مقدمه

DNA کلروپلاســت (cpDNA) بــه شــدت محافظــت شــده مــیباشــد و داراي میــزان جهــش کمتــري از تـوالیهـاي DNA در ژنـوم هسـتهاي گیـاه اسـت .(۲)

بطـــوري کـــه در برخـــی گیاهـــان از جملـــه راش، گونــاگونی بدســت آمــده بــراي ســاختن فیلــوژنی درون گونــهاي و ایجــاد ارتبــاط ایــن فیلــوژنی بــا توزیـــع جغرافیـــایی هاپلوتایـــپهـــا کـــافی اســـت

۳)،۴،۱۶،۱۷،.(۱۸ بـــا توســـعه روشهـــاي مولکـــولی، امکــان بررســی گونــاگونی جغرافیــایی بــا اســتفاده از نشــــانگرهاي ملکــــولی و شــــناخت ســــاختارهاي فیلوجغرافیـــایی درون گونـــهاي بـــه وجـــود آمـــده اســت .(۸) فیلوجغرافیــایی درون گونــهاي کــه توســط Avise و همکــــاران در ۱۹۸۷بــــه عنــــوان مطالعــــه روابـط بـین فیلـوژنی آللهـا و توزیـع جغرافیـاییشـان تعریــف شــده در علــم تکامــل کاربردهــاي بســیاري پیــدا کــرده اســت .(۱۱) مطالعــات متعــددي در مــورد گونـــاگونی جغرافیـــایی در خـــانواده Fagaceae بـــا اســـتفاده از نشـــانگرهاي ملکـــولی cpDNA انجـــام شـــده اســـت ۲۲)،۱۱،۱۲،.(۲۵ در یـــک دیـــد کلـــی تشــریح ســاختار جغرافیــایی درختــان جنگلــی از ایــن نظــر مهــم اســت کــه بســیاري از ایــن گونــههــا داراي گســترة جغرافیــایی وســیعی بــوده و تــوان بــالایی براي واگرایـی جغرافیـایی دارنـد. بـه عـلاوه، شـناخت ســـاختار ژنتیکــــی آنهــــا روي مـــدیریت اصـــلاح درختــان و برنامــههــاي حفاظــت راش اثــر مــیگــذارد

.(۷)

از آنجــایی کــه تشــریح ســاختار جغرافیــایی درخــت راش بــراي ارائــه اســتراتژي هــاي حفاظــت ژنتیکــی جنگلهـــاي راش ضـــروري اســـت در ایـــن پـــژوهش سعی گردیـد برخـی یافتـه هـاي اولیـه از نحـوه تمـایز

ژنتیکی راش معرفی گردد.

مواد و روشها

جوانـــههـــاي خـــواب درختـــان راش از ۱۴ جمعیـــت طبیعــی راش موجــود در جنگلهــاي هیرکــانی ایــران واقــع در شــیب شــمالی رشــتهکــوه البــرز جمــعآوري شــد ۳) ارتفــاع از هــر ایســتگاه: گرگــان از اســتان گلسـتان، نکـا، سـنگده و خیـرود از اسـتان مازنـدران، و اســالم از اســتان گـیلان کـه باختصــار بـا ارتفــاع و نــام هــر ایســتگاه در جــدول شــماره ۱ نشــان داده شده است).

کل DNA ژنومی از جوانههاي خواب ۱۰۰) میلیگرم به عنوان ماده اولیه) ۶-۵ درخت در هر جمعیت با استفاده از کیت (Germany, Macherey Negel)

Nucleospin plant جداسازي گردید. دو قطعه ژنی

trnD-trnT و orf184-petA با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی کلروپلاستی(۹)DT و(۱۳)OA (جدول شماره (۲ و از طریق واکنش زنجیري پلی مراز((PCR

تکثیر شدند. محیط فرایند PCR با حجم نهایی ۲۰ l

شامل: mM 10 (pH 8/3) Tris- HCl ، ۵۰ KCL mM ، mM 1/5 MgCl2 ، ژلاتین (W/V ) % 0/001،

ʽM 250 از هر داکسینوکلئوزیدتري فسفات (dNTP)، ʽM 1 از هر پرایمر و ۱ واحد Taq DNA polymeras می باشد که پس از نگهداري محلول واکنش به مدت ۶۰ ثانیه در ۹۰ ° C، محلول واکنش طی۳ مرحله در معرض چرخههاي مختلف دمایی زیر قرار گرفتند: ۵ (۱) چرخه: ۹۵ ° C به مدت ۳۰ ثانیه،

۶۰ ° C به مدت ۳۰ ثانیه، ۷۲ ° C به مدت ۴ دقیقه. ۵:(۲) چرخه: ۹۵ ° C به مدت ۳۰ ثانیه، ۵۵ ° C به مدت

۳۰ ثانیه، ۷۲ ° C به مدت ۴ دقیقه. ۲۵ :(۳) چرخه: ° C

۹۵ به مدت ۳۰ ثانیه، ۵۰ ° C به مدت ۳۰ ثانیه، ۷۲ ° C

به مدت ۴ دقیقه. سپس فرآوردههاي تکثیر در ۷۲ ° C

به مدت ۱۰ دقیقه نگهداري شدند.

فـــرآوردههـــاي تکثیـــر DT و ۱۵ µL) OA حـــاوي (DNA 1 mg بــه ترتیــب بــا ۵ واحــد آنــزیم محــدود

١١٨

مجله زیست شناسی ایران جلد ۱۷ ، شماره ۲، تابستان ۱۳۸۳

کننـــده HaeIII و HinfI، در حجـــم نهـــایی ۲۰ µL

در ۳۷ ° C بــه مــدت ۴ ســاعت تیمــار شــد. محصــول نهــایی بوســیله الکتروفــورز روي ژل پلــیاکریــلآمیــد غیــر تقلیبــی تعیــین تــرادف (W/V) %8 تجزیــه شــد.

قطعــات پلــیمورفیــک براســاس کــاهش طــول قطعــه در ژل پلــــیاکریــــلآمیــــد نــــامگــــذاري شــــدند.

هاپلوتایـپهـا براسـاس ترکیـب هـاي مختلـف قطعـات پلــیمورفیــک شناســایی تعیــین شــد. گونــاگونی در دو قطعــه DT و OA مــورد بررســی بــه جهــشهــاي نقطـــهاي، یـــا حـــذف و اضـــافه بازهـــا نســـبت داده مــیشــود. ترکیــب ایــن متغیرهــا در هــر دو لوکــوس تعیـــین کننـــده یـــک هاپلوتایـــپ اســـت (صـــالحی شانجانی، .(۱۳۸۱

بـــرآورد عوامـــل تنـــوع ژنتیکـــی hs) و (ht و تمـــایز ژنتیکــی Gst) و (Nst در ژنــوم کلروپلاســـت بــا اســـــتفاده از روشهـــــاي Pons و ۱۶) Petit،(۱۷ و

نــرمافــزار HAPLODIV انجــام شــد. بــر خــلاف Gst

کــه فقــط براســاس فراوانــی هاپلوتایــپهــا محاســبه میشـود، Nst شـباهت ژنتیکـی بـین هاپلوتایـپهـا را نیز بررسی میکند.

نتایج و بحث

بــراي بررســی گونــاگونی ژنتیکــی جمعیــت هــاي راش ایـــران بـــا اســـتفاده از روش PCR-RFLP، دو قطعــه از cpDNA بــه نــامهــاي DT و OA تکثیــر و تجزیــه شــدند. انــدازه منــاطق DT و OA بــه ترتیــب از ۱۶۶۱ تـــا ۱۶۶۴ جفـــت بـــاز و از ۲۸۸۹ تـــا ۲۸۹۳

جفــت بــاز متغیــر بــود Vettori) و همکــاران، .(۲۰۰۲

بــراي شناســایی هاپلوتایپهــاي ایرانــی، نیمــرخ هضــم شـــده دو منطقـــه DT و OA بطـــور همزمـــان بـــا قطعــــات ناشــــی از هضــــم DNA شــــاهد یعنــــی هاپلوتایــپ شــناخته شــده از قبــل (توســط پرفســور IMGPF-CNR,Giannini، ایتالیـــا در اختیـــار قـــرار

گرفــت) مقایســه گردیــد (شــکل شــماره . (۱ در میــان افــراد هــر یــک از جمعیتهــاي مــورد مطالعــه، قطعــات محـــدود کننـــده منطقـــه DT هـــیچ پلـــیمورفیســـمی نشــان نـــداد. در حـــالی کـــه در میـــان افـــراد درون جمعیتهــاي مــورد مطالعــه منطقــه اســالم و جمعیــت نکــا- ۱۴۰۰، شــاهد وجــود پلــیمورفیســم در قطعــات محـــدود کننـــده منطقـــه OA بـــودیم. بـــا مقایســـه همزمــان نیمــرخهــاي هضــم شــده منــاطق DT و OA

با قطعـات هضـم شـده DNA شـاهد، هاپلوتایـپهـاي از قبــل شــناخته شــده، امکــان تعیــین متغیرهــاي DT
و OA جمعیتهــــاي راش ایــــران بدســــت آمــــد. در منطقــه DT بــه اســتثناء درختــان جمعیــت خیــرود-۶۰۰ که قطعه پلـیمـورفیکی بـه طـول ۴۹۸ جفـت بـاز داشــتند درختــان ســایر جمعیتهــاي مــورد مطالعــه داراي قطعــه پلــیمورفیــک مشــابه ۴۹۶ جفــت بــازي بودنــد. طــول قطعــه پلــیمورفیــک در منطقــهOAدر یکـــی از درختـــان جمعیـــت نکـــا- ۱۴۰۰ و نیمـــی از درختــان جمعیتهــاي منطقــه اســالم ۴۶۳ جفــت بــاز و در بــاقی درختــان جمعیتهــاي مــورد مطالعــه ۴۶۲

جفـت بـاز بــود (جـدول شــماره .(۳ بــه عبــارت دیگــر پــس از تجزیــه بــا آنــزیمهــاي محــدود کننــده، دو متغیــر در هــر یــک از منــاطق DT و OA یافــت شــد کـه بـا هـم بـه صـورت ۳ هاپلوتایـپ cpDNA ترکیـب شــــدند (هاپلوتایپهــــاي شــــماره ∗۲، ∗∗۳ و .(∗∗∗۱۴

فــراوانتــرین هاپلوتایــپ، هاپلوتایــپ شــماره ۲ بــا فراوانــی ۰/۷۹ اســت کــه در تمــام گســترش پــراکنش راش واقـــع در جنگـــلهـــاي هیرکـــانی غیـــر از یـــک

فراوانترین هاپلوتایپ در ﴰال اروپا

و ﴰال ایتالیا + ٢ ﲨعیت در بلغارستان (اطلاعات شفاهی دریافت شده از Giannini، ٢٠٠٢).

∗∗ فراوانترین هاپلوتایپ در ﴰال اروپا
و ﴰال ایتالیا + ٢ فرد یک ﲨعیت در

بلغارستان (اطلاعات شفاهی دریافت شده
از Gianini، ٢٠٠٢).

∗∗∗ یک ﲨعیت در ایران.

١١٩

مجله زیست شناسی ایران جلد ۱۷ ، شماره ۲، تابستان ۱۳۸۳

جمعیـــــت (خیـــــرود- (۶۰۰ وجـــــود دارد. یـــــک هاپلوتایـپ نسـبتاً نـادر نیـز (هاپلوتایـپ شـماره (۳ بـا فراوانـــی ۰/۱۰۲ در فـــرد یـــا افـــرادي از برخـــی جمعیــت هــاي غــرب جنگــلهــاي هیرکــانی (اســالم-۶۰۰، اســـالم- ۱۲۰۰ و اســـالم- (۱۹۰۰ یـــا در یـــک جمعیــت واقــع در مرکــز جنگــلهــاي هیرکــانی (نکــا-(۱۴۰۰ مشــــاهده گردیـــد. هاپلوتایــــپ شـــماره ۱۴

انحصـــار بـــه جمعیـــت خیـــرود- ۶۰۰ دارد (شـــکل شـــــماره .(۲ توزیـــــع هاپلوتایپهـــــاي PCR-RFLP

نشــان مــیدهــد کــه: (۱ فــراوان تــرین هاپلوتایــپ

(شـــماره (۲ بـــه اســـتثناء یـــک جمعیـــت در تمـــام جمعیــت هــا وجــود دارد، ۱۰ (۲ تــا از ۱۴ جمعیــت منومورفیـک هسـتند (بـا هاپلوتایـپ هـاي شـماره ۲ و .(۱۴ این مشـاهدات نشـان مـیدهـد کـه تنـوع ژنتیکـی راش شـــرقی در ایـــران داراي ســـاختار جغرافیـــایی مــیباشــد (شــکل شــماره .(۳ مطالعــات بســیاري، ســاختار جغرافیــایی را بــراي گونـــاگونی cpDNA

در ســــطح زیــــر گونــــهاي گــــزارش نمــــودهانــــد

۱۵)،۱۸،۱۱،۲۰،۲۴،۲۶،۱۴،۲۳،.(۳۶ بـــــــه عـــــــلاوه گونـــاگونی cpDNA درون گونـــهاي راش اروپـــایی شــامل ۳) Fagusylvatica،(۷ گــزارش شــده اســت.
نتیجـــه حاصـــل از اکثـــر ایـــن مطالعـــات پیشـــنهاد مــیکنــد کــه وقــایع تــاریخی کلیــدي (مثــل وقــایع یخبنــدان) ســاختار جغرافیــایی گونــاگونی cpDNA

را شکل دادهانـد. آنهـا توزیـع گسـترده یـک هاپلوتیـپ

cpDNA منفــــرد را در شــــمال اروپــــا و چنــــدین هاپلوتایــپ را در جنــوب اروپــا تشــخیص دادنــد. در پــژوهش حاضــر، هاپلوتایــپ شــماره ۲ بــه اســتثناء جمعیــت خیــرود-۶۰۰ در تمــام جمعیــت هــا توزیــع شــده اســت. هاپلوتایــپ شــماره ۳ کــه بیشــتر در منــاطق غربــی مشــاهده مــیشــود ایــن منــاطق را از مناطق باقیمانده جـدا نمـود. چنـین تـوزیعی مـیتوانـد ناشــی از اختلافــات محیطــی بــه ویــژه در میــزان

بارنـدگی، رطوبـت هـوا، نـوع هومـوس خـاك و سـنگ مـــادر از شـــرق بـــه غـــرب باشـــد ۵)،۱،۲،.(۳ علـــت دیگري کـه مـیتـوان بـراي الگـو توزیـع هاپلوتایپهـاي

cpDNA اســـتفاده نمـــود تاریخچـــه مهـــاجرت راش در طــــی توزیــــع تــــاریخی آن در دوران ســــوم از اســـالم (ناحیـــه بســـیار پلـــیمورفیـــک) بـــه شـــرق جنگلهاي هیرکانی است.