چکیده

زمینه و هدف: لیشمانیوز جلدي در ایران داراي کانون هاي متعددي است و طی دو دهه اخیر رو به فزونی بوده و کانونهاي جدیـدي را بـهوجود آورده است. تشخیص این بیماري معمولا به روش میکروسکوپی صورت می گیـرد امـا ایـن روش از حـساسیت لازم برخـوردار نیـست و استفاده از روش هاي دیگري مانند PCR مورد توجه قرار گرفته است. در مطالعه حاضر، کارآیی روش PCR در مقایسه با روش میکروسـکوپی و کشت in vitro براي تشخیص مستقیم لیشمانیوز جلدي و شناسایی گونه انگل مورد ارزیابی قرار گرفته است.

مواد و روش کار: در این مطالعه از تعداد۷۳بیمار مشکوك به لیشمانیوز جلدي از روستاهاي میرجاوه در فاصـله زمـانی زمـستان۱۳۸۴تـابهار ۱۳۸۵ نمونه برداري از زخم انجام شد و نمونه ها با سه روش میکروسکوپی، PCR و کشت در محیط NNN مورد آزمایش تشخیصی قـرار گرفتند. حساسیت و ویژگی روش ها بر اساس ماخذ Wassertheil-Smolle محاسبه گردید.
یافته ها: ۳۸/۴درصد از نمونه ها با روش میکروسکوپی،۵۵/۵درصد با روشPCRو۶۳/۱۵درصد با روش کشتNNNمثبت تـشخیصداده شدند. با روش PCR مستقیم گونه انگل در همه نمونه ها لیشمانیا ماژور (Leishmania major) تعیین شـد. حـساسیت و ویژگـی محاسـبه شده در مقایسه با روش کشت، براي روش میکروسکوپی بترتیب %۶۱ و %۱۰۰ و بـراي روش %۷۶PCR و %۷۳ بدسـت آمـد. حـساسیت هـر دو روش میکروسکوپی و PCR از روش کشت پائین تر بود اما حساسیت PCR در مقایسه با روش میکروسکوپی بالاتر بود.

نتیجه گیري: با توجه به حساسیت بالاتر روشPCRنسبت به روش میکروسکوپی و قابلیت آن در شناسایی گونه انگل لیشمانیا(همزمان بـاتـشخیص) و همچنـین حــساسیت چـشمگیر روش کــشت، پیـشنهاد مــی گـردد امکـان انجــام ایـن دو روش PCR) و کــشت) در کنـار آزمــایش میکروسکوپی حداقل در برخی مراکز تشخیصی فراهم گردد تا در مواردي که نیاز به تشخیص گونه لیشمانیا می باشد و هم در موارد مـشکوکی که لام میکروسکوپی منفی می شود مورد استفاده قرار گیرند. (مجله طبیب شرق، دوره نهم، شماره۳، پائیز۸۶، ص۱۸۱تا(۱۸۹
کلیدواژه ها: لیشمانیوز جلدي، تشخیص،PCR،In vitro

مقدمه

لیشمانیوز جلدي (سالک) یکی از بیماري هاي شایع پوسـتی است که در ۸۸ کـشور جهـان از جملـه ایـران آنـدمیک اسـت و حدود ۳۵۰ میلیون نفر در معرض ابتلا به بیماري هستند.((۱

براي تشخیص بیماري در آزمایشگاه هـاي تـشخیص طبـی و مـــراکـز تشخیصی خصوصی و دولتی معموًلا از روش مستقیم

آدرس نویسنده مسئول: زاهدان ، دانشکده پزشکی

(میکروسکوپی) استفاده میگردد. این روش اگـر چـه ارزان و بـه راحتی در دسترس می باشد و نیازي به مواد و تجهیزات پیـشرفته و حساس ندارد، اما بـراي تـشخیص عامـل بیمـاري در زخمهـاي جلــدي از حــساسیت کــافی برخــوردار نیــست. روش کــشت in vitro از حساسیت نسبتًا بالا و ویژگی مناسبی برخوردار است

۱۸۱ Email: afparma1 @yahoo.co.uk

ITS-I

اما این روش نیز محدودیتهاي خاص خـود را دارد از جملـه ایـن موارد مـی تـوان بـه عـدم امکـان دسترسـی در همـه جـا، نیـاز بـه انکوبــاتور ۲۵ درجــه و محــیط کــشت، احتمــال آلــودگی هــاي میکروبــی و قــارچی محــیط هــاي کــشت و طــولانی بــودن دوره کشت اشاره کرد. حساسیت روش مستقیم و کشت به گونه انگل و طول دوره زخم سالک بستگی دارد. در بعضی منابع حساسیت ترکیبی این دو روش را بین ۵۰ تا ۷۰درصد ذکر نموده اند((۲
تکنیک PCR در سالهاي اخیر هم براي تشخیص و هم براي تعیین گونه لیشمانیا استفاده شده است .(۳-۶) اعتقاد بـر ایـن اسـت که PCR براي تشخیص بیماري از حساسیت و ویژگـی بـالاتري نــسبت بــه روشــهاي میکروســکوپی و بعــضی روش هــاي دیگــر برخوردار اسـت. یکـی دیگـر از مزایـاي روش PCR بـالا بـودن سرعت انجام آن نسبت به روش کشت است که زودتر بـه نتیجـه می رسد، اگر چـه روش میکروسـکوپی سـریعتر از PCR انجـام می شود. Belli و همکـاران (۱۹۹۸) حـساسیت و ویژگـی ۱۰۰

درصـــد را بـــراي روشPCRنـــسبت بـــه روش میکروســـکوپیگـزارش نمودنـد .(۷) همچنـین Aviles و همکـاران (۱۹۹۹) بـه ترتیب حساسیت و ویژگی ۹۲درصد و ۱۰۰درصد را براي PCR

در مقابــل روش میکروســکوپی بــا حــساسیت ۴۲درصــد، روش هیــستولوژي بــا حــساسیت ۳۳درصــد و تــشخیص ســرولوژیک

(IgG) با حـساسیت ۲۰درصـد گـزارش نمودنـد .(۸) در بررسـی دیگري بر روي تعداد ۱۱۹ نمونه بیوپـسی از زخـم هـاي پوسـتی لیـشمانیوز آمریکـایی توسـط Rodrigues و همکـاران (۲۰۰۲)

نشان داده شد که حساسیت PCR بـراي تـشخیص تحـت جـنس Viania و تحت جنس Leishmania به ترتیـب ۹۵/۴درصـد و

۸۸/۲ درصد و ویژگی آن بـراي هـر دو زیـر جـنس۱۰۰ درصـد

بود(Gangneux.(9 و همکاران (۲۰۰۳) نیز حساسیت و ویژگی بــسیار بــالایی را بــا روش PCR نــسبت بــه روش هــاي تــشخیص مــستقیم و کــشت در تــشخیص لیــشمانیوز گــزارش نمودنــد. (۱۰)

نتایج بعضی مطالعات نیز کیفیت بـالاي روش PCR را بـا تردیـد مواجــه نمــوده اســت. بــراي مثــال در غربــالگري ســگهاي آلــوده

توســـط Reithinger و همکـــاران (۲۰۰۳)، PCR حـــساسیت کمتري نسبت به روش الایزا (ELISA) براي تـشخیص لیـشمانیا دونوانی داشت .(۱۱)

بخش هایی از DNA لیشمانیا به عنوان مارکرهاي تشخیصی و یــا تعیــین گونــه انگــل عامــل بیمــاري تــاکنون در کــشورهاي مختلف از جمله ایران مورد استفاده قرار گرفتـه اسـت. از جملـه:

DNA رایبــوزومی (۱۲)(SSU rRNA)، تــوالی هــاي تکــراري

(۱۲)(repetitive sequences)،DNA کینتوپلاسـتی (kDNA)
14)و۱۳و۹و(۳-۵ و .(۱۵) تغییـــــرات بـــــازي در منـــــاطقی از

سکانس هاي DNA کینتوپلاسـتی در بـین گونـه هـاي مختلـف انگل لیشمانیا شناسایی و از این تغییرات براي طراحی پرایمرهاي اختصاصی و وابسته به گونـه اسـتفاده شـده اسـت. ایـن پرایمرهـا می توانند ضمن تشخیص مستقیم لیـشمانیا از نمونـه بیمـار، گونـه انگل لیشمانیا را نیز هم زمان افتراق دهند. هدف از انجـام مطالعـه حاضر ارزشـیابی روش PCR مـستقیم بـا اسـتفاده از پرایمرهـاي فوق در مقایسه با روش هاي میکروسکوپی و کشت NNN براي تشخیص زخم هاي مشکوك به سالک و شناسایی مستقیم گونـه انگل عامل بیماري بود تا بر اساس نتـایج بدسـت آمـده بتـوان در خصوص جایگزینی روش PCR با روشهاي دیگر و یا به عنـوان روشی مکمل در باره آن قضاوت نمود.

روش کار

این مطالعه مقایسه اي توصیفی در منطقه میل ۷۲ میرجاوه در فاصله زمانی زمستان ۱۳۸۴ و بهار ۱۳۸۵ انجام شـد. حجـم نمونـه بر اساس اطلاعات موجود بـراي متغیرهـاي حـساسیت و ویژگـی روشهاي مستقیم و PCR از ۳۱ نفـر تـا ۷۸ نفـر بدسـت آمـد کـه بالاترین حجم نمونه در نظر گرفته شد، البته نمونه گیري از تعداد

۵ نفر از بیماران میـسر نـشد و نهایتـا از تعـداد ۷۳ نفـر از بیمـاران داراي زخمهاي مشکوك به سالک نمونه برداري شد. تمامی ۷۳

نفر بیمار از افراد سـاکن در روسـتاهاي منطقـه میـل ۷۲ میرجـاوه بودند که از روستاهاي مختلف و یا از عشایر بـصورت بیماریـابی شناسایی شدند و یا خـود بـه خانـه هـاي بهداشـتی و درمانگاههـا

۱۸۲

Wassertheil-Smolle

مراجعه کرده بودند. نمونه ها با خـراش دادن کنـاره هـاي متـورم زخم پس از ضـد عفـونی کـردن، تهیـه و در سـه بخـش، کـشت
NNN، PCR مستقیم و گسترش میکروسکوپی، مـورد اسـتفاده

قرار گرفتند.

کشتin vitro (در محیط :(NNNبخشی از نمونـه تهیـهشده از زخم مستقیمأ و در کنار شعله در فـاز مـایع محـیط NNN
وارد لوله می شد. لوله ها به انکوباتور ۲۵oC منتقل گردید و پس از آن بررســی میکروســکوپی محــیط هــاي کــشت هــر ۲-۳ روز یکبار با مشاهده یک قطره از محـیط مـایع کـشت بـا درشـتنمایی
×۴۰ انجام می گردید و به محض مشاهده اشکال پروماسـتیگوت لیشمانیا، ۲ تا ۳ قطره از مایع روئی محیط کشت به محیط کـشت جدید پاساژ داده می شد. جهت از بین بردن آلـودگی میکروبـی محیط کـشت جنتامایـسین بـه میـزان ۵۰ -۱۰۰g/ml اسـتفاده می شد.

آزمایش میکروسکوپی: از هر نمونه بیمـار دو لام مـستقیمتهیه و پس از فیکس کردن گسترش ها با متانول، به روش گیمسا رنگ آمیزي گردیده و بـا عدسـی روغنـی مـورد مـشاهده دقیـق میکروســـکوپی قـــرار مـــی گرفـــت. حـــدا قـــل ۱۰۰ میـــدان میکروسکوپی از هر گسترش از قسمت هاي مختلف مشاهده می گردید.

اســتخراج DNA و انجــام :PCRبخـــش دیگـــري ازنمونه ها به لولـه هـاي حـاوي محلـول بـافر PBS اسـتریل جهـت آزمایش PCR مستقیم منتقل مـی گردیـد و بـراي آمـاده سـازي نمونه به منظور اسـتخراج DNA، نمونـه هـا پـس از سـانتریفوژ و شستشو با بافر استریل رسـوب گیـري مـی شـد و تمـامی رسـوبها شماره گـذاري و تـا زمـان اسـتفاده در فریـزر -۲۰oC نگهـداري می گردید. براي استخراج DNA، کیت DNG-plus از شرکت ســیناژن تهــران تهیــه و مطــابق دســتورالعمل مــورد اســتفاده قــرار گرفت. DNA حاصل براي تشخیص و تعیین گونه انگل لیشمانیا مورد استفاده قرار می گرفت.

بــراي واکــنش PCR نیــز از کیــت شــرکت ســیناژن تهــران استفاده شد. براي آماده سازي مخلوط واکنش، به ازاي هر نمونه مقـدار ۲۰ʽl مخلـوط (PCR mix)PCR و ۱ واحـد (۰/۵ʽl)Taq پلــی مــراز و DNA5ʽl نمونــه مــورد نظــر داخــل یــک میکروتیوب ۰/۲ میلی لیتري ریخته و ۱ قطره روغن معدنی به هـر لوله افـزوده و در دسـتگاه PCR(ترموسـایکلر از نـوع بیـومتراي فرانسه) قرار داده می شد. براي اطمینـان از صـحت انجـام PCR،

در هر نوبت PCR، یک نمونه کنتـرل مثبـت (از DNA لیـشمانیا ماژور موجود در کیت) و یک نمونه منفی (استفاده از آب مقطر بجاي (DNA نیز همراه با نمونه ها استفاده می گردیـد. واکـنش
PCR نیز با شرایط موجود در راهنماي کیت انجام می گردید.

الکتروفوز و تهیه تصویر از محصول :PCRمقـدار۱۰

میکرولیتر از محصول هر واکـنش PCR در ژل آگـارز ۲درصـد در بافر۰/۵TAEدرصد به مدت ۸۰ دقیقه با ولتاژ ۱۰۰ میلی آمپر الکتروفورز گردید. پس از پایان الکتروفورز و رنـگ آمیـزي ژل با اتیدیوم برماید ( ۱mg در ۱۰۰ میلی لیتر بافر (TAE نتیجـه در دستگاه ژل گرب با اشعه UV مشاهده و عکسها در فلاپی ذخیره گردیــد. بــراي محاســبه انــدازه بانــدهاي مــشاهده شــده در ژل از مارکر ۱kb ladder شرکت سـینا ژن اسـتفاده گردیـد. مـشاهده باندهاي ۶۲۰bp نشاندهنده گونه لیشمانیا ماژور، ۸۰۰bp معرف گونه لیشمانیا تروپیکا و عدم مـشاهده بانـد بـه منزلـه منفـی بـودن نمونه تلقی می گردد. حساسیت و ویژگی روشها بر اساس مأخذ

محاسبه گردید.((۱۶

نمونه بـرداري از بیمـاران بـا کـسب رضـایت آنـان و مطـابق روش معمول یک بار انجام گردید. نتایج آزمایش نمونه بیمـاران جهت پیگیري و درمان به آنها اعلام گردیـد، ضـمنا در تجزیـه و تحلیل داده ها و گزارش نتایج نامی از بیماران ثبت نگردید.

یافته ها

از مجموع ۷۳ بیمار۳۰ نفر مذکر و ۴۳ نفر مونث بین سـنین ۲

ماه تا ۵۸ سال بودند و میانگین سنی آنان ۱۴/۶ سال بـود. ۵۳ نفـر

۱۸۳

از این بیماران ایرانی و ۲۰ نفر غیـر ایرانـی (افغـان) بودنـد. نتـایج آزمایش میکروسکوپی در ۲۸ مورد از ۷۳ بیمار (%۳۸/۴) و نتایج کشت نمونه ها در محـیط NNN در ۴۶ مـورد (%۶۳/۱۵) مثبـت شد. آزمایش PCR بر روي ۶۳ نمونه از نمونـه هـاي فـوق انجـام گردید که ۳۵ مورد (%۵۵/۵) مثبت گردیـد. PCR مـستقیم روي

۱۰ نمونه دیگر به دلیل عدم تهیه نمونه آنهـا بـراي PCR مـستقیم انجام نشد. بـه منظـور مقایـسه ایـن ۳ روش در تـشخیص بیمـاري لیشمانیوز، روش کشت NNN بعنوان استاندارد طلایـی ( Gold(standard در نظر گرفته شد (۱۷) و دو روش دیگر نسبت به این روش مورد سنجش قرار گرفت. حـساسیت و ویژگـی بـا حـدود اطمینان %۹۵، براي روش میکروسـکوپی بترتیـب((%۶۱-۰/۱۴ و (%۱۰۰-۰/۰۶) بدست آمد (جدول (۱

جدول شماره :۱ مقایسه آزمـایش میکروسـکوپی بـا روش کـشت براي تشخیص لیشمانیوز جلدي در میرجاوه، ۱۳۸۴
کشت (NNN)
مثبت منفی جمع
میکروسکوپی مثبت (a) 28 (b) 0 28
منفی (c)18 (d) 27 45
جمع ۴۶ ۲۷ ۷۳

Sensitivity ( Se) = a ÷ (a+c) = 28 ÷ (۲۸+۱۸) = %۶۱ – ۰/۱۴ Specificity (Sp) = d ÷ (b+d) = 27 ÷ (۰ +۲۷) = %۱۰۰ – ۰/۰۶

ارزش اخباري مثبـت و ارزش اخبـاري منفـی نیـز بـراي ایـن روش بترتیـــب ۱ و ۰/۶ حاصـــل شـــد. در مـــورد روش PCR

حساسیت و ویژگی بترتیب برابر ( (%۷۶-۰/۱۶ و (%۷۳-۰/۱۹) و

ارزش اخبــاري مثبــت و منفــی بترتیــب ۰/۸۰ و ۰/۶۸ محاســبه گردید. (جدول شماره (۲

جدول شماره :۲ مقایسه روش PCR با روش کشت براي تشخیص لیشمانیوز جلدي در میرجاوه، (۱۳۸۴)
کشت (NNN)
مثبت منفی جمع
PCR مثبت ۲۸ ۷ ۳۵
منفی ۹ ۱۹ ۲۸

جمع ۳۷ ۲۶ ۶۳

Se = 28 ÷ (۲۸+۹) = %۷۶ – ۰/۱۶

Sp = 19 ÷ (۷+۱۹) = %۷۳ – ۰/۱۹

۱۸۴

بحث

ایـــن مطالعـــه نـــشان داد کـــه حـــساسیت هـــر دو روش میکروسکوپی و PCR از روش کشت پائین تر اسـت امـا روش

PCR از نظــر حــساسیت نــسبت بــه روش میکروســکوپی برتــري دارد. بعلاوه اینکه مزیت شناسایی گونه انگـل نیـز اختـصاص بـه روش PCR دارد. گونه انگل قبلا در این منطقه شناسـایی نـشده بود و نظرات اغلب بر اسـاس علائـم بـالینی بـود کـه مـواردي را بعنوان سالک شهري و بخشی را بعنوان سالک روسـتایی معرفـی می کردند. گونـه انگـل شناسـایی شـده بـا روش PCR لیـشمانیا ماژور (Leishmania major) تشخیص داده شـد و ایـن خـود دلیلی است بر اینکه بیماري در این منطقه از نوع روستایی است.

ارزشیابی و مقایسه روشهاي تشخیـصی لیـشمانیوز از اهمیـت ویژه اي برخوردار است و تصمیم گیري در خصوص اینکـه چـه روشی براي چه هدفی توصیه گردد هنوز نیازمند اطلاعات دقیـق پژوهــــشی مــــی باشــــد. در ایــــن مطالعــــه ســــه روش PCR،

میکروســکوپی و کــشت از نظــر تشخیــصی مــورد مقایــسه قــرار گرفتند.

پــائین تــرین حــساسیت (%۶۱) بــراي روش میکروســکوپی بدســت آمــد. اگرچــه ویژگــی روش میکروســکوپی در مطالعــه حاضر ۱۰۰درصد بود اما با توجه بـه پـائین بـودن حـساسیت آن، ایــن روش بــراي تــشخیص بیمــاري لیــشمانیوز از اعتمــاد کــافی برخوردار نیست. سایر مطالعات نیز حساسیت پائینی را بـراي ایـن روش گــزارش نمودنــد، بعنــوان مثــال در مطالعــه Aviles و

همکاران (۸)، حساسیت میکروسکوپی ۴۲درصد بـود. در مطالعـه اي در ترکیه، Culha و همکاران تعداد ۲۵ نمونه را مورد مقایسه قرار دادند که با روش میکروسکوپی ۶۸ درصد از آنها تـشخیص داده شد و در مقایسه با مطالعه حاضر حساسیت بـالاتري را نـشان داد، البته به نظر می رسد تعداد نمونه در مطالعه فـوق ۲۵) مـورد)

جهت مقایـسه تحلیلـی کـافی نیـست و از طرفـی، بیمـاران مـورد مطالعه آنها به لیشمانیوز جلدي نوع شهري مبتلا بودند کـه عامـل آن لیشمانیا تروپیکا است و این گونـه از انگـل معمـولأ بـه میـزان

فراوانتري در زخم نسبت به لیشمانیا ماژور (عامل نـوع روسـتایی)

وجود دارد. (۱۸)براي روش PCR در مطالعه حاضـر حـساسیت و ویژگــی بترتیــب %۷۶ و %۷۳ نــسبت بــه روش کــشت in vitro
بدست آمد. در مطالعات دیگر نتایج مشابه یا با کمی تفاوت ارائه شــده و گــاهی حــساسیت و ویژگــی بــالاتري را نیــز گــزارش نمــوده انــد.(Oliveira(3-10 و همکــاران (۱۹)(۲۰۰۵) در یــک ارزشیابی PCR براي تشخیص لیشمانیوز مخاطی ۳۴ مـورد از ۳۵

مورد (%۹۱/۹۷) را تشخیص دادنـد. Al-Javabreh و همکـاران

(۲۰۰۶) بــــا اســــتفاده از قطعــــه ITS1 از DNA رایبــــوزومی، حساسیت ۸۷ درصـد و ویژگـی ۱۰۰ درصـد بـراي روش PCR

خــود گــزارش نمودنــد .(۲۰) همچنــین Marques و همکــاران

(۲۱)(۲۰۰۶) در مطالعـــه مقایـــسه روش PCR (قطعـــه ثابـــت از

(kDNA بــا روش میکروســکوپی و تــست جلــدي مونتــه نگــرو

(Montenegro skin test) بـراي تـشخیص لیـشمانیوز جلـدي آمریکایی، دریافتنـد کـه روش PCR مـی توانـد بعنـوان روشـی جایگزین براي تشخیص این نوع بیماري بخصوص براي مواردي که با تست جلدي و مونته نگر و منفی تـشخیص داده مـی شـوند بکار رود.

البته ذکر این نکته لازم است که شاید مقایـسه نتـایج بدسـت آمده با نتایج مطالعات دیگران به دلایلی در همه مـوارد از دقـت و استدلال کافی برخوردار نباشد اول اینکه در بعـضی مطالعـات نوع بیماري در منطقه آنـدمیک مـورد مطالعـه از نـوع لیـشمانیوز جلــدي شــهري و در بعــضی مطالعــات از نــوع روســتایی اســت و اصولأ تعداد انگل (لیشمانیا تروپیکا) در زخـم هـاي نـوع شـهري بیشتر از تعداد انگل (لیشمانیا ماژور) در زخم هاي نوع روسـتایی است. () دوم اینکه تعداد انگل موجود در زخم لیشمانیوز معمـولأ با پیشرفت دوره زخم کاهش پیدا می کند (۷)، بنابراین این مـسئله که در زمان نمونه برداري زخمها در چه مرحله اي قرار داشته اند محل سـوال اسـت و فراوانـی انگـل در نمونـه برداشـت شـده در بیماران متفاوت است و این نیز می توانـد منـشأ تفـاوت در نتـایج

آزمایشات در مطالعات مختلف باشد. دلیـل سـوم ایـن اسـت کـه تفاوت در روش هاي خالص سـازي (۲۲)DNA و همچنـین نـوع ژن یا قطعه DNA مورد هدف که در مطالعات مختلـف اسـتفاده می شوند نیز می تواند از عوامل موثر بر نتایج از جمله حـساسیت و ویژگی روش ها باشد.

به نظر مـی رسـد حـساسیت و ویژگـی مطالعـه حاضـر بـراي

PCR پائین تر از حد انتظار باشـد. دلیـل آن مـی توانـد برخـی از موارد فوق باشد. شاید یک دلیل آن استفاده از نـوع کیـت مـورد اســتفاده (DNG-plus) بــراي استحــصال DNA از نمونــه هــاي مستقیم در این مطالعه باشد. لذا مقایسه روش کیت مزبور با سـایر روش هاي استحـصال DNA بخـصوص روش فنـل – کلروفـرم خالی از فایده نیست. البته این بحث در مقایسه با بعضی مطالعاتی که فبلاً اشاره شد مطرح می گردد ولی مسلم اینست که بر اساس نتایج این مطالعـه روش PCR نـسبت بـه روش میکروسـکوپی از حــساسیت بــسیار بــالاتري برخــوردار اســت. از طــرف دیگــر بــا استفاده از پرایمرهـاي اختـصاصی مـی تـوان همزمـان عـلاوه بـر تشخیص بیماري سالک، گونـه انگـل عامـل بیمـاري و در نتیجـه نوع سالک را نیز شناسایی نمود.

بد نیست به این موضوع نیز اشاره گردد که اگر چـه تـاکنون روش کشت in vitro (در محیط (NNN در مطالعـات مختلـف از جمله مطالعه حاضر بعنوان استاندارد طلایی مورداسـتفاده قـرار گرفته است، با ایـن حـال بعـضی اعتقـاد دارنـد کـه حـساسیت و ویژگی روش PCR بالاتر از روش کشت است و برتـري آن در حال محرز شدن است، به گونه اي که ممکن است بتدریج جـاي روش کــشت را بعنــوان اســتاندارد طلایــی بگیــرد .(۲۳) هــر چنــد مطالعاتی نیز حاکی از این است که PCR به تنهـایی نمـی توانـد استاندارد طلایی براي تشخیص باشد.((۲۴

علیرغم نتایج بـسیار بـا ارزش حاصـل از کـاربرد روش هـاي مولکولی براي تشخیص لیشمانیوز، بایـد اذعـان نمـود کـه هـیچ یک از روش هاي تشخیصی دیگـر از جملـه PCR و کـشت بـه

۱۸۵

ارزانی و سـادگی روش میکروسـکوپی نیـست. بـر اسـاس نتـایج بدست آمده در این مطالعه، این نکته تأکید می گـردد کـه بـراي هر گونه تصمیم گیري بخصوص درمـان بیمـاران، بـه پاسـخهاي منفی گـسترش میکروسـکوپی نمـی تـوان اکتفـا نمـود و لـذا در مراکــزي کــه مــوارد زیــادي بــراي تــشخیص، درمــان و پیگیــري سالک مراجعـه مـی نماینـد، راه انـدازي روش PCR و همچنـین روش کــشت NNN بعنــوان روشــهاي مکمــل بــالاخص بــراي گسترش هاي منفی و همچنـین بـراي تعیـین گونـه انگـل (کـه از امتیازات روش PCR اختصاصی بکار رفته در این مطالعه اسـت)
قابل توجیه می باشد.

سپاسگزاري

هزینه انجام این مطالعـه توسـط دانـشگاههاي علـوم پزشـکی زاهدان و کرمان در قالب طرح تحقیقاتی بـین دانـشگاهی تـأمین

گردیده است. ضمنأ، نویسندگان بر خـود لازم مـی داننـد کـه از همکــاري صــمیمانه مــسئولین مرکــز بهداشــت اســتان سیــستان و بلوچــستان و مرکــز بهداشــت شهرســتان زاهــدان تــشکر نماینــد.

همچنین از کلیه کارکنـان مراکـز و خانـه هـاي بهداشـت شـهر و روستاهاي میرجـاوه بـالاخص آقایـان فـیض محمـد شـنبه زهـی، احمد کردي، کیومرث ریگی، امان ا… ریگی، محمد فیروزي و خــانم مهنــاز نــارویی و همچنــین مــردم عزیــز روســتاهاي منطقــه بخصوص روسـتاهاي میـل ۷۲ بـه واسـطه همکاریـشان صـمیمانه قدردانی و تشکر می گردد.

References

WHO. The leishmaniases and Leishmania/HIV co-infections . WHO, Fact sheet N 116, 1.
2000. Available from http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs116/en/print .html.
Mandell GL, Bennett JE, Dolin. Principles and practice of infectious diseases . 5th ed. 2.
Churchill Livingstone, 2000; 2838-2839.
Noyes HA, Reyburn H, Bailey JW, et al. A nested-PCR-based schizodeme method for 3.
identifying Leishmaniakinetoplastminicircle classes directly from clinical samples and
its application to the study of the epidemiology of Leishmaniatropica in Pakistan. J Clin
Microbiol 1998; 36(10):2877-2881
Mahboudi F, Abolhassan M, Yaran M, et al . Identification and differentiation of Iranian 4.
Leishmania species by PCR amplification of kDNA. Scand J Infect Dis 2001; 33(8):596-
598.
Safaei A, Motazedian MH, VaseiM . Polymerase chain reaction for diagnosis of cutaneous 5.
leishmaniasis in histologically positive, suspicious and negative skin biopsies.
Dermatology 2002; 205(1):18-24.
Rodriguez-BonfanteC ,Bonfante-Garrido R, Grimaldi G Jr, et al . Genotypically distinct 6.
Leishmaniacolombiensis isolates from Venezuela cause both cutaneous and visceral
leishmaniasis in humans. Infect Genet Evol. 2003; 3(2):119-124.
186

ناراکمهويدلاوفنمهب … ابمیقتسمPCRشورهسیاقم

۷٫ Belli A, Rodriguez B, Aviles H, et al. Simplified polymerase chain reaction detection of new world Leishmania in clinical specimens of cutaneous leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 1998; 58(1):102-109.
8. Aviles H, Belli A, Armijos R, et al. PCR detection and identification of Leishmania parasites in clinical specimens in Ecuador: a comparison with classical diagnostic methods. J Parasitol 1999; 85(2):181-187.
9. Rodrigues EH, Felinto de Brito ME, Mendonca MG, et al. Evaluation of PCR for diagnosis of american cutaneous leishmaniasis in an area of endemicity in northeastern Brazil. J ClinMicrobiol 2002; 40 (10) :3572-3576.
10. Gangneux JP, Menotti J, Lorenzo F, et al. Prospective value of PCR amplification and sequencing for diagnosis and typing of old world Leishmania infections in an area of nonendemicity. J ClinMicrobiol 2003; 41(4):1419-1422.
11. Reithinger R, Espinoza JC, Courtenay O, et al. Evaluation of PCR as a diagnostic mass-screening tool to detect Leishmania (Viannia) spp. in domestic dogs (Canisfamiliaris).J ClinMicrobiol 2003; 41(4):1486-1493.

۱۲٫ Van Eys GJ, Schoone GJ, Kroon NC, et al. Sequence analysis of small subunit ribosomal RNA genes and its use for detection and identification of Leishmania parasites. MolBiochemParasitol 1992; 51:133-142.
13. Alvar J, Molina R, San Andres M, et al. Canine leishmaniasis clinical, parasitological, and entomological follow-up after chemotherapy. Ann Trop Med Parasitol 1994; 88:371-378.

۱۴٫ Rodgers MR, Popper SJ, Wirth DF. Amplification of kinetoplast DNA as a tool in the detection and diagnosis of Leishmania. ExpParasitol 1990; 71(3):267-275.
15. Schonian G, Nasereddin A, Dinse N, et al. PCR diagnosis and characterization of Leishmania in local and imported clinical samples. DiagnMicrobiol Infect Dis 2003; 47(1):349-358.