاً چند نوع مختلف VLP را ارائه داده اند. بطور مثال در Pyricularia oryzae دو ذره به ابعاد nm30 وnm 45 از يك آزمايشگاه و دو ذره ديگر با ابعاد nm 36 ـ ۳۵ و nm 25 از آزمايشگاه ديگر گزارش مي شود حال معلوم نيست كه اين گزارشات مربوط به ۴ ( VLPs ) مجزا هستند و يا هر دو اندازه ذرات مذكور در آزمايشگاههاي مختلف متفاوت به همان دو ذره ( VLPs ) بر مي گردد.

بعضي از VLPها ممكن است در واقع ويروس نبوده بلكه با عناصر ويروسي اشتباه گرفته شوند بطور مثال از عناصر سلولي كه ممكن است در برشهاي بسيار باريك تهيه شده جهت بررسي با ميكروسكوپ الكتروني با VLP ها اشتباه شدند مي توان گرانولهاي گليكوژن و ذرات گاما را نام برد.
درتحقيقي جهت بررسي اين امركه آيا امكان اين هست كه ويروسهايي كه ازنژادهاي مختلف Slime mold , ( Physarum polycephalum) گرفته شده اند بتوانند واكنشهاي بدني را تحت تأثير قرار بدهند محققين متوجه شدندكه علت رفتار مختلف نژادهاي مختلف اين قارچ در اين تستها بخاطر تفاوت در تعداد نسخه هاي اين اجزا هست.

از طرف ديگر اسپكترومتريك نشان داد كه اينها پيك جذب درnm 260 يا nm 280 كه مختص اسيد نوكلئيك و پروتئين هست را ندارند در نتيجه به اين نتيجه رسيدند كه ممكن است اين اجزا گرانولهاي گليكوژن باشند. اين نتيجه گيري با مشاهده حساسيت آن نسبت به آلفا ـ آميلاز قوت گرفت. اين نتيجه در مورد قارچهاي Clindrocladium scoparium , Lentinus edodes , Schizophyllum commune صادق است.

۲٫ اما در مورد ذرات گاما , اين ذرات در زمان اسپوروژنز از گرانولهاي داراي بار شكل مي گيرند. در حدود ۴۰ نانومتر قطرشان هست. در داخل سيسترنهاي شبكه آندوپلاسميك دانه دار ظاهر شده كه با هم آميخته و تشكيل تجمعات nm 100 را مي دهند. در برشهاي عرضي ذرات گاما توسط سه لايه پوشيده شده اند كه لايه بيروني غشاء ليپيدي است. زئوسپورهاي Blastocladiella emersonii داراي ۱۲ ذره گاما و همچنين در ساير كتريديوميستها از جمله Allomyces arboscular , Allomyces macrogenus , Catcuaria anguilulae , Coelomomyces punctatus , Coelomysidium simulii , Olpidium brassicae , Phlyctochytrium irregulare , Rozella allomyces .

ذرات گاما از نظر مورفولوژي و سايز تركيبات پايه DNAها مشابه Poxvirus ها هستند. هيچ شاهدي مبني بر اين نداريم كه اين ذرات گاما , خودشان عفونت زا هستند و يا خودشان توانايي نسخه نويسي را دارند براي همين ناخواسته كانديداي ويروس بودن هستند چون وابسته اند.

شواهد خوبي وجود دارد كه ذرات گاما تشكيل سيتزوم مي دهند. سيتزومها وزيكولهاي كروي هستند كه شامل كمپلكس كتين سنتتاز كه توانايي تشكيل ميكروفيبريلهاي كتين را دارا هستند. كار آنها اين است كه كتين سنتتاز را به سايتهايي كه ميكروفيبريلها انباشته مي شوند در سطح سلولهاي قارچ انتقال مي دهند احتمالاً حضوردر قارچهاي كتين ساز از قبيل Allomyces sp. , Mocur sp. , Neurospora sp. , Saccharomyces sp. , Agaricus sp. و زئوسپورهاي Blastocladiella emersonii كه فاقد ديواره سلولي هستند يافت مي شوند.

در غياب سنتز RNA و پروتئين , در طي تشكيل زئوسپور, ذرات گاما از نظر ظاهري تغير كرده و وزيكولهاي متعددي در حدود nm 80 آزاد مي كنند. اين وزيكولهاي ذرات گاما به سطح اسپور مهاجرت كرده و به غشاء سلولي مي پيوندند كه اين واقعه همزمان با ظهور ديواره اوليه سيست اتفاق مي افتد. در مطالعات Invitro نشان داده شده است كه ذرات گاما ايزوله شده فعاليت كتين سنتتاز را نيز شامل مي شوند. اين ذرات بيشتر به عنوان عناصر سلولي طبقه بندي مي شود و كار و طريقه نسخه نويسي DNA آنها مشخص نيست.

از ساير ساختارهايي كه ممكن است با VLP ها اشتباه شوند بخشهاي كوچك سلولها شامل تجمعات كريستالين پروتئينها مانند الكل دهيدروژناز در Saccharomyces carlsbergensis و گرانولهاي پلي فسفات در برشهاي عرضي از ساختارهاي توبولار دستگاه گلژي و ساختارهاي غشايي ساخته شده توسط دستورالعمل ميتوكندريهاي موجود در سلولهاي مخمر در حال جوانه زني.
همانطور كه گفته شد مسلماً نياز مبرمي به ايزوله كردن و تعيين مشخصات VLP ها يي كه با ميكروسكوپ الكتروني يافت شده اند احساس مي شود قبل از اينكه بطور قطعي بتوان آنها را ويروس ناميد.

مرفولوژي :
ژنوم قارچ ويروس داراي شباهتهايي با ژنوم پلاسميد مي باشد . اغلب داراي ذرات ايزومتريك به قطورnm 25 ـ ۴۵ مي باشند اما گاهي ذرات باسيلي شكل, ميله اي شكل , نخي شكل, گرزي شكل و همچنين ذرات گرد خال مانند Herpslike ) ) گزارش شده است. اغلب داراي dsRNA چند قسمتي بوده كه اين قطعات معمولاً جداگانه ولي درون ذرات شبيه هم قرار دارند. در زير به گروههاي مختلف ( VLPs) با توجه به فرم ذرات و محتوي ژنوم آنها اشاره مي كنيم :

 ذرات ميله اي شكل ( Rod – shaped ) : در قارچهاي آسكوميست, بازيديوميست و قارچهاي ناقص كشف شده اند. كه اين ذرات ميله اي شكل محتوي ssRNA هستند و شامل گروههاي ويروسي:
-Tabamovirus
-Forovirus
-Tobravirus

-Hordeivirus
-Tobaco stunt virus group
كه از جمله اينها مي توان TMV – like particle را نام بردكه بر روي زنگها شامل Puccinia sp. , Coleosporium sp. , sp. Uromyces و سفيدكهاي پودري شامل Erysiphe sp. , Phylactinia sp . , Sphaerotheca sp. ديده شده اند.

 ذرات نخي شكل ( Flexuous Rod – shaped ) : در قارچهاي آسكوميست , بازيديوميستها و قارچهاي ناقص و ماستيگومايكوتينا كشف شده اند. اين ذرات محتوي ssRNA هستند و شامل گروههاي ويروسي :

-Potexvirus
-Clastrovirus
-Carlavirus
-Rice strip virus group
-Potyvirus

كه از جمله اينها مي توان گروه Clastrovirus را كه بر روي
Synchytrium endobioticum عامل بيماري زگيلي سيب زميني از كيتريديوميستهاست را نام برد.
 ذرات باسيلي شكل ( Bacilliform and Bullet – shaped ) : محتوي ssRNA وشامل گروه ويروسي Rhabdoviridae هست كه به عنوان مثال مي توان ذرات alfalfa mosaic virus را كه ذراتي بدون پوشش ( non – involved) هستند و بر روي Agaricus bisporus اثر مي گذارند را نام برد.

 ذرات گرزي شكل ( Club – shaped ) : محتوي dsRNA كه از آن جمله مي توان ويروسهاي روي قارچ Endothia parasitica عامل بيماري سوختگي شاه بلوط Chesnut blight را نام برد.
 ذرات Enveloped pleomorphic : بر روي Neurospora crassa و Saccharomyces sp. ميتوان آنها را يافت .

 ذرات گرد خال مانند ( Herpslike ) : محتوي DNA هستند . اين ذرات خارج سلولي و پوشيده شده با غشاء هستندو بر روي Oomycetes مورد بررسي به موارد زير مي توان اشاره كرد:
ـ Phytophthora parasitica var. parasitica
ـ Schizochytrium aggnegatum

ـ Thraustochytrium sp. ( بيش از بقيه مورد بررسي بوده است.)
 ذراتي با سر و دم (Particle with Heads and Tails ) : اينها را مي توان بر روي Saccharomyces carlsbergensis مشاهده كرد, همچنين از اين گروه به باكتريوفاژهايي كه روي نمونه هاي زراعي از پنيسيليوم پيدا شده اند مي توان
اشاره كرد.

 Geminate particle : محتوي ssDNA مي باشند و روي ايزوله هاي كندرشد از Neurospora crassa يافت مي شوند.
 ذرات ايزومتريك : از نظر محتوي ژنوم به چهار دسته تقسيم مي شوند:
a) dsRNA ها , كه از اين گروه مي توان Penecillium stoloniferum , Penecillium citrinum , Allomyces arbuscular را نام برد.
b) ssRNA ها ,كه از Oomycetes بر روي سفيدك دروغين برنج Sclerophthora macrospora اثر مي گذارد.

c) dsDNA ها , تنها ذرات ايزومتريك بدون پوشش كه بر روي Rhizidiomyces sp. از كيتريديوميستها اثر مي گذارد. ( اين قارچ پارازيت روي Achyla و Saprolegnia از Oomycetes مي باشد.)
d) VLP هايي از قارچهاي پست با ابعادي بين nm200 – ۴۰ كه بر روي قارچ Albugo candida اثر مي گذارد.
 Retrovirus – like particle : اين گروه بر روي Saccharomyces cerevisiae تأثير مي گذارد.

انتقال :
انتقال قارچ ويروسها اغلب طي تقسيم سلولي, تركيب سلولي و توليد اسپور در ميزبان قارچ صورت مي گيرد. هنوز ناقل طبيعي كارايي براي قارچ ويروسها شناخته نشده است و يكي از مشكلات عمده آنها عدم وجود آزمونهاي مرسوم بيماريزايي مثل انتقال با مايه زني عصاره به ميزبان سالم است.

بيشتر قارچ ويروسها رابطه سرولوژيكي با هم ندارند و دامنه ميزباني محدودي در بين گونه ها و جنسهاي قارچها دارند. دليل اين اختصاصي بودن آشكار ممكن است به علت عدم وجود ناقلين مشخص يا نبود روشهاي انتقال آزمايشگاهي خاص باشد تا عدم توانايي آنها به آلودگي گونه هاي قارچي مختلف.

علائم :
هر چند اغلب ويروسهاي گزارش شده بدون علائم بيماري هستند و يا آلودگي نهفته در ميزبانهاي قارچي ايجاد مي نمايند, ولي تأ ثيرات آلودگيهاي ويروسي در قارچ خوراكي كاملاً محرز است.
از جمله علائم روي قارچ Agaricus bisporus به شرح زير است:
۱٫ اسپوروفر يا كلاهك قارچهاي آلوده كوچك, بدشكل و ممكن است چروكيده و يا آبكي باشد.
۲٫ معمولاً ساقه قارچ بيمار در اثر بيماري كشيده شده و قارچ به شكل چوب طبل و يا بشكه اي شكل در مي آيد.

۳٫ كلاهك قبل از موعد باز مي شود.
بايد توجه داشت كه اين علائم ممكن است در اثر عوامل زيست محيطي و زراعي نيز بوجود آيد. بطور كلي بيماريهاي ويروسي روي قارچهاي خوراكي ممكن است علائم مشخصي نداشته باشند و كاهش ميزان محصول در واحد سطح شايد بهترين و مشخص ترين علامت بيماري باشد. ويروس باعث ضعيف شدن و كاهش ميسيليوم قارچ مي شود. اين ميسيليوم در محيط كشتهاي مصنوعي نيز در مقايسه با قارچ سالم از رشد مطلوبي برخوردار نيستند.

 

بيماري ويروسي در قارچ Agaricus bisporus :
قارچ خوراكي Agaricus bisporus در اروپا ۳۰۰ سال و در امريكا حدود يك قرن است كه پرورش داده مي شود اولين بار علائم بيماري آبكي شدن ساقه در سال ۱۹۴۸ توسط برادران لافرانس مشاهده شد كه بنا به همين دليل به بيماري لافرانس هم شهرت يافت, در استراليا و ژاپن تحت نامهاي بيماري x , بيماري قهوه اي, آبكي شدن ساقه و خشكيدگي قارچ ( die – back ) گزارش شده است.

با اينكه علائم خيلي زود مشاهده شد ولي تا مدتها تصور نمي شد كه بيماري ويروسي باشد تا اينكه در سال ۱۹۵۹ گاندي بطور قاطع نشان داد كه اين بيماري بوسيله قطعات ميسيليوم انتشار مي يابد و عامل انتقال آناستموز ميان هيفها بوده كه همين مسئله منجر به دلالت بر يك فاكتور سيتوپلاسميكبه عنوان عامل بيماري شد.

چند سال بعد در سال ۱۹۶۲ هولينگز اولين قارچ ويروس را روي Agaricus bisporus كشف كرد و سپس سه نوع ذره از قسمت ميوه قارچ بيمار در انگلستان بدست آورد كه ۲ ذره آن ايزومتريك و تحت نامهاي MV1 , MV2 ناميده شد و ذره سوم كه باسيلي فرم بود به نام MV 3 ناميده شد.
بعدها دو ذره ايزومتريك ديگر به قطرهاي nm 34 و nm 35 به نامهاي MV4 , MV5 كشف شد. اما رايجترين آنها ذرات باسيلي فرم و ذرات ايزومتريك با قطرهاي nm 25, nm 34 , nm 35 بوده است.اين بيماري موجب خسارت شديد به محصول قارچ خوراكي در بسترها مي شود, همچنين انتقال ويروس از طريق اسپور و بذر قارچ به راحتي صورت مي گيرد.

 

كنترل:
در مراكز پرورش قارچ ممكن است از طريق ميسيليومهاي سالم ( Spawn ) , استريل سازي كمپوست , استريل كردن بسترهاي پرورش قاچ و استفاده از فيلترهاي هوا جهت جلوگيري از ورود اسپورهاي آلوده به ويروس, كنترل مي شود.

 

ارائه دو سيستم مدل از مايكوويروسها
بيماري مسري Helminthosporium victoriae ؛ گواهي براي بيماري شناسي ويروسي
 مقدمه:
حداقل ۴ انگيزه اصلي براي شناسايي و مطالعه عوامل ميرمسي در بيماريهاي قابل انتقال Helminthosporium victoriae مي باشد.
۱٫ بيماري ويروسي H. victoriae سيستمي بوجود مي آورد كه از آن مي توان براي مطالعه در مورد تأثيرات آسيب شناختي قارچ ويروسها در قارچهاي رشته اي استفاده كرد. در اين بررسي ما به اين نتيجه مي رسيم كه اكثريت قارچ ويروسها غير بيماريزا هستند و معمولاً هيچ اثر زيان آوري بر روي ميزبان خود ندارند.

۲٫ علائم اين بيماري به عنوان نشانه هاي با ارزشي در تشخيص و شناسايي قسمت هاي مبتلا شده قارچ كه مورد آزمايش يك دوره ويروسي قرار گرفته است به كار مي رود. تلاشهاي اخير براي به وجود آمدن يك سيستم آزمايشي براي انتقال قارچ ويروس به صورت بدون سلول به علت عدم وجود علائم قابل شناسايي مختل شده است. اخيراً براي شناسايي ميسيليومهاي مبتلا شده نياز است كه مسيسيليوم مجزا با استفاده از كلونيهاي بزرگ قارچي توليد شده و در مورد وجود ويروس و يا اسيد نوكلئيك ويروس مورد بررسي قرار گيرند.

۳٫ H. victoriae يك سيستم مدل علي را براي مطالعه قارچ هاي بيماري كه ميزان بيماريزايي آنها بستگي به ميزان توليد توكسين توسط ميزبان خود دارد را ارائه مي دهد. از آنجايي كه بيماريهاي مربوطه به H. victoriae بصورت Hypovirulent هستند و ميزان توليد توكسين توسط يك ژن كنترل مي شود . مطالعات و بررسي در مورد واكنشهاي درون پلاسما هسته باعث كشف نقش مهم قارچ ويروس ها در بيماريزايي در اين سيستم مي شود و ممكن است در بعضي قارچهاي بيماريزاي ديگر باعث توليد توكسين در ميزبان شوند.

۴٫ با بررسي موارد مبتلا به H. victoriae كه جداسازي شده اند نتايجي بدست آمد كه نشان مي دهد كه آنها اقدام به توليد آنتي بيوتيك به همراه طيف وسيعي از فعاليتهاي ضدقارچي و ضد باكتريايي كرده اند. در نتيجه مطالعات انجام شده , آنتي بيوتيك طبيعي كه به علت اين بيماري توليد مي شود , از آنجا كه هنوز پديده كشنده اي در قارچهاي رشته اي كشف نشده است بسيار مورد توجه است زيرا برخلاف اين آنتي بيوتيك مورد قبول در H. victoriae پروتئين كد شده توسط dsRNA كه در مخمرهاي آلوده به ويروس وجود دارد مي تواند به عنوان عامل كشنده و يا بازدارنده در وارد آمدن آسيب به گياه مربوطه باشند.

علاوه بر اين, تحقيقات انجام شده در مورد بيماري هاي قابل انتقال از H. victoriae نشان مي دهد كه اين سيستم مي تواند زمينه خوبي براي تحقيقات و مطالعات آينده باشد.

 تاريخچه:
در سال ۱۹۴۶ ميلادي عامل در H. victoriae به عنوان عامل بيماري victoria blight در دانه هاي يولاف اعلام شد و مشخص شد كه يك عامل بسيار اختصاصي مي باشد و تنها آن دسته از يولافهايي كه به زنگ تاجدار با عامل Puccinia coronata مقاوم هستند را مبتلا مي كند. بيماري كه با عامل در H. victoriae ايجاد شد كم كم به صورت اپيدمي در آمد تا جايي كه در سال۱۹۴۷ و ۱۹۴۸ باعث ايجاد آسيب و زيان در اكثر مزارع يولاف در امريكا شد . علاوه بر اين كشت و درو گونه هاي ديگر يولاف كه مشتق گرفته از victoria بودند در زمين زراعي لغو شد. اين نوع يولاف به رويش خود در قسمتهايي از جنوب امريكا تا سال ۱۹۵۰ ادامه داد. در سال ۱۹۵۹ از طريق مشاهده و بررسي حالتهاي غيرطبيعي كه در گياه يولاف در ايالت لوسيانا مشاهده شدبه اين نتيجه رسيدند كه نوع بيماري مشتق شده از H. victoriae مي تواند قابل انتقال باشد.

ليندربرگ مشاهده كرد كه بعضي از كلوني هاي H. victoriae كه از يولافهاي مبتلا شده بدست آمد به صورت غيرطبيعي و رشد ناقص پديدار شده اند. به دنبال يك دوره رشد و رويش طبيعي, در بخشهايي از حاشيه كلوني فروريزي همزمان و يا ليز شدن ميسيليومهاي هوازي مشاهده شد و بطور كلي از گسترش كلوني جلوگيري شد. او, اين نمونه از ناهنجاري و وضعيت غير طبيعي را به عنوان يك بيماري اعلام كردو نشان داد كه اين بيماري قابل سرايت به كلوني هاي سالم و طبيعي از طريق آناستموز در تماس با كلوني هاي آلوده مي باشد.

از آنجا كه در بخش لوسيانا گياهان بيمار و سالم از يكديگر جدا شده اند, در جايي كه احتمال بيماري مي رفت نيز مقدار زيادي خسارت اعلام نشد كه اين براي اين نمونه از بيماري مربوط به يولاف غير معمول بود. پس پيشنهاد شد كه كاهش در ميزان بيماريزايي H. victoriae ايجاد شده است و اين خاصيت ممكن است به بيماري هاي قابل سرايت در قارچها منتقل شود.

ايزوله هاي زراعي مبتلا به H. victoriae داراي دو نمونه ويروس اختصاصي بودند كه از نظر سرولوژيكي و الكتروفورتيكالي و با توجه به نحوه رسوب گذاري انتخاب شدند و به نامهاي ۱۴۵s و ۱۹۰s ناميده شدند. نمونه هاي جداسازي شده نرمال حاوي هيچ ويروسي نبودند و يا فقط نمونه ۱۹۰s را دارا بودند. با توجه به مدارك مربوط در آن زمان نتيجه گيري شد كه وجود ويروس ۱۴۵s به تنهايي و يا در تركيب با ويروس ۱۹۰s مي تواند باعث بروز بيماري شود.

 

 ويروسهاي روي H. victoriae :
ويروس۱۹۰s بطور كلي يك ويروس ساده و تك قسمتي است, در حاليكه حاوي يك نمونه خاص از dsRNA مي باشد. ويروس ۱۴۵s احتمالاًيك ويروس تركيبي مي باشد كه داراي ۴ نمونه خاص از dsRNA مي باشد. با تمركز و بررسي بيشتر روي ويروس ۱۴۵s , مشاهده مي شود كه ساختار آن بسيار متغير است و بطور كلي ميزان آن نسبت به ويروس۱۹۰s بسيار كمتر مي باشد؛ نسبت ۱۴۵s به ويروس۱۹۰s ميزان ۱ به ۱۰ مي باشد.

اجزاي dsRNA ويروس ۱۴۵s هيچ ارتباطي با يكديگر ندارند و اين موضوع مشخص نشده است كه آيا اجزاي مركب dsRNA نشان دهنده يك ژنوم تقسيم شده و چند جزئي است و يا يكي يا چند تا از اين اجزا انگل و يا جهش يافته هستند.
از دو روش براي كشف اين دو ويروس استفاده شد:

۱٫ توليد يك سرم پادتن براي ويروس۱۹۰s , كه براي كشف ويروس با استفاده از تكنيك الايزا مورد استفاده قرار گرفت. آنتي سرم مناسب براي ويروس ۱۴۵s در حال حاضر موجود نمي باشد و آنتي ويروس موجود با استفاده از تركيبي از دو ويروس۱۴۵s و ۱۹۰sتوليد شد كه در سيستم الايزا غير قابل استفاده نمي باشد.
۲٫ استفاده از راديو ايزوتوپها كه براي شناسايي و رديابي ويروس ۱۹۰s بكار
مي رود.

 علائم بيماري و محتويات ويروس :
بيماريهاي جداسازي شده از استرينهاي B-1 و A-9 در ابعاد مختلفي شبيه هم هستند . در هر بخش ايزوله حاوي هر دو ويروس۱۴۵s و ۱۹۰s مي باشد كه با سرعتي كمتر از نمونه هاي معمولي رشد كرده اند و توليد بافت ميسيليومي غير طبيعي مي كنند و ممكن است مقدار كمي هاگ نيز توليد كنند. اين دو نمونه به طور كلي بر اساس علامت خارجي بيماري با هم تفاوت دارند. ايزوله استرين B-1 با داشتن فروريختگي هاي سريع و مشخص ميسيليوم هوازي خود, در كلونيهاي در حال رشد در دكستروزهاي گوجه فرنگي قابل مشاهده است. كل ميسيليوم هوازي در روزهاي ۷ تا ۱۰ به كلي فرو ريخت.

نمونهA-9 داراي علائمي از قبيل كلوني رشد نكرده و ناقص همراه با ميسيليوم هاي كم پشت و بطور كلي از افزايش كلوني در روزهاي ۵ تا ۶ جلوگيري شده است . بخشهاي رشته اي متورم شده در روزهاي ۷ تا ۱۰ در كلوني مشاهده شد و همچنين فروريزي ميسيليوم هاي هوازي در مورد نمونه A-9 تنها محدود به PDA مي باشد و در روزهاي ۱۰ تا ۱۴ كاملاً آشكار در محيط مايع مي باشد. مهمترين علامت بارز در محيط مايع رويش ضعيف ميسيليومها مي باشد و همچنين توليد بخش زيادي از ميسيليوم سفيد مي باشد.

اين دو نمونه جداسازي شده حتي در مورد حاوي بودن ويروس ۱۹۰s نيز با يكديگر تفاوت دارند. با اعمال كردن تست الايزا نشان داده شده كه نمونه B-1 داراي مقدار بيشتري از ويروس در مقايسه با نمونهA-9 مي باشد.
نشانه هاي بيماري كه مختص هر يك از اين نمونه ها مي باشند مي تواند شاخص قابل انتخاب براي افزايش ميزان واگيري و سرايت به كار رود و مي توان در تعيين نقش هر كدام از اين دو ويروس در توسعه و گسترش از آن استفاده كرد.

در مطالعات قبلي سه نمونه جداسازي شده ديگر نيز به طور دقيق مورد بررسي قرار گرفت . اين نمونه ها شامل B-2 , HV408 و HW-1 هستند. همه اين نمونه ها داراي ميسيليومهاي طبيعي با هاگزايي بالا روي PDA بودند. همچنين درمورد دو نمونه HV408 و HW-1 با انجام تست الايزا , تشخيص داده شد كه كه آنها عاري از ويروس ۱۹۰s مي باشند. بر خلاف آنها در هنگام نمونه برداري از نمونه B-2 مشاهده شد كه اين نمونه حاوي ويروس ۱۹۰s مي باشد كه البته ميزان آن نسبت به مقدار بدست آمده ۱۹۰s از دو نمونه B-1 و A-9 , بسيار كمتر بوده است. اين نمونه همچنين داراي مقدار بسيار كمي ۱۴۵s مي باشد در صورتيكه در دو كلوني ديگر( B-1 و A-9 ) ,از هر دو ويروس به مقدار زياد مشاهده شد و همچنين معلوم شد كه ميزان وجود ۱۴۵s نسبت مستقيم با شدت بيماري دارد بنابراين علت اصلي بروز بيماري بايد ويروس ۱۴۵s باشد. به هر حال نقش ويروس ۱۹۰s را در تشديد بيماري تا زماني كه نمونه مبتلا به هر دو ويروس جداسازي شود نمي توان بطور واضح تشخيص داد.

در كلوني B-2 مقدار زيادي ميسيليوم هوازي توليد شد كه فرو ريزي نكردند, هيفهاي پيراموني اين كلوني بسيار طولاني و دراز بوده است و داراي شاخه هاي كمي بوده است . سلولها داراي شكل و سايز يكسان و يكنواخت بوده و داراي محتويات سيتوپلاسم طبيعي هستند. اما در كلوني A-9 هيفها داراي شاخه هاي زيادي بوده و بيشتر سلولها حالت متورم دارند و سيتوپلاسم آنها بصورت دانه دانه و غير طبيعي مي باشد, بعضي از سلولها حل شده و محتويات سيتوپلاسم آنها را در حالي كه چسبيده به هيفها چسبيده اند مي توان مشاهده نمود. بخش ضخيم اين سلولها نشان دهنده حضور تعداد زيادي از اجتماع ذرات ويروس مانند (VLPs ) مي باشند.

در شكل بخش ضخيم سلولهاي قسمت رأس همانند سلولهايي كه در نوك هيفها قرار دارند نشان داده شده است كه سيتوپلاسم و ارگانهاي داخلي سلول فاسد شده است و تقريباً كل سلول با VLP هاي انباشته شده پر شده است. قسمت ضخيم سلول در هيفهاي سالم بصورت نرمال و طبيعي است و هيچ نشاني از تجمع VLP ها در آن مشاهده نمي شود.

 ميزان بيماريزايي نمونه هاي مبتلا به H. victoriae :
ليندربرگ ميزان بيماريزايي اين ويروس را در نمونه هاي سالم و بيمار دانه هاي يولاف از طريق دو روش تلقيح مورد آزمايش قرار داد. اين تزريق شامل پلاكهاي ميسيليوم بود كه در قسمت محور برگ قرار داده شده بود و يا هنگام دانه پاشي و بذر پاشي به خاك منطقه اضافه گرديد. نتيجه آن نشان داد كه نمونه هاي جداسازي شده بيمار داراي كاهش در ميزان سم و زهرآگيني خود شده اند و اين در حالي است كه در حدود ۹۳ تا ۱۰۰ درصد نمونه هاي سالم كه در برابر ميسيليوم نرمال قرار گرفتند از بين رفتند و تنها ۱۳ تا ۲۰ درصد از گياهاني كه در معرفي ميسيليوم بيمار قرار گرفته بودند از بين رفتند.

در روش درماني,كه در مايع تزريقي, مخلوطي از ميسيليوم سالم وبيمار قرار داشت و اين تزريق به خاكي كه در آن دانه هاي كاشته شده بودند وارد شد حدود ۵۰ درصد گياه ها باقي ماندند هنگاميكه دانه ها را ۳۰ روز بعد از وارد كردن اين ماده به خاك كاشتند درصد گياهاني كه مورد تزريق تركيب قرار گرفتند و زنده ماندند مساوي با آنهايي بودن كه تنها در معرض ميسيليوم بيمار قرار گرفته بودند. نتيجه آن بدين معني بود كه يك كنترل بيولوژيكي در مورد نمونه هاي سمي معمولي و نرمال در خاك ايجاد شده است.

 

ميزان بيماريزايي عامل H. victoriae بستگي به ميزان توليد توكسين victorian در ميزبان دارد و اين عمل توسط ژني در هسته كنترل مي شود. ميزان سم نمونه هاي مختلف قارچها را مي توان از طريق تعيين ميزان توكسين توليد شده در گياه ميزبان اندازه گيري كرد. با استفاده ازآزمون زيستي و جلوگيري از رشد ريشه , ليندربرگ اعلام كرد كه توليد توكسين توسط نمونه هاي سالم به ميزان ۲ تا ۱۰ باربيشتر از مقدار توليد شده در نمونه هاي بيمار بوده است. او رابطه آن را با ميزان رشد در بين دو نوع مختلف از نمونه هاي جداسازي شده نشان داد.

سندرلين , چندين نمونه سالم وبيمار كه مبتلا به ويروس مورد نظر بودند را براي تعيين ميزان توكسين مورد آزمايش قرار داد. نتيجه آن نشان داد كه وجود يا عدم وجود ويروس در گياه نسبت مستقيم با ميزان توليد توكسين ندارد و اين مسئله روشن مي سازد كه توليد توكسين در گياه تحت نظر ژن هسته صورت مي گيرد. با در نظر گرفتن اين حقيقت كه تمام نمونه هاي جداسازي شده بيمار, يك مقدار كمي ويكتورين توليد مي كنند مي توان نتيجه گيري كرد كه ابتلا به ويروس مي تواند به طور غير مستقيم بر ميزان توليد توكسين تأثير داشته باشد و بايد در نظر گرفت كه توليد توكسين نه تنها به علت ايجاد جهش در ژن هسته صورت نمي گيرد بلكه مي تواند به علت واكنشهاي نوكلئوپلاسمي در قارچهاي مبتلا به ويروس باشد.

اين فرضيه را مي توان از طريق روشهاي زير مورد تست و آزمايش قرار داد:
۱٫ زير نظر داشتن و كنترل ميزان توليد توكسين در نمونه HW-1 كه توسط يك يا هر دو ويروس مبتلا شده است.
۲٫ اين نظريه كه درمان و بهبود دو نمونه بيمار B-1 و A-9 باعث مي شود كه آنها دوباره توانايي خود را در توليد مقدار زيادي ويكتورين بدست بياورند.

 انتقال عامل H. victoriae :

گابريل و مرتاف, پروتوپلاسم را ازنمونه هاي فاقد ويروس جدا كردند و همراه با نمونه خالص سازي شده ويروس( دو ويروس۱۴۵s و ۱۹۰s ) در حضور پلي اتيلن گلوكل , عمل رقيق سازي پروتوپلاست در محيط توليد پروتوپلاسم را انجام دادند. كلوني هايي كه حاصل از پروتوپلاست دوباره توليد شده بودند به طور مجزا به PDA منتقل شدند و براي آزمايش وجود علائم بيماري مورد بررسي قرار گرفتند.

مدارك و نظريه اي كه نشان مي دهد كه بيماري به نمونه فاقد ويروس ,با استفاده از پروتوپلاست قارچها و توليد ويروس هاي خالص سازي شده منتقل شده است بر اساس شرايط زير است:
۱٫ با بررسي و آزمايش كلونيهاي غيرطبيعي و ناقص مي توان مشاهده كرد كه برخي از خواص عامل H. victoriae در بين كلونيهاي مشتق شده از كلونيهايي كه بر روي آنها ويروس اعمال شده است وجود دارد.
۲٫ در قسمت ضخيم هيفها در كلونيهايي كه اخيراً مبتلا به بيماري شده بودند وجود بافتهايي انباشته شده از VLP كاملاً آشكار و قابل مشاهده بود .

۳٫ ذرات ويروس در تعداد كم و سايزهاي هم اندازه براي ويروسهايي كه در مايع تزريقي وجود داشتند , در ميسيليوم نيز رديابي شد كه اين رديابي با استفاده از ميكروسكوپ الكتروني در كلونيهاي تازه بيمار شده صورت گرفت و درآن از آنتي سرم مخلوط از ويروسهاي ۱۴۵s و ۱۹۰s, استفاده شد.

بنابراين, بيماري از طريق پروتوپلاست قارچ ها به نمونه سالم فاقد ويروس منتقل شده است و آماده سازي ويروس هاي خالص سازي شده, بر اساس وجود كلوني هاي غير طبيعي و داراي رشد ناقص در ميان نمونه هايي كه ويروس به آنها اعمال شده است مي باشد.

ويروس در قارچ Saccharomyces cerevisiae :
ويروس قارچ Saccharomyces cerevisiae بطور اختصاصي ويروس سيتوپلاسمي مي باشد كه محتوي dsRNA با قطر حدود nm30 تا ۴۰ و چند قسمتي

مي باشند.اين ويروس از خانواده Totiviridae مي باشد و در داخل كپسيد آن علاوه بر ژنوم خود، dsRNA ماهواره اي (وابسته) نيز يافت شده است كه براي اين ماهواره نقش يك ويروس كمكي را دارد. برخي نمونه ها داراي dsRNA ثانويه بوده, كه اكثر اين هيبريدها باعث توليد توكسين خارج سلولي شده , كه منجربه كشتن سلولهايي كه در محل زندگي ويروس M S.c- (M كد كننده توكسين است) و مطابق با آن نيستند, مي شوند. ويژگي و خواص كشنده توكسين در S.c تنها بر روي سلولهاي محتوي ژن مشابه اثر گذار است و بر روي استرينهاي ديگر اثري ندارد.

 

توكسين پروتئيني كوچك است كه با فعاليتهاي شناسايي وعمل كاتالتيك خود, به عنوان يك مولكول بيولوژيكي مهم براي مطالعه در مورد رابطه آن با ساختارهاي خاص كاربرد دارد. همچنين مي توان از فعاليتهاي تركيبي آن بعنوان مدل براي شناسايي مولكولها استفاده كرد. به علاوه, ساختار تركيبي و اندازه آن, امكان استفاده از اين مولكول را براي شناخت رابطه موجود بين اندازه و محدوديتي كه پروتئين ها در شناسايي سلول گيرنده دارند توضيح داد وساختار زير لايه سلول گيرنده را نيز
شناسايي كرد.

رابطه بي خطر dsRNA قارچ ويروس با ميزبان خود بطور متعاقب باعث بوجود آمدن سئوال در مورد نقش بيولوژيكي ويروس مربوطه مي شود اما نهايتاً مي توان گفت كه ويروس مخمر شامل يك سيستم مدل ايده آل براي مطالعه رابطه بين ميزبان سلول يوكاريوت و ويروس ساكن در آن است.
بعضي از موارد استفاده از مايكو ويروسها در تحقيقاتي كه انجام شده :
۱) كنترل بيولوژيك با ايجاد نژادهاي كم تهاجم (Hypovirulent )

۲) فعاليتهاي بيولوژيكي ضد ويروسي و ضد توموري
۳) Adjuvant properties
4) Immunosuppression ( توقف ايمني سازي )
۵) Cytotoxicity ( مسموميت سلولي )
۶) براي بررسي خصوصيات dsRNA در آزمايشگاه.

 

ـ كنترل بيولوژيك با ايجاد نژادهاي كم تهاجم ( Hypovirulent ) :
غالب قارچها, ويروسهاي مخصوص به خود دارند كه تحت تأثير آنها ايجاد نژادهاي كم تهاجم و غير بيماريزا مي كنند ؛ از جمله موارد مهم :
 Endothia (Cryphonecteria ) parasitica عامل بيماري سوختگي شاه بلوط Chesnut blight ) )
 Ceratocystis ( ophiostom ) ulmi عامل بيماري مرگ هلندي نارون ) Dutch elm disease )
 Gaeumannomyces graminis عامل بيماري ( Take – all)

 Rhizoctonia solani
ـ براي توضيح كنترل بيماري سوختگي شاه بلوط ابتدا قابل ذكر است كه بلايت شاه بلوط ناشي از قارچ Cryphonecteria parasitica با نام قديمي Endothia parasitica در حال حاضر در سراسر امريكاي شمالي , اروپا و آسيا وجود دارد. قارچ عامل بيماري از طريق زخمها وارد پوست ساقه شده و سپس به ناحيه پوست داخلي و كامبيوم مي رسد. پيكنيدهاي قارچ عامل بيماري كنيديهاي بسيار ريزي ايجاد

مي كنند كه بصورت فيتيله هاي نارنجي بلند و پيچداري در هواي مرطوب به بيرون تراوش شده و بوسيله پرندگان, حشرات و بارانهاي تند انتشار مي يابند. پريتسيومهاي قارچ, آسكوسپورهايي توليد مي كنند كه با فشار به هوا پرتاب شده و ممكن است بوسيله باد در مسافتهاي طولاني منتشر شوند. تاكنون مبارزه عملي و مناسبي كه بتوان آنرا در سطح وسيع بكار گرفت وجود نداشته است , اما با اين همه استفاده از قارچ كشهاي سيستميك در سطح محدود كارساز بوده است . كشف نژادهايي با خاصيت بيماريزايي كم ( Hypovirulence ) در بين درختهاي شاه بلوط آلوده در كشور ايتاليا , موجب شده تا محققين , با انتقال اين خاصيت به نژادهاي وحشي پاتوژن , از شدت بيماري بكاهند. شواهد نشان مي دهدكه اين خاصيت انتقال پذير(Transmissible ) توسط يك نوع ويروس قارچ زي ( Mycovirus ) يا حداقل بوسيله يك dsRNA با منشاء ويروسي ايجاد مي شود, اما تا به حال جز در يك استرين هيچ ذره شبه

ويروسي برخلاف شكل بيست وجهي Icosahedral ) ) مايكوويروسها , بصورتهاي Club – shaped (گرزي شكل ) و Pleomorphic ( چند شكلي ) مي باشد.
براي انتقال خاصيت هيپوويرولانسي از روش تماس هيفي يا آناستموز در محيط كشت استفاده مي شود و در اثر انتقال dsRNA به نژادهاي بيماريزا شدت بيماري كاهش مي يابد. هم اكنون در سطح محدود با آغشته كردن قارچهاي هيپوويرولانس به محلهاي آلوده شاه بلوط, اين بيماري بطور قابل قبولي كنترل مي شود.

نكته قابل توجه اين است كه مايكوويروسها سبب آلودگيهاي پنهان در قارچهاي ميزبان خود مي شوند و تعداد كمي از آنها رفتارهاي زيستي ميزبانشان را تغيير مي دهند , بنابراين ويروس موجود در قارچ عامل بيماري بلايت شاه بلوط يك ويروس غيرعادي است .