كنه

مقدمه

كنه ها گروهي از بند پايان هستند كه انتشار جغرافيايي وسيعي در كره زمين دارند ( NN.Johnsson.,1979) اين موجودات مي توانند با كاهش متابوليسم خود حتي تا ۱۰ سال زنده بمانند ، يا اينكه در ظرف چندين هفته ده برابر وزن خود خونخواري نمايند ، گونه هاي مختلف كنه در دامها از طريق خونخواري سبب كم خوني ، لاغر ي، فلجي و انتقال بيماريهاي خطرناك مي شوند .
امروزه مشخص گرديده است افزايش توليدات دامي بخصوص در كشورهاي در حال توسعه بدون مبارزه و كنترل كنه ها امكان پذير نيست. ( NN.Johnsson.,1979)

به همين دليل هر ساله سموم زيادي با تركيبات مختلف تحت عنوان كنه كشها توسط شركتهاي بزرگ دارويي توليد و به بازار عرضه مي شود ، اگر چه در حال حاضر كاربردي ترين راه مبارزه با كنه استفاده از كنه كشها است ولي با توجه به بروز پديده مقاومت بر عليه سموم كه در بعضي از گونه هاي دامي و خطراتي كه مصرف سموم براي محيط زيست و انسان دارد امروزه كفايت اين روش

مبارزه به عنوان تنها راه كنترل كنه ها مورد ترديد جدي قرار گرفته و راه هاي ديگري براي جانشيني آن پيشنهاد شده است .يكي از بهترين اين راهها تهيه واكسن مناسب بر عليه گونه هاي كنه اي دامي است . محققين استراليا و كوبا پس از سالها تحقيق موفــق به تهيه واكسن موثر تجاري بر عليه كنه بوافيلوس ميكروپلوس به نام TICK GARD در استراليا و GAGAC در كوبا ، با استفاده از آنتي ژن نو تركيب Bm86 از كنه بوافيلوس ميكروپلوس شدند.

( Willadsen et al .,1986 . Rodriquez et al., 1994)
اين واكسن با ايجاد ايمني در گاوها بر عليه كنه زدگي سبب كاهش جمعيت و كنترل كنه مذكور و افزايش توليدات دامي و كاهش مصرف سموم در اين كشورها شده است . (Willadsen et al .,1986 )
در كشورهاي خاور ميانه از جمله ايران و شبه قاره هند ، كنه هيالوما آنا توليكوم آنا توليكوم در مقايسه با ساير كنه ها واجد انتشار جغرافيائي بالا بوده و بعلت انتقال تيلريوز گاوي و گوسفندي و تب كريمه كنگو در انسان از اهميت بسيار زيادي بر خوردار است. ( Service.M.W.2001 )
با توجه به اين كه در ايران كنه مشكل زاي عمده از جنس هيالوما مي باشد ( انتخابي ۱۳۶۶ ،

بهگام ۱۳۶۹ ، عبدي گودرزي۱۳۷۹ ) شروع تحقيقات در اين زمينه ضروري مي باشدتا با پيگيري مناسب و تحقيقات منسجم بتوان واكسني موثر بر عليه اين كنه تهيه نمود .
در اين تحقيق سعي شده است بخشي از طرح جدا سازي و شناسايي ژن مشابه آنتي ژنهاي Bm86 از كنه هيالوما آنا توليكوم آنا توليكوم ‎‎‎كه در موسسه رازي درحال اجرا است انجام شود ، در اين مطالعه سعي شده است كه ابتدا با استخراج NA R و سپس تهيه cDNA و انجام PCR با آغازگرهاي اختصاصي ژن مذكور ، بخشهايي ازيك ژن مشابه Bm86 تكثير شده و سپس تعيين توالي شوند .

استخراج DNA
2-1مواد لازم
۲-۱-۱: نمونه
۲-۱-۱-۱: انتخاب نمونه: نمونه ها شامل تخم ، لارو ، كنه بالغ خونخورده و كنه نر بودند ، اين نمونه ها از بخش تك ياخته شناسي – آزمايشگاه تحقيقات بند پايان موسسه رازي تهيه شده بودند ، نمونه ها مربوط به سه منطقه بوشهر ، كردان كرج و بوئين زهرا بودند.

نمونه هاي كنه بالغ خونخورده بعد از جمع آوري از صحرا به منظور تخم گذاري در آزمايشگاه در انكوباتور ۲۶ درجه سانتيگراد و رطوبت ۶۰ تا ۷۰ درصد قرار داده شدند ، بعد از تخم گذاري ، مقداري از نمونه هاي تخم به منظور تهيه لارو در انكوباتور قرار داده شدند و ساير نمونه هاي تخم كنه در دماي ۵ درجه سانتيگراد به منظور تحقيقات بعدي نگهداري شدند .
۲-۲ روش استخراج :
استخراج DNA ژنومي در اين تحقيق با دو روش انجام گرديد :
الف) استخراج DNA به روش فنل – كلروفرم به همراه پروتئيناز K
ب ) استخراج DNA به روش جذب برروي فيبرهاي شيشه ( كيت)
۲-۲-۱: مواد لازم براي استخراج DNA به روش فنل –كلروفرم به همراه پروتئيناز K (d oliveria et al .,1997)

۱- ازت مايع ، ازت مايع جهت انجماد و پودر كردن نمونه (تخم، كنه بالغ و لارو)بكارگرفته شد.
۲- محلول شماره ۱ : اين محلول جهت ليز و آزادسازيDNA از سلول هاي استفاده ميشود،كه حاوي تركيبات زير ميباشد:
Tris-HCl 50mM
SDS 1%
NaCl 100mM
EDTA 50mM

pH اين محلول درنهايت بايد ۸ باشد ، اين محلول در تيوبهاي كوچك تقسيم شده و در فريزر نگهداري مي شود .
۳- محلول پروتئيناز K با غلظت ۲۰mg /ml
4- محلول شماره ۲: محلول فنل – كلروفرم – ايزو آميل الكل به نسبت ( ۱: ۲۴:۲۵) مي باشد .
۵- اتانول مطلق ۹۶ درجه
۶- اتانول ۷۵ درجه

 

۷- TE بافر كه حاوي تركيبات زير مي باشد :
۱۰mM Tris – HCl ( pH:8)
1 mM EDTA (pH:8)
2-2-1-1: طرز تهيه محلول فنل – كلروفرم – ايزوآميل الكل :
براي استفاده از فنل در استخراج DNA ، ابتدا بايد pH آن را در بيش از ۸/۷ متعادل كرد ، زيرا DNA در pH اسيدي تمايل به ورود به فاز فنلي رادارد ، در كارهاي مولكولي از فنل با درجه خلوص بالا استفاده مي شود كه بصورت تجاري وجود دارد . رنگ فنل درهنگام استفاده شفاف و بي رنگ باشد .
ابتدا فنل را در ۶۸ درجه ذوب كرده و ميزان ۱/۰ درصد آن هيدروكسي كينولين
(Hydroxy quinoline) اضافه مي گردد . اين ماده يك آنتي اكسيدان بوده و تا حدودي مانع فعاليت DNase شده و همچنين جاذب يونهاي فلزي است . علاوه بر اين با ايجاد رنگ در فنل ،هنگام استخراجDNA براحتي فاز ارگانيك را قابل تشخيص ميكند،بعد از ذوب فنل با اندازه گيري حجم

مساوي محلول ۵/۰مولار Tris با pH:8 اضافه ميشود، اين مرحله تا وقتي كه pH فنل به حد دلخواه نرسيده باشد ، ادامه مييابد.پس از تنظيم pH فنل به ميزان ۱/۰حجم آن از Tris با pH:8 روي آن نگه داشته و به مقدار ۲/۰ درصد به فاز آبي ، ۲- مركاپتواتانول اضافه مي شود ، در نهايت به محلول فنل به نسبت ۲۵ ( فنل) ۲۴ (كلروفرم) ۱ (ايزوآميل الكل) اضافه مي گردد و در بطري ريخته مي شود ، اين محلول در يخچال در دماي ۵ درجه سانتيگراد به مدت يك ماه پايدار است .( Sambrook,2001)
2-2-1-2 : مراحل استخراج DNA با روش فنل – كلروفرم :

ليز,و پودر نمونه كنه , شامل كنه بالغ خون خورده (ماده ) ،كنه نر يا تخم و لارو آن باشد .
در اين مرحله تيوب ۵/۱ سي سي حاوي نمونه را داخل ظرفي كه حاوي ازت مايع است ، گذاشته مي شود . ازت مايع باعث انجماد نمونه شده و در نتيجه براحتي مي توان با يك ميله شيشه اي يا پلاستيكي نمونه را در حالي كه در داخل ازت مايع قرار دارد پودر و هموژنيزه نمود .
۲- محلول شماره يك (Lysate) به ميزان ۴۰۰ ميكروليتر به نمونه ليز شده كه از قبل در داخل ميكروتيوب ۵/۱ سي سي آماده شده است اضافه شد .
۳- محلول شماره ۲ (پروتئيناز K) به ميزان ۲۰ ميكروليتر اضافه شد .

۴- در ۳۷ درجه سانتيگراد به مدت ۲ ساعت قرار داده شد .
۵- ۴۰۰ ميكروليتر محلول شماره ۳ ( فنل ) اضافه شد ، دراين مرحله ميكروتيوب به آرامي چند بار سرو ته شد تا دو محلول كاملا مخلوط شوند. سريع تكان دادن سبب قطعه قطعه شدن ژنوم مي شود در طي اين مرحله ۲ فاز تشكيل مي شود ، كه جهت بهتر تشكيل شدن ۲ فاز سانتريفوژ شد .

۶- به مدت ۱۰ دقيقه در ۱۳۰۰۰ دور سانتريفوژ شد .
۷ -بعد از سانتريفوژ ، فاز آبي را كه حاوي DNA است تا حد ممكن جدا شده و به يك ميكروتيوب جديد منتقل شد، در اين مرحله دقت شد كه فاز پروتئيني برداشت نگردد .
۸ – ۱/۰ حجم نمونه از استات سديم ۳ مول به محلول اضافه شد .
۹ – به ميزان ۲ برابر حجم محلول جدا شده به آن الكل مطلق اضافه شد .
۱۰ – محلول به مدت ۲۰ دقيقه در ۲۰- درجه سانتيگراد قرار داده شد .

۱۱ – محلول بمدت ۱۰ دقيقه در ۱۳۰۰۰ دور سانتريفوژ گرديد .
۱۲ – محلول رويي كاملا خالي گرديده ، به آن محلول اتانل ۷۵ درصد هم حجم قبلي اضافه شد و مجدداً به مدت ۱۰ دقيقه در ۱۳۰۰۰دور سانتريفوژ گرديد.
۱۳ – اتانل كاملا ً خارج شده و اجازه داده شد تا تيوب كاملاً خشك شود .
۱۴ – DNA بدست آمده به كمك ۱۰۰ ميكرو ليتر آب مقطر استريل يا بافر TE حل گرديد ، DNA جهت مرحله بعدي كار آماده شد .

نكته : اضافه كردن استات سديم باعث يونيزه شدن DNA ميكروتيوب شده و موجب مي گردد تمايل DNA جهت حل شدن در محيط غير آبي كاهش يابد . با اضافه كرئن الكل با درصد بالا آب موجود درنمونه كاهش مي يابد و DNA به شكل كدورت غير محلول ظاهر مي شود . Sambrook,2001))
2-2-1-3: اندازه گيري غلظت DNA :
از آنجايي كه مولكولهاي DNA در طول موج ۲۶۰ نانومتر از جذب بالايي برخوردار است ، لذا با استفاه از اين ويژگي غلظت DNA موجود اندازه گيري مي شود و جذب رقِتي از محلول DNA در طول موج ۲۶۰ نانومتر بدست آمد ، غلظت آن توسط فرمول زير اندازه گيري مي شود . Sambrook,2001))
(50μg/ml) × (ضريب رقت )×( OD260)=غلظت DNA (ميكروگرم بر ميلي ليتر)

با استفاده از اين روش مي توان به كيفيت محلول DNA پي برد به طوريكه اگر جذب همان رقت از محلول DNA در طول موج ۲۸۰ نانومتر خوانده شود ، مي توان با داشتن تناسب OD260/280 ، خلوص DNA مورد نياز را تعيين كرد پس از آنكه غلظت محلول DNA توسط دستگاه اسپكتروفتومتري تعيين شد ، آن را مي توان با استفاده از ژل آگارز الكتروفورزيس تخمين زد ، و محاسيات حاصله را تاييد نمود ،
۲-۲-۲: استخراج DNA با روش جذب بر روي فيبر شيشه (كيت ) :
كيت مورد نظر جهت استخراج DNA از شركت Roche تهيه شد كه مراحل استخراج DNA با آن مطابق جدول شماره ۲-۳ انجام گرديد .

۲-۲-۳: الكتروفورز ژل آگارز:
۲-۲-۳-۱: مواد لازم براي الكتروفور ژل آگارز
الف: آگارز
بDNA Ladder :
ج : بافر نمونه گذاري (Loading buffer) از شركت ( Roche)
د : بافر TBE 5X

۲-۲-۳-۲: روش كار : مولكولهاي DNA به علت دارابودن بار منفي در ميدان الكتريكي به سمت قطب مثبت ( آند ) مهاجرت مي كنند كه با درنظر گرفتن اين ويژگي با استفاده از ژل آگارز ، DNA را مورد بررسي قرار مي دهند و ژل آگارز در بافري به نام TBE انجام مي گيرد ، اين بافر نيروي يوني را براي هدايت الكتريكي فراهم مي آورد ، كه مواد تشكيل دهنده اين بافر عبارتند از :
۵X solution for 1000ml

Boric Acid 27.5gram

EDTA(0.5M- pH:8 ) 20ml

Tris Base 54gram

 

پس از توزين مواد ، حجم را با آب مقطر به ۱۰۰۰ميلي ليتر رسانده و اجازه داده شد تا كاملا ً‌در آب حل شود .
بافر TBE را عموماً به صورت ۵x يا ۱۰x تهيه مي كنند Sambrook,2001)) كه براي الكترفورز از غلظت هاي ۱X آن استفاده شد ، لازم به ذكر است غلظت و نوع بافري كه براي ژل آگارز استفاده مي شود براي بافرالكتروفورز نيز بايد مشابه شد ، براي ريختن نمونه DNA به داخل چاهك از يك بافر Gel–Loading استفاده شد زيرا در غير اينصورت محلول DNA در بافر الكتروفورز پخش شده و به داخل چاهك ريخته نمي شد ، ۲ نوع بافر نمونه براي رها سازي DNA در داخل چاهك استفاده شد ،
هر دو بافر با غلظت ۶X ساخته شد ، بافر اول تك رنگي و شامل مواد زير بود
۱٫Bromophenol blue 0.25( w/v)
2. sucrose in H2O 40(w/v)

اين بافر سه هدف را دنبال مي كند :
الف ) چگالي نمونه را افزايش داده يعني آن را سنگين تر مي كند .
ب ) انتقال كامل نمونه به داخل چاهك ها مطمئن تر صورت مي گيرد .
ج ) به نمونه بي رنگ ، رنگ مي بخشد ، از اين طريق يك نمونه رنگي قابل مشاهده انتقال داده مي شود .
۲- بافر دوم يك بافر دو رنگي است و از شركت Fermentase تهيه شده است ، اين بافر از مواد زير تشكيل گرديده است :

۱٫Bromophenol blue 0.9 %
2. Xylen cyanol FF 0.9 %
3.Glycerol 60%
4. EDTA 60mM

۲-۳-۶: انجام فرايند PCR : با توجه به غلظت هاي استاندارد شده در مورد DNA الگو ، (dNTP) ، آغازگر ها و Taq DNA Polymerase ، واكنش زنجيري پليمراز با دستگاه Eppendorf Gradiant انجام شد ، بهينه سازي شرايط PCR با انجام تغييرات در غلظت هاي DNA الگو ، تغيير دادن دماي Annealing با انجام برنامه دمايي گراديانت و همچنين غلظت آغازگر ها و تعداد چرخه هاي واكنش و زمان Extention در واكنش PCR صورت گرفت .
۲-۳-۷: طراحي آغازگر ها : طراحي آغازگر ها به من

ظورنهيه cDNAو تعيين توالي بخشهائي از ژن مشابه Bm86 در كنه هيالوما آناتوليكم آ ناتوليكم ايراني در ابتدا بوسيله برنامه كامپيوتري
DNA MAN و با توجه به اطلاعات توالي مربوط به ژن مشابه Bm86 در كنه هيالوما آناتوليكم آناتوليكم از استرين لودياناي هندوستان و ژن Bm86 كنه بوافيلوس ميكروپلوس كه در بانك جهاني ژن وجود داشت صورت گرفت.
براي اين كار ۶جفت آغازگر تقريبا از ابتدا تا انتهاي ژن طراحي گرديد، بطوريكه اندازه قطعات حاصله از طراحي جفت آغازگرها با هم متفاوت بودند.
اين جفت آغازگرها شامل:
۱۵۵u19/515L19 – ۵۱۵u18/1046L20 – ۱۰۴۶u20/1324L20 –
۱۳۲۴u20/ 1915L18 – ۵RBm86/RBm86c-FBm86c/3RBm86
انجام واكنش PCR:
انجام واكنش PCR مربوط به ۶جفت آغازگر فوق كه هرجفت آغازگر (آغازگرForward) و (آغازگرReverse) بصورت جداگانه با استفاده از محلولهاي زير صورت گرفته است:
معرف هاي مورد استفاده در PCR عبارت بودند از :
۱٫۱۰۰mM Tris-HCl, 1.5mM MgCl2 , 500mM KCl , (pH 8.3)
2.primer(Forward) 5 M
3.primer(Reverse) 5 M
4. dNTP 2.5mM
5. Taq DNA Polymerase 1 unit / l

۶٫DNA Template 10 ng/ l
محلول PCR در حجم نهايي ۵۰ ميكرو ليتر در يك تيوب PCR به صورت زير آماده شد:
جدول شماره ۲-۳: محلولهاي لازم جهت انجام واكنش PCR
Buffers Final Concentration Volume(microlitre)
10X buffer 1x
5
dNTP (2.5 mM) 200 M
4
primer(Forward) 5 M
1 M
5
primer(Reverse) 5 M
1 M
5
DNA Template(10(ng/ l)
≈۰٫۶(ng/ l)
3
DDW ——- 17
Taq DNA Polymerase (1u)/ l
1u 1
Total valume 50

 

نكته : ۱) آغازگر Forward مي تواند آغازگر ها ي
۵RBm86-155u19-515u18-1046u20-1324u20
2) آغازگر Reverse مي تواند آغازگر ها ي
RBm86c-515L19-1046L20-1324L20-1915L18 باشد.
۲-۳-۹: برنامه ريزي PCR :
1- واسرشت شدن اوليه ۵ دقيقه در دماي ۹۴ درجه سانتيگراد
۲- واسرشت شدن (Denaturation) 1 دقيقه در دماي ۹۴ درجه سانتيگراد
۳- اتصال (Annealing) 1 دقيقه در دماي ۴۹ درجه سانتيگراد
۴- تكثير(Extention) 5/1 دقيقه در دماي ۷۲ درجه سانتيگراد
۵- تكثير نهايي (fainal Extention) 10 دقيقه در دماي ۷۲درجه سانتيگراد
مراحل ۲ و۳و ۴ به تعدا ۳۵ بار تكرار شود
بررسي محصول PCR :

روشي كه بررسي محصولات PCR را به طور كيفي يا كمي از نظر ، وجود يا عدم وجود و يا مقدار توليد محصول را با استفاده از آن مورد ارزيابي قرار مي دهد الكترو فورز محصول PCR در ژل آگارز است . غلظت هاي مختلفي از اين ژل جهت بررسي DNA مورد نظر ، استفاده مي شود كه اين غلظت ها معمولاً بين ۵/۰ تا ۵ درصد مي باشد.در اينجا از غلظت۱ تا ۵/۱ درصد استفاده گرديد.
۲-۵: بهينه سازي محصول PCR :

بازده و كيفيت PCR تحت تاثير فاكتورهاي مختلفي ، از جمله كيفيت DNA الگو ، نحوه طراحي آغازگر ها ، دماي ( Annealing) ، زمان (Extention) و غيره قرار ميگيرد. (Savio,1994.Sambrook,2001)
2-5-1: تعيين كيفيت و غلظت DNA الگو :
جهت انجام واكنش PCR از غلظت هاي ۰٫۶ تا ۲۰نانوگرم بر ميكروليتراز DNA الگو مورد بررسي قرار گرفت.
جدول ۲-۴ :غلظت هاي مورد بررسي در واكنش PCR

۰٫۲ ۰٫۴ ۰٫۶ ۱٫۰ ۱۴ ۲۰
غلظت هاي DNAمورد بررسي (بر حسب نانو گرم)

۱ ۲ ۳ ۵ ۷ ۱۰ ميزان حجم موردنياز (بر حسب ميكروليتر)

۲-۵-۲: تعيين غلظت آغازگر ها :
غلظت آغازگر ها ي مورد استفاده معمولاً۱ M در نظر گرفته مي شود ، آغازگر ها ي ساخته شده معمولاً همرا ه اطلاعاتي راجع به غلظت آنها ارائه مي شوند ، بهتر است بعد از حل نمودن ، آغازگر را به صورت محلول استوك در منفي ۲۰ درجه سانتيگراد نگهداري كرد . (Savio,1994)
1-2-5-3: تعين دماي حرارتي :

الف) مرحله اتصال ( Annealing) : مرحله اتصال معمولاً در محدوده ۵۰ تا ۷۰ درجه سانتيگراد مي باشد .
درجه حرارت اتصال در مورد هر ۶ جفت آغازگر از ۴۹ تا ۵۸ درجه سانتيگراد مورد بررسي قرار گرفت .
نكته : تغيير درجه حرارتها را با استفاده از خود دستگاه PCR ( دستگاه PCR مورد استفاده دستگاهي با قدرت اعمال گراديانت در جه حرارت مي باشد ) با دادن يك درجه اپتيمم و Gradient درجه حر ارتهاي مختلف ايجاد شد ،( Eisenstein,1990)
به طور مثال درG = 4ºc , T= 54ºc , دستگاه به صورت جدول (۲-۵ )، درجه حرارتهاي مختلف در رديف چاهكهاي خود براي هر ميكروتيوب PCR تنظيم نمود .

جدول ۲-۵: نمايش درجه حرارتهاي مختلف توسط دستگاه PCR : در

G = 4ºc, T= 54ºc
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 شماره تيوب
۵۰٫۱ ۵۰٫۲ ۵۰٫۵ ۵۱٫۱ ۵۲٫۱ ۵۳٫۱ ۵۴٫۳ ۵۵٫۴ ۵۶٫۴ ۵۷٫۲ ۵۷٫۷ ۵۷٫۹ درجه حرارت

ب) زمان تكثير (Extention) :
در مرحله (Extention) حرارت حدود ۷۲ درجه سانتيگراد مي باشد ، در اين مرحله در دماي بهينه حرارت آنزيم Taq DNA Polymerase سنتز زنجيره مكمل انجام مي گيرد .
زمان تكثير (Extention) نيز از ۶۰ ، ۹۰ تا ۱۵۰ ثانيه مورد بررسي قرار گرفت.
ج ) تعيين تعداد سيكل :

در اين تحقيق تعداد سيكل ۲۵ ، ۳۰ تا ۳۵ سيكل مورد بررسي قرار گرفت ، تعداد سيكلها ارتباط مستقيمي با حساسيت روش دارد .( Sambrook,2001)
2-6 : خالص سازي DNA به منظور رقيق سازي و ارسال جهت تعيين توالي :
توانايي تعيين توالي بازها در DNA از اصول بنيادي مهندسي ژنتيك مي باشد و آنچه ممكن است به عنوان اطلاعات ساختاري در انتهاي امر باشد را فراهم مي كند .
در اين تحقيق براي دستيابي به اطلاعات موجود در DNA ژنوميك Bm86 طي مراحل زير با استفاده از كيت High Pure PCR Product Purification Kit محصول PCR از ژل آگارز خالص سازي گرديد :
۱) گذاشتن محصول PCR روي ژل الكتروفورز ، به اين نحو كه مقدار ۴۰ ميكروليتر از محصول PCR با بافر نمونه به مقدار ۸ ميكروليتر در داخل چاهك هاي ژل گذاشته شده و بعد از اتمام الكتروفورز ، يعني وقتي كه بافر نمونه به انتهاي ژل رسيد جريان قطع شده و ژل بعد ار آن به مدت ۱۰ تا ۲۰ دقيقه در بافر اتيديوم برومايد رنگ آميزي گرديد .
۲) بعد از خاتمه رنگ آميزي ژل را به صفحه ترانس لوميناتور انتقال داده و بعد از اينكه با تابش اشعه uv باند ظاهر گرديد ، با استفاده از تيغ اسكالپل باند مورد نظر جدا شد .
نكته : تيغ اسكالپل بايد استريل بوده و طوري باند مورد نظر جدا گردد كه كمترين آلودگي از نظر ژل اضافه اطراف باند و غيره به همراه داشته باشد .
۳) به ازاي هر ۱۰۰ ميلي گرم ژل ، ۳۰۰ ميكروليتر بايندينگ بافر اضافه شد .
۴) به مدت ۱۰ دقيقه در دماي ۵۶ درجه سانتيگراد در داخل Hot plate قرار داده و هر ۲تا ۳ دقيقه يك بار ورتكس شد .
۵) به ازاي هر ۱۰۰ ميلي گرم ژل ، ۱۵۰ ميكروليتر ايزوپروپانل اضافه و سپس ورتكس شد.
۶) به ميزان ۷۰۰ ميكروليتر از محلول تيوب روي تيوب فيلتر قرار داده شد .
۷) به مدت ۲۵ تا ۶۰ ثانيه با سرعت بالا ( ۱۵۰۰۰ g) در دماي اتاق سانتريفوژ شد.

۸) اين عمل يكبار ديگر با بقيه محلول باقيمانده در تيوب ۵/۱ سي سي ، انجام شد.
۹) فيلتر تيوب به تيوب ديگر انتقال داده شد و ۵۰۰ ميكرو ليتر بافر شستشو به آن اضافه گرديد .
۱۰) به مدت ۱ دقيقه در سرعت بالا ( ۱۵۰۰۰g) سانتريفوژ شد .
۱۱) محلول ته نشين شده از تيوب خالي و ۲۰۰ ميكروليتر بافر شستشو به فيلترتيوب اضافه شد .
۱۲) به مدت ۱ دقيقه در سرعت بالا ( ۱۵۰۰۰g) سانتريفوژ شد .
۱۳) محلول ته نشين شده از تيوب خالي و فيلتر تيوب بر روي ميكروتيوب ۵/۱ سي سي قرار داده شد

۱۴) ۵۰ ميكروليتر از Elution buffer به فيلتر تيوب اضافه شد .
۱۵) به مدت ۱ دقيقه در سرعت بالا ( ۱۵۰۰۰g) سانتريفوژ شد .
بعد از انجام مرحله فوق ميكروتيوب حاوي DNA خالص سازي شده مي باشد ، كه اين DNA قابليت نگهداري شدن در ۲ تا ۸ درجه يا ۱۵ تا ۲۰ درجه سانتيگراد به منظور آزمايشات ديگر يا استفاده فوري دارد.
۲-۷: محاسبه مقدار DNA مورد نياز جهت تعيين توالي :
با توجه به غلظت DNA كه از طريق دستگاه اسپكتروفتومتري تعيين شد محاسبه گرديد:
در اين تحقيق از ۷ نمونه براي تعيين توالي در نظر گرفته شد كه در اينجا مقدار DNA مورد نياز ۲ نمونه از آن محاسبه گرديد .
الف) محاسبه مقدار DNA مورد نياز از نمونه تخم كنه استرين بوشهر كه با روش فنل-كلروفرم استخراج شده بود :

 

OD DNA 0.014 700 bp: طول قطعه
۲۸۰ ng /µl : مقدار DNA مورد نياز براي قطعه ۷۰۰ bp
مطابق اطلاعات فوق مقدار DNA مورد نياز به صورت زير محاسبه شد :
۵۰ * ۰٫۰۱۴ * ۲۶ = ۱۸٫۲ ng / l
هر يك ميكروليتر از نمونه حاوي ۲/۱۸ نانوگرم DNA مي باشد ، با توجه به اينكه ۲۸۰ نانوگرم DNA مورد نياز مي باشد ، بنابراين
l 280/18.2 = 15.38
ب) محاسبه مقدار DNA مورد نياز از نمونه تخم كنه استرين بوئين زهرا كه با روش فنل –كلروفرم استخراج شده بود :
OD DNA: 0.016 1 Kp : طول قطعه

۴۰ ۰ ng / µ l l :مقدار DNA مورد نياز براي تعيين توالي قطعه ۱ kb
مطابق اطلاعات فوق مقدار DNA مورد نياز به صورت زير محاسبه شد :
۵۰ * ۰٫۱۶ * ۲۶ = ۲۰٫۸ ng / l
400/20.8 = 19.23 l
ساير نمونه نيز به همين روال محاسبه شد و در انتها با توجه به درخواست شركت ، نمونه هاي ارسالي كاملاً خشك گرديدند .
۲-۸: آغازگر ها : آغازگر ها با غلظت ۱۰ پيكومول بر ميكروليتر تهيه گرديدند .
۲-۹: كلونينگ :
جهت انجام كلونينگ از قطعه حاصل ازجفت آغازگر ۱۵۵u19/ 515 L 19 كه كمتر از ۷۰۰bp طول دارد استفاده شد ، براي اين كار با استفاده از كيت T/Acloning محصول شركت Fermenase با عنوان
( Inst T/A) clone PCR product cloning kit) صورت گرفت . اين كيت كارآيي خوبي (effeciency) داشته و به طور اختصاصي براي كلونينگ وكتور (pTZ57R/T) طراحي شده است .اين كيت به طور مستقيم با استفاده از سيستم انتقال
Transformation Aid Bacterial Transformation System محصولات PCR را كلون مي نمايد DNA پليمرازها داراي فعاليت دي اكسي نوكلئوتيديل ترانسفراز (TdT) بوده و آدنين در انتهايَ۳ DNAاضافه مي گردد. .(Clark,1988) T/A cloningروشي اختصاصي براي كلونينگ قطعات

PCRتكثير شده باTaqپليمراز مي باشد . هنگامي كه يك قطعه PCR با dA- َ۳ over hangs دارد، به داخل وكتور متصل مي گردد .يعني ( ligate) شده ، يك مولكول حلقوي با ۲ شكاف ايجاد مي گردد اين مولكول حلقوي براي انتقال به سلولهاي E.coli به طور مستقيم با جذب (effeciency) بسيار بالا ترانسفورم مي شود .

مراحل انجام كار به ترتيب زير مي باشد :
۱ : Ligation
2 :Transformation
3 :Clone selection
2-9-1 : مواد لازم جهت انجام واكنش لايگيشن :
۱: plasmid vector
2: Template (PCR fragment)

۳ :۱۰X ligation buffer
4 :PEG 4000 solution
5 :deionized water up to
6 :T4 DNA ligase(5u)
2-9-2: مواد لازم جهت انجام واكنش ترانسفورماسيون:
۱) محيط كشت LB كه شامل :
باكتوتريپتون – عصاره مخمر – NaCl – آگار
۲) آمپي سيلين با غلظت ۵۰ ميكروگرم بر ميلي ليتر
۳) IPTG با غلظت ((۰٫۱M
4) X-gal با غلظت ۲۰ ميلي گر م بر ميلي ليتر
۵) باكتريα DH5 E.coli

۶) محيط C-Medium
7) بافرهاي T-solution(A,B)
2-3-9: مواد لازم جهت خالص سازي پلاسميد :
۱) محيط كشتbroth
2) خالص سازي پلاسميد با استفاده از كيت High pure plasmid purification kit

مواد لازم :

binding buffer
suspension buffer
lysis buffer
wash buffer(1)
wash buffer(2)
elution buffer
2-4-9:مرحله اتصال به پلاسميد(ligation) :
براي اينكه بيشترين جذب (effeciency) را درمرحله لايگيشن وجود داشته باشد، بايد در مرحله خالص سازي DNA از ژل بيشترين محصول PCR خالص سازي شده بدست آيد . از ديگر فاكتورهاي لازم براي جذب بالا رعايت نسبت PCR fragment به وكتور در واكنش كه به صورت جدول زير مي باشد است :
جدول شماره ۲-۶ : مقدار DNA مورد نياز جهت انجام واكنش لايگيشن
Quality of PCR fragment for ligation reaction in g(./54 pmole end)
Pmoles of ends Length of DNA fragment(bp)
0.018
0.054
0.09
0.18

۰٫۳۶
۰٫۵۴ ۳۰
۱۰
۶
۳
۱٫۵
۱ ۱۰۰
۳۰۰
۵۰۰
۱۰۰۰
۲۰۰۰
۳۰۰۰

۲-۹-۴-۱: محاسبه مقدار DNA مورد نياز جهت انجام واكنش لايگيشن با توجه به جدول فوق : ابتدا غلظت DNA PCR fragment) )با دستگاه اسپكتروفتومتري مشخص شد(تعيينOD) ، سپس با توجه به جدول فوق مقدار DNA مورد نياز محاسبه شد .
در اين تحقيق ، كلو نينگ روي فراگمنت ۷۰۰bp از جفت آغازگر (۱۵۵u19 / 515 L 19) صورت گرفت كه مقدار DNA مورد نياز به شرح زير محاسبه گرديد :
OD PCR fragment : 0.05

مقدار DNA مورد نياز براي قطعه ۷۰۰bp بر حسب ميكروگرم ، ۱۲۶/۰ ، بنا براين :
مقدارDNAموردنياز۰٫۰۵ ۵۰ ۲۶=۶۵ g / ml 0.126 / 0.065 = 2 l

۲-۹-۴-۹: تهيه مخلوط واكنش لايگيشن :
جدول شماره ۲-۷ : تهيه مخلوط واكنش لايگيشن جهت انتقال به باكتري

مخلوط واكنش لايگيشن در داخل تيوب ۲/. ميلي ليتري ريخته و به مدت يك شب در دماي ۲۲ درجه سانتيگراد قرار داده شد .
۲-۵-۹: ترانسفورماسيون با استفاده از سيستم انتقال به باكتري
Trransformation using the transformatiation Aid Bacterial transformation system)) :
2-9-5-1: ترانسفورماسيون: آماده نمودن مواد لازم جهت انجام واكنش ترانسفورماسيون :
۲-۹-۵-۱-۱:تهيه محيط كشت LB به ميزان ۱ ليتر:
براي اينكار ابتدا باكتو تريپتون را به ميزان ۱۰گرم،عصاره مخمر ۵گرم،NaCl10گرم،وزن نموده سپس ۱۰۰۰ميلي ليتر آب دوبار تقطير استريل به آن اضافه و با استفاده از NaOH،pH, آن به ۵/۷ رسانده شد.
۲)اگار به ميزان ۱۵ گرم به آن اضافه شد.
۲-۹-۵-۱-۲:تهيه استوك آمپي سيلين:با توجه به اينكه آمپي سيلين با غلظت۵۰ميكروگرم بر ميلي ليتر موردنيازبوده ،۰۵/.گرم ازآمپي سيلين وزن نموده و ۱سي سي آب مقطر استريل به آن اضافه و سپس كاملا ورتكس شد.استوك آمپي سيلين را ميتوان دردماي۲۰-درجه سانتيگراد به مدت طولاني نگهداري نمود.

۲-۹-۵-۱-۳:تهيه استوك IPTg با غلظت(۰٫۱M): براي اين كار۲/۱گرم ازIPTG وزن شد،وبه آن آب مقطر استريل اضافه تا به حجم۱ ميلي ليتر برسد،آنگاه اين محلول فيلتر گرديد،ودر دماي ۲۰-درجه سانتيگراد نگهداري شد.
۲-۹-۵-۱-۴:تهيه محلول X-gal : 20 ميلي گرم ازN-N-dimethyl formamide وزن شدو سپس ۲۰ميلي ليتر آب دو بار تقطير استريل به آن اضافه و بعد ازفيلتراسيون در دماي ۲۰-درجه سانتيگراد نگهداري شد.
۲-۹-۵-۱-۵:تهيه محلول LB حاوي آمپي سيلين: بعد ازاتوكلاو محيطLB ،اجازه داده شدكه دماي محيط به ۵۰درجه سانتيگراد برسدسپس ۱۰۰۰ميكرو ليتر آمپي سيلين به ازاي هر ۱ ليتر محيط LB ،به محيط اضافه گرديد.سپس محيطLB حاوي آمپي سيلين در داخل پليتهاي ۴۰ سي سي ريخته شد،بعد ازاينكه محيطLB حاوي آمپي سيلين بخوبي بسته شد ،ميتوان آن را در دماي ۵درجه سانتيگراد ذخيره نمود.
۲-۹-۵-۱-۶:كشت باكتري: استرين هاي مختلف باكتريEcoli مثل:
JM107, XL1-BLUE ,DH5α , SURE , NM522 به عنوان مستعد(competent)براي واكنش ترانسفورماسيون ميتواند مورد استفاده قرار گيرد،با توجه به اينكه پلاسميد به خودي خود قادر به ورود به درون باكتري نميباشد،بنابراين روشهاي متعددي جهت تسهيل ورود پلاسميد وجود دارد كه به دو گروه عمده شيميايي و فيزيكي تقسيم ميشوند.(Kaluz,1992)
يكي ازاسترينهايE.coli مثل DH5 در محيطLB كشت داده شد ،بعداز۲۴ساعت يكي ازكلني هاي تك را به داخل ميكروتيوب ۲سي سي كه حاوي محيط C –Medium (2سي سي محيط براي ۲ترانسفورم) بوده انتقال داده و به مدت ۲۴ساعت در انكوباتور شيكردار در دماي ۳۷درجه سانتيگراد قرار داده شد.
۲-۹-۵-۲: انجام مراحل ترانسفورماسيون:(Transformation of procedure) :
(aپليت هاي حاوي LB و آمپي سيلين حاويx-gal,IPTG ،در دماي۳۷درجه سانتيگراد به مدت ۲۰دقيقه در انكوباتور قرار داده شد.
(b1/0ازحجم محيطC-Medium حاوي باكتري(به مقدار ۲۰۰ ميكروليتر )به داخل تيوب ۵/۱ سي سي حاوي محيطC-Medium انتقال داده و به مدت ۲۰ دقيقه در انكوباتور شيكردار در دماي۳۷درجه سانتيگراد قرار داده شد.
(cتهيه بافر Transformation T-solution: بدين صورت كه، براي هر دو ترانسفورماسيون ،۲۵۰ ميكروليتر ازبافر T-solution(A) و ۲۵۰ ميكروليتر ازبافر T-solution(B) را به داخل ميكروتيوب ۵/۱ سي سي انتقال و بعد ازورتكس نمودن ، روي يخ قرار داده شد.
d) محيط كشت حاوي C-Medium به ميزان ۵/۱ سي سي با سرعت بالا ( g15000 ) به مدت ۱ دقيقه و در دماي ۴ درجه سانتيگراد سانتريفوژ شد .

e) محيط رويي خارج گرديد و آنگاه ۳۰۰ ميكروليتر بافر T-solution به رسوب اضافه و سپس به مدت ۵ دقيقه روي يخ قرار داده شد .
f) با سرعت بالا ( g15000 ) به مدت ۱ دقيقه و در دماي ۴ درجه سانتيگراد سانتريفوژ شد.
g) محلول رويي خارج و ۱۲۰ ميكروليتر از بافر T-solution به رسوب اضافه و سپس به مدت ۵ دقيقه روي يخ قرار داده شد.
h) 5/2 تا ۳ ميكروليتر از محلول لايگيشن را براي هر يك واكنش ترانسفورم در داخل ميكروتيوب ۲/۰ سي سي ريخته و به مدت ۲ دقيقه روي يخ قرار داده شد .
I ) سلولها را به محيط كشت LB حاوي آمپي سيلين و X-gal,IPTG كه قبلاً در ۳۷ درجه سانتيگراد قرار داده شده انتقال داده و جهت رشد باكتريها به مدت يك شب در دماي ۳۷ درجه سانتيگراد قرار داده شد .

در طي عمل ترانسفورماسيون ، پلاسميد به درون درصدي از سلولهاي باكتري وارد مي شوند ، از آنجا كه پلاسميدهاي مورد استفاده داراي ژن مقاومت به آنتي بيوتيك هستند ، باكتريهاي كه پلاسميد به درون آنها راه يافتند ، قادر هستند در محيط واجد آنتي بيوتيك رشد كنند ، لازمه اين كار اين است كه ژن مقاومت به آنتي بيوتيك بيان شده تا باكتري بتواند در حضور آنتي بيوتيك رشد نمايد . انكوباسيون باكتري در محيط فاقد آنتي بيوتيك اين امكان را فراهم مي كند تا باكتري هاي واجد پلاسميد ژن مقاومت به باكتري را بيان نمايد و با اتصال به محيط واجد آنتي بيوتيك در مرحله بعد

بتوانند در حضور آنتي بيوتيك رشد كنند بنابراين ، كلني هاي توليد شده روي پليت عمدتاً باكتري هايي هستند كه واجد پلاسميد حاوي DNA مورد نياز مي باشند . اين باكتري ها به رنگ سفيد بوده و از باكتري هاي فاقد پلاسميد كلون شده كه به رنگ آبي هستند كاملاً قابل تمايز هستند .(Sambrook,2001)

۲-۹-۶: استخراج پلاسميد :
پس از رشد باكتري هاي ترانسفورم شده جهت اطمينان از وجود پلاسميد مورد نظر در باكتري و همچنين استفاده بعدي از پلاسميد بايد پلاسميد از درون باكتري استخراج گردد ، براي اين كار يك كلني از سلولهاي واجد پلاسميد را به محيط LB حاوي آمپي سيلين (با غلظت ۵۰ ميكروگرم بر ميلي ليتر) جامد انتقال داده و به مدت يك شب در دماي ۳۷ درجه سانتيگراد در انكوباتور قرار داده شد.

بعد از رشد كلني ها ، يك كلني از آنتي بيوتيك به محيط كشت LB مايع ( broth) حاوي آمپي سيلين انتقال داده شد .سپس به مدت يك شب در دماي ۳۷ درجه سانتيگراد در انكوباتور شيكر دار قرار داده شد . بعد از ۲۴ ساعت باكتري هايي كه رشد كرده باشند محيط LB حاوي آمپي سيلين را تيره و كدر مي نمايند ، بنابراين اين باكتري ها براي استخراج پلاسميد و clone selection آماده هستند . (Birnbiom,H.C.1979)

۲-۹-۶-۱: استخراج پلاسميد به روش كيت ( High pure plasmid purification kit ):
روش كار :
۱) قبل ا ز استخراج پلاسميد ، بايندينگ بافر روي يخ قرار داده شد .
۲) ۴ ميلي ليتر سلولهاي باكتري در ۹۰۰۰ دور به مدتc30 ثانيه سانتريفوژ شد.
۳) محلول رويي دور ريخته شد و ۲۵۰ ميكروليتر از بافرsuspansion buffer + Rnase به رسوب اضافه شده و سپس كاملاً حل گرديد.

۴) Lysis buffer به ميزان ۲۵۰ ميكروليتر اضافه شده و به مدت ۵ دقيقه در دماي اتاق قرار داده شد .
نكته : در طول ۵ دقيقه چندين دفعه تيوب را به آرامي تكان داده تا بافرها كاملاً مخلوط گردند ، (نبايد ورتكس شود زيرا احتمال خرد شدن DNA ژنوميك وجود دارد )
۵) ۳۵۰ ميكروليتر بايندينگ بافر به آن اضافه شد .

۶) نمونه به مدت ۵ دقيقه روي يخ نگهداري شد .
نكته: نمونه در طول ۵ دقيقه ۳ تا ۶ بار به خوبي سر و ته شد
۷) به مدت ۱۰ دقيقه در ۱۳۰۰۰ دور سانتريفوژ شد.
۸) محلول رويي به يك فيلتر تيوب ( H igh pure filter tube) انتقال داده شد و به مدت ۳۰ تا ۶۰ ثانيه در ۱۳۰۰۰ دور سانتريفوژ شد.
۹) محلول رويي خالي گرديدو ۷۰۰ ميكروليتر بافر شستشو دهنده (w ash bufferII )به فيلتر تيوب اضافه شد .

نكته : بعضي از استرين هاي E.coli مثل DH5 α , XLBLUE فاقد فعاليت نوكلئازي هستند بنابر اين نيازي به w ash bufferI نمي باشد .
۱۰) محلول فوق خالي گرديد و سپس ۷۰۰ ميكروليتر w ash bufferII به فيلتر تيوب اضافه شد.
۱۱) سپس در ۱۳۰۰۰ دور به مدت ۶۰ ثانيه سانتريفوژ شد.

۱۲) فيلتر تيوب به تيوب ۵/۱ سي سي انتقال داده شد .
۱۳) Elution buffer به ميزان ۱۰۰ ميكروليتر به فيلتر تيوب اضافه وسپس در ۱۳۰۰۰ دور به مدت ۳۰ ثانيه سانتريفوژ شد .
– مقدار غلظت DNA با استفاده از دستگاه اسپكتوفتومتري تعيين گرديد .
– پلاسميد را مي توان به مدت طولاني در دماي ۲۰- درجه سانتيگراد نگهداري كرد .
۲-۹-۶-۲: الكتروفورز پلاسميد استخراج شده :
براي اطمينان از صحت عمل كلونينگ ۲ نمونه از پلاسميد بدون (Insert)(كنترل مثبت) و با Insert) ) ( پلاسميد حاوي DNA قطعه مورد نظر ) بر روي ژل الكتروفورز انتقال داده شد كه مراحل كار به ترتيب زير مي باشد :
۱) ژل آگارز ۸/۰ تا ۱ درصد تهيه گرديد .
۲) نمونه ها به ميزان ۱۰ ميكروليتر همراه با ۲ ميكروليتر از بافر نمونه به داخل چاهكهاي الكتروفورز انتقال داده شد .
۳) در داخل يكي از چاهكها نيز نمونه اندازه ( size marker ) ريخته شد .
۴) جريان الكتروفورزي با استفاده از دستگاه power supply برقرار شده ، شدت جريان مي تواند بين ۱-۸ v/cm متغيير باشد . بعد از خاتمه الكتروفورز ، يعني وقتي كه بافر نمونه به انتهاي ژل رسيد جريان قطع شده و ژل براي رنگ آميزي آماده است .

۵) به مدت ۱۰ تا ۲۰ دقيقه در داخل ظرف حاوي اتيديوم برومايد قرار د اده شد.
۶) بعد از رنگ آميزي ، ژل آگارز بر روي ترانس لاميناتور انتقال داده و با استفاده از نور uv مشاهده گرديد.