مكانيسم تثبيت بيولوژيكي ازت

ازت به عنوان يك عنصر كليدي در ساختمان بسياري از تركيبات موجود در سلولهاي گياهي مطرح است. اين عنصردر فسفونوكلئوتيد و اسيدهاي آمينه هم وجود دارد كه اين تركيبات نيز به نوبة خود به ترتيب اسيدهاي نوكلئيك و پروتئينها را مي‌سازند. دسترسي به ازت براي گياهان زراعي از عوامل مهمّ محدود‌كنندة توليدات كشاورزي است. اين واقعيت كه فقط اكسيژن، كربن و هيدروژن بيش از ازت در سلولهاي گياهي وجود دارند، مبيّن اهميّت اين عنصراست.

در بيوسفر، ازت به اشكال متفاوتي وجود دارد. ۷۸% حجم هواي اتمسفر را ازت ملكولي (N2) تشكيل مي‌دهد. در بسياري از موارد اين مقدار فراوان ازت مستقيماً در دسترس گياهان قرار نمي‌گيرد. استفاده از ازت اتمسفر، مستلزم شكستن پيوند سه‌گانه بين اتمهاي (N = N) آن است كه گياهان عالي مستقيماً و به تنهايي توان انجام اين واكنش را ندارند. از سوي ديگر اشكال نيتراته و آمونياكي ازت به راحتي جذب گياه مي‌گردند(فصل ۵). مصرف گياهان توسط حيوانات

علفخوار موجب حركت بيشتر ازت در زنجيره‌هاي غذايي مي‌شود و ازت سرانجام از طريق تجزية اجساد حيوانات و گياهان به زمين بازمي‌گردد. اين مراحل بخشي از چرخة ازت را تشكيل مي‌دهند.

تبديل ازت مولكولي به اشكال ديگر آن نظير نيترات يا آمونياك را تثبيت ازت مي‌گويند. اين فرايند در غالب فرايندهاي طبيعي و مصنوعي قابل انجام است. درشرايط دماي بالا (حدود C ْ۲۰۰ ) و فشار بالا حدود (۲۰۰ اتمسفر)، ازت مولكولي با هيدروژن تركيب شده و آمونياك (NH3) توليد مي‌شود. براي انجام اين واكنش شرايط خاصي لازم است تا براي انرژي فعّال بالاي آن غلبه كند. اين واكنش كه به نام فرايند هابر موسوم است نقطة آغازين در توليدات متنوع صنعتي و كشاورزي به شمار مي‌آيد. در جهان سالانه حدود ۵۰ ميليون تن ازت به روش صنعتي تثبيت مي‌گردد.

اين مقدار حدود ۱۲% از كلّ ذخيرة اتمسفر را شامل مي‌شود كه سالنه از آن خارج مي‌شود (شكل ۲-۱۲، ب) (مارشنر، ۱۹۸۶). فرايند هاي طبيعي سهم بيشتري در تثبيت ازت دارند (وسويچ، ۱۹۸۳). ۱۰% ازكلّ ازتي كه به روش طبيعي تثبيت مي‌گردد، ناشي از رعدو برق است. رعدو برق سبب مي‌شود كه

راديكالهاي آزاد هيدروكسيل، اتمهاي آزاد هيدروژن، اتمهاي آزاد اكسيژن حاصل از بخار آب و اكسيژن موجود در اتمسفر و تركيباتي فعالي از اين قبيل، با نيتروژن مولكولي تركيب شده و توليد اسيد نيتريك (HNO3 ) نمايند، كه اين تركيب نيز توسط آب باران به زمين مي‌رسد. بخش بسيار كوچكي از تثبيت ازت ناشي از واكنشهاي فتوشيميايي با دخالت اكسيد نيتريت گازي و اُزن در استراتوسفر است. اسيد نيتريكي كه به اين ترتيب توليد مي‌شود سرانجام به بخشهاي پايينتر اتمسفر راه يافته واز آنجا نيز توسط باران به زمين مي‌رسد.

۹۰% باقيماندة تثبيت ازت، به روش طبيعي و توسط ميكروارگانيسم ها و از طريق فرايندي كه اصطلاحاً تثبيت بيولوژيكي ازت ناميده مي‌شود انجام مي‌شود (شكل ۱-۱۲، ب). تثبيت بيولوژيكي ازت توسط باكتريهاي آزادزي شامل سيانو باكتريها و باكتريهاي همزيست با گياهان انجام مي‌گيرد (بوريس، ۱۹۷۶؛ مارشنر، ۱۹۸۶). اين موجودات داراي يك سيستم آنزيمي هستند كه قادر است ازت مولكولي را تجزيه كند. از نقطه نظر كشاورزي نيز تثبيت بيولوژيكي ازت اهميت زيادي

داشته و منبع مهمي براي ازت خاك محسوب مي‌گردد، چرا كه نياز گياهان زراعي صرفاً از طريق كودهاي شيميايي تأمين نمي‌گردد (شوبرت و ولك، ۱۹۸۲).
واكنشهاي چرخه ازت كه نهايتاً سبب تثبيت آن مي‌گردند، شامل تغيير اشكال تثبيت شده و بازگشت ازت به اتمسفر نيز مي‌گردد. اشكال آلي ازت نظير اسيدهاي آمينه كه از طريق تجزيه بقاياي گياهي و حيواني به خاك برمي‌گردند، طيّ فرايند آمونياكي شدن به آمونياك تبديل مي‌گردند. باكتريها و قارچهاي موجود در خاك ازت آمونياكي را به آمونياك آزاد تبديل مي‌كنند.

اين نيز به نوبة خود مي‌تواند با اجزاي موجود در خاك تركيب شده و نمكهاي آمونيومي توليد كند، همچنين آمونياك آزاد شده مي‌تواند در ابتدا به نيتريت (NO2-) وسپس به نيترات (NO3-) اكسيد شود كه اين فرايند را نيتريفيكاسيون گويند. اكسيداسيون آمونياك به نيتريت توسط باكتريهاي گروه نيتروزو (نيتروزوموناس) انجام مي‌شود در حالي كه اكسيداسيون نيتريت به نيترات بيشتر توسط باكتريهاي گروه نيترو (نيتروباكتر) انجام مي‌پذيرد.

نيتروژن موجود در خاك به فرم نيتراتي مي‌تواند به سرعت جذب گياه گردد يا طيّ فرايند دنيتريفيكاسيون احيا شده و به صورت ازت مولكولي (N2) به اتمسفر باز گردد. بسياري از باكتريها در غياب اكسيژن و با وجود تركيباتي چون NO3- ، NO2- و يا N2O از دنيتريفيكاسيون به عنوان منبعي براي تأمين انرژي تنفسي استفاده مي‌كنند (بيورز، ۱۹۷۶).

دنيتريفيكاسيون فرايند بيولوژيكي مهمي به شمار مي‌آيد. زيرا در غياب اين فرايند نيترات به سرعت در اقيانوسها انباشته خواهد شد. علاوه براين وقتي ميزان ازت تثبيت شده در يك سال را (۱۲۵ ميليون تن) با ميزان ازت برگشتي به اتمسفر از طريق دنيتريفيكاسيون (۹۳ميليون تن) مقايسه مي‌كنيم باز هم مقداري ازت به عنوان مانده داريم (دلويچ،۱۹۸۳). اين يافته نشان مي‌دهد كه اين ميزان مازاد ازت تثبيت شده همان مقداري است كه به آرامي در خاك، درياچه‌ها و اقيانوسها انباشته مي‌گردد.

 

ارگانيسمها و روابط همزيستي در تثبيت ازت
بيش از ۲۰۰۰سال قبل در نوشتجات روميان به اثرات مفيد گياهان لگوم اشاره شده است. نويسندگان چيني طي همان دوره دربارة اثرات مفيد كاربرد سرخس آبزي (آزولا) در كشت برنج مطالبي نوشته اند. كتابي دربارة تكنيكهاي كشاورزي تحت عنوان « فنون تغذية مردم»

(Child Min Tao – shu) كه ۵۴۰ سال پس از ميلاد مسيح نوشته شده، كشت و كاربرد آزولا را در مزارع برنج توضيح مي‌دهد. اروپاي غربي با كاربرد لگوم‌ها در تناوب سبب پايداري كشاورزي شده و امكان صنعتي شدن را فراهم آورد. آقاي هامفري ديوي در سال ۱۸۱۳ اولين فردي بود كه عنوان نمود: نيتروژن ( ازت) از

اتمسفر گرفته مي‌شود. او نوشت « به نظر مي‌رسد كه لوبيا و نخود، خاك را براي كشت گندم مساعد مي‌كنند» .جي. بي. بوسينگالت در مطالعات تناوب زراعي خود در فرانسه، يك سري مقاله از سال ۱۸۳۷ تا ۱۸۴۲ انتشار داده ودر آنها اصول ورود ازت بوسيلة لگوم‌ها را بنا نهاد. آلبرت تيئر در سال ۱۸۵۶ در آلمان نوشت: « اخيراً كاشت شبدر سفيد با محصول بعدي، بسيار معمول شده است. فقط تعداد بسيار كمي از كشاورزان بي‌تفاوت و تنبل يا افرادي كه سخت طرفدار نظريات خود و سنتها هستند، اين عمل را انجام نمي‌دهند».

اهميت غده‌ها در تثبيت ازت بصورت همزيستي توسط هلريژل و ويلفارت در سال ۱۸۸۶ توضيح داده شد. بيجرينك در سال ۱۸۸۸ ارگانيسمهاي تثبيت كنندة N2 در لگومها را جداسازي كرده و آنها را باسيلوس راديسكولا نام نهاد. اين باكتريها بعداً ريزوبيوم نامگذاري شدند. جنس كلاستريديوم كه باكتري تثبيت كنندة ازت غير همزيست مي‌باشد در سال ۱۸۹۰ توسط وينوگرادسكي جداسازي شد و ازتوباكتر كه هوازي مي‌باشد در سال ۱۹۰۱توسط بيرجينك معرفي گرديد. تا پايان اين قرن، تقريباً تمام ميكروارگانيسمهاي تثبيت كنندة ازت شناسائي شده بودند.

گروههاي متنوعي از هسته دارها داراي آنزيم نيتروژناز (مسئول تثبيت N2)هستند. اين باكتريها امروزه دي‌آزوترف ناميده مي‌شوند و شامل باكتريهاي آلي‌پرور، باكتريهاي نورپرورگوگردي وسيانوباكترها (جلبك سبز- آبي) مي‌باشند. (جدول)

آلي‌پرورهاي آزادزي
نمونه‌اي از باكتريهاي آزاد هوازي و تثبيت‌كنندة ازت كه از مواد آلي بعنوان منبع انرژي استفاده مي‌كنند ازتوباكترها مي‌باشند ودر خاكهاي خنثي و قليائي يافت مي‌شوند. باكتريهاي مشابه آن نظير بيجرينكيا و در‌كسيا محدودة وسيعي از PH‌ را تحمل مي‌كنند واغلب در خاكهاي اسيدي مخصوصاً مناطق گرمسيري يافت مي‌شوند. تجزية ژنتيكي نشان مي‌دهد كه شباهت بيجرينكيا به آزوسيپريلوم (باكتري تثبيت كنندة ازت)بيشتر از ازتوباكتراست. اين ارگانيسمها، همچنين جنس كلبسيلا (تثبيت كنندة ازت) درمحيطها‌ي مرطوب بر روي برگ يا در پوشش برگ (فيلوسفر) ونيز در خاك و سطح ريشه فعاليت مي‌كنند.

 

ازتوباكتر، بيجرينكيا و ريزوبيوم براي توليد انرژي موردنياز در تثبيت N2 ، به شرايط هوازي نياز دارند. معذالك در اين ارگانيسمها و ديگر دي‌آزوتروفها، فعاليت آنزيم نيتروژناز درحضور O2 محدود مي‌گردد. مكانيسمهاي اختصاصي براي حفاظت نيتروژناز شامل قرار‌گرفتن باكتري در داخل ياخته و احاطه شدن آن بوسيلة چندين غشاء مي‌باشد. توليد مواد لزج بوسيلة ياخته ها نيز يك مكانيسم حفاظتي است كه در نتيجة اين عمل، انتشار O2 به طرف آنزيم كاهش مي‌يابد.

خصوصيت ديگر باكتريهاي هوازي تثبيت كنندة ازت، تنفس شديد در داخل ياخته خود باكتري است. اين عمل در ازتوباكتر به كاهش غلظت O2 در داخل باكتري كمك مي‌كند. تصور بر اين است كه آنزيم نيتروژناز در حضور O2 جهت سازگاري با آن، تغيير ساختمان داده ولي قادر به تثبيت ازت نخواهد بود. اين تغيير برگشت پذير بوده ودر صورتيكه O2 به مدت طولاني داخل باكتري حضور نداشته باشد، اين آنزيم به حالت تثبيت ازت برمي‌گردد .

ارگانيسمهاي ميكروهوازي اختياري نظير كلبسيلا، آزوسيپريلوم و باسيلوس در محيطهائي كه نياز به جلوگيري از O2 وجود ندارد، انرژي خود را به فرم ATP توسط مسير اكسيداتيو توليد مي‌كنند. دي‌آزوتروفهاي بي‌هوازي نظير كلاستريديوم و احيا كننده هاي سولفات شامل دسولفوويبريو و دسولفوتوماكولوم نيز از تركيبات آلي به عنوان دهندة الكترون استفاده مي‌كنند. با وجود اين، مسير تخميري اين ارگانيسمها منجر به تشكيل موادآلي حدواسط شده و انرژي كمي براي تثبيت

ازت، قابل دسترس خواهد بود. برخي شرايط محيطي هم وجود دارند كه مواد اوليه قابل دسترس در آن زياد بوده و شرايط بي‌هوازي هم حاكم است (نظير ماندابها) كه در اين حالت مقادير قابل توجهي N2 توسط اين ارگانيسمها تثبيت مي‌شود. شرايط بيهوازي، توانائي كسب انرژي از اكسيداسيون مواد اوليه را

كاهش مي‌دهد. شرايط بيهوازي، همچنين رقابت استفاده از اين مواد اوليه را به وسيلة ارگانيسمهاي ديگر نظير باكتريها و قارچهاي هوازي، كاهش مي‌دهد. مقدار ازت تثبيت شده بوسيلة دي‌آزتروفهاي آزادزي و ارگانيسمهاي فيلوسفري، عموماً چند كيلو‌گرم در هكتار مي‌باشد. تحقيقات نشان مي‌دهند كه بدون استثناء در همة مكانها فرآيند تثبيت ازت، اگر چه مقدار آن كم باشد، صورت مي‌گيرد. تأثير دي‌آزوتروفهاي آزادزي وقتي قابل ملاحظه است كه در مقياس جهاني مورد نظرقرارگيرد مخصوصاً در مناظقي كه چرخة ازت در داخل خاك برقرار بوده و سرعت كم رشد گياهان، نياز ازتة آنها را كاهش مي‌دهد .

نورپرورهاي آزادزي
دريوس در سال ۱۹۸۲ نشان داد كه سيانوباكتري‌ها (جلبك‌هاي آبي ـ سبز) ازت تثبيت مي‌كنند. آنها در اكثر محيط‌هاي آبي حضور دارند. آنها همچنين در سطح يا درست زير سطح اكثرخاكها مخصوصاً در نواحي كه جديداً در معرض فرسايش بوده يا تازه از آب بيرون آمده باشند، يافت مي‌شوند. سيانوباكترها در اكثر محيطهاي آبي نظير شاليزارها و درياچه‌هاي كوچك با مقادير متوسطي از عناصر غذائي، ديده مي‌شوند. در اين مكانها گاهي مي‌توانند توده هائي را بوجود آورند كه توليد مواد سمي بسيار قوي (مخدر اعصاب) براي جانوران مي‌كنند. آنها تنها پيش هسته‌هائي هستند كه همانند گياهان عالي مكانيسم فتوسنتزي داشته و داراي فتوسيسنم II بوده و O2 متصاعد مي‌كنند ولي در محيطهاي كم نور و كم اكسيژن مي‌توانند زنده بمانند.

سيانوباكترهاي دي‌آزوتروف آزادزي سه شكل مرفولوژيك دارند.سيانوباكترتك‌ياخته‌‌اي، گلوئوتس (قبلاً بنام گلوئوكاپسا شناخته مي‌شود) ارگانيسم هوازي خاكزي و حساس به نور زياد مي‌باشد. اين باكتري، نيتروژناز خود را بوسيلة مكانيسمي شبيه ازتوباكترها كه در آن، آنزيم به وسيلة غشاهائي پوشيده شده، از اكسيژن توليد شده طي فتوسنتز، حفاظت مي‌كند.

توانائي تثبيت N2 مخصوصاً در سيانوباكترهاي رشته اي كه داراي ياخته هاي اختصاصي بنام هتروسيست هستند به فراواني ديده مي‌شود (شكل). هتروسيستهاي با ديوارة ضخيم كه در طول رشته از هر ۱۵-۱۰ ياخته بوجود مي‌آيند، آنزيم نيتروژناز خود را در مقابل صدمات O2 بوسيلة مكانيسم فيزيكي با ايجاد غشاهائي كه انتشار گازها را كاهش مي‌دهد، حفاظت مي‌كند. فقدان فتوسيستم II (سيستم فتوسنتزي توليد‌كنندة O2) در هتروسيستها به حفاظت

اين آنزيم كمك مي‌كند. جنس نوستوك كه نمونه اي از انواع رشته اي هتروسيست دار مي‌باشد، بصورت پوسته اي در بسياري از مراتع و خاكهاي بياباني ديده مي‌شود. اين پوسته ممكن است به مدت طولاني خشك شده ولي در اثر بارندگي هاي كوتاه مدت يا شبنم صبحگاهي، مرطوب و فعال شده و تثبيت N2 انجام دهد. اين پوسته نياز به كلسيم دارد لذا خاكهاي آهكي را ترجيح مي‌دهند، همچنين اغلب به فسفر معدني اعم از كود فسفري توليد شده طي آتش سوزي، پاسخ مي‌دهند. سومين نوع مرفولوژيك شامل سيانوباكترهاي رشته اي بدون هتروسيست بنام پلكتونما مي‌باشد.

شاليزارها بهترين محل براي مطالعة سيانوباكترها هستند كه در آنها آنابنا، گلئوتريچيا و سيتونما ديده مي‌شوند. اين ارگانيسمها با كاشت دراز مدت برنج طي هزاران سال استقرار پيدا كرده اند. تحت همچون شرايطي اندازه گيري مقدار تثبيت ازت شامل آلي‌پرورهاي آزادزي و نورپرورهاي آزادزي مي‌باشد.

همانند تمامي اندازه گيريهاي تثبيت ازت، مقدار تثبيت شده بستگي به شرايط محيطي نظير رطوبت، عناصر قابل جذب و دوره اي كه تثبيت ازت بطور مؤثر صورت مي‌گيرد، دارد. برآوردهائي از مقدار تثبيت ازت بطور متوسط ۳۰كيلوگرم در هكتار و سال بوده و گاهي تا year -1 Kg ha -1 70ديده مي‌شود.

باكتريهاي نورپرور تثبيت كنندة ازت به غير از سيانوباكترها نيز وجود دارند كه آبزي بوده ودر درياها و آبهاي شيرين زندگي كرده اما در آنها، H2O طي فتوسنتز به عنوان دهندة الكترون عمل نمي‌كند و O2 نيز توليد نمي‌شود. دهندة الكترون در اينها H2S وS مي‌باشند. اين ارگانيسمها اگر چه مرفولوژي متنوعي دارند (جدول) ولي در راستة سودومونادال قرارمي‌گيرند. در آنها اغلب در حد فاصل رسوبات كف درياچه ها و آب يافت مي‌شوند، جائي كه پتانسيل رداكس پائين بوده، تركيبات گوگردي احيا شده وجود داشته و نور مي‌تواند در آن نفوذ كند.