نگرش های مولکولی و فیزیولوژیکی به تحمل خشکسالی
آب عامل اصلی محدود کننده در کشاورزی جهان می باشد. در کل اغلب گیاهان زراعی، حتی به یک تنش ملایم از دست دادن آب نیز به دشت حساس هستند. با وجود این، چند جنس از گیاهان مختص آفریقای جنوبی وجود دارند که قابلیت بسیار بالا برای مقاومت در برابر از دست دادن آب و خشک شدن را دارند. به این جنس ها، گیاهان قیامت “resurrection Plants” گفته می شود.

ما از Xerophta viscose به عنوان نمونه گیاهان قیامت (تک لپه ای) استفاده کردیم تا ژن های مرتبط با تحمل فشار اسمزی را استخراج کنیم. چندین ژن که بصورت متمایز بیان می شوند، در سطوح بیوشیمایی و ملکولی مورد مطالعه قرار گرفتند. این ژنها همان هایی هستند که قابلیت عملکردی خوبی به اشریشیاکلی در شرایط تنش اسمزی می دهند. ما در این مقاله از این آزمایش به عنوان پایه ای برای بحث درباره نگرش های ملکولی و فیزیولوژیکی به تحل خشکسالی، استفاده خواهیم کرد.

(osmoprotectants)، آبسیزیک اسید (ABA) و عوامل رونویسی
مقدمه:
آب یک جزء مهم و اساسی در متابولیسم تمام ارگانیسم های رانده است. آب، انجام شدن بسیاری از واکنش های حیاتی زیست شناختی را بوسیله دارا بودن خصوصیاتی نظیر حلالیت، فراهم کردن محیط انتقال، سرد کردن محیط از راه تبخیر، تسهیل می کند. (Bohert et al., 1995).
در گیاهان و سایر فتواتوتروف ها، آب نقش مهمی در فراهم کردن انرژی مورد نیاز برای پیشبرد فتوسنتز دارد. ملکولهای آب، طی فرآیندی بنام اتولیز شکسته شده و الکترونهایی بر جای می گذارند که این الکترونها برای به چرخه درآوردن انرژی نوری ذخیره شده در فتوسیستم II ضروری می باشند. (Salisbury an Ross, 1992a)

یکی از پیامدهای مهم تنش خشکی، از دست دادن آب پروتوپلاسمی است که منجر به افزایش غلظت یونهایی مانند می شود. در غلظت های بالا چنین یونهایی به طور موثری مانع عملکرد متابولیکی می شوند (Hartung et al., 1998). همچنین افزایش غلظت اجزای تشکیل دهنده پروتوپلاسم و از دست دادن آب سلول باعث ایجاد وضعیت خاصی به نام «حالت شیشه ای: glassy state» می شود. در این حالت، ویسکوزیته مایع موجود در داخل سلول بیشتر می شود که در نتیجه باعث افزایش احتمال برهم کنش های مولکولی و واسرشت شدن پروتئین ها و فیوژن غشا می شوند. (Hartung et la., 1998; Hoekstra et al., 2001).

بنابراین گیاه برای حفظ تورگور سلولی و عملکردهای متابولیکی نیاز به بیان ژنهای خاصی دارد. گروه تحقیقاتی ما می کوشد گیاهان تراژنی زراعی و همچنین وحشی را که قادر به مقاوت در برابر خشکی باشند، ایجاد کند. منبع ژنها گیاهی به نام Xerophyta viscose (Baker) از خانواده Vello=iaceae است که متعلق به گروه کوچکی از نهاندانگان می باشد. این گیاه به علت قابلیت فوق العاده تحمل خشکی به «گیاه قیامت» ملقب شده است (Farrant, 2000, Gaff, 1977).
این گیاه (X. viscose) تا ۵ درصد محتوای آب نسبی (RWC) می تواند آب از دست دهد و آبیاری مجدد این گیاه تقریباً به مدت ۸۰ ساعت آنرا سیراب کرده و گیاه فعالیت های یزیولوژیکی خود را از سر می گیرد. (Sherwin and Farront, 1998).

ژنهایی که در این مقاله مورد بررسی قرار خواهند گرفت، شامل موارد زیر هستند: (XVPer 1 (کد کننده یک آنتی اکسیدان)، VATP1XV (کد کننده یک پروتئین زیر واحدی C مانند از آنزیم –H+ آدنوزین تری فسفاتاز)، XVGOLS (کد کننده یک گالاکتینول سنتاز)، ALDRXV4 (کد کننده یک آلدوز ردوکتاز)، XVSAP1 (کد کننده یک پروتئین متصل شونده به غشای سلولی) و DREB1A (کد کننده یک عامل رونویسی). برای تعیین اثرات ناشی از بیان این ژنها در تک لپه ای ها، آنها را به گیاه

علفی بنام Digitaria sanguinalis انتقال دادیم و برای انتقال این ژنها خودمان یک سیستم انتقال طراحی کرده ایم (chen et al., 1998). سپس اگر نتایج مثبت باشند، ژنها به محصولات زراعی مانند ذرت (Zea mays) نیز منتقل خواهند شد. برای انجام چنین کاری بر روی دو لپه ای ها، ما نخست آن ژن ها را به Arabidopsis thaliana و Nicotina tobacum منتقل می کنیم.

پدیده تحمل خشکی یک پدیده پیچیده است که شامل بیان سازمان یافته ژنهای زیادی است (Walters et la., 2002) به عبارت دیگر، برای بدست آوردن گیاهان مقاوم در برابر خشکی، چند ژن باید به طور همزمان بیان شوند (Co-expression).
به عنوان مثال، بیان XVPer1، که به نظر می رسد DNA را در برابر گونه های فعال اکسیژن محافظت می کند، همزمان با بیان XVSAP1، که احتمالاً از تراوایی غشا جلوگیری می کند، همراه با بیان XVGOLS و ALDRXV4 که هر دو محافظت کننده اسمزی هستند، مجموعه ای از پروتئین های مرتبط به هم را نتیجه می دهد که با همکاری یکدیگر خصوصیت مقاومت در برابر خشکی را نتیجه می دهند.

برخی تغییرات ساختاری و فیزیولوژیکی ایجاد شده در سطح سلولها و در نتیجه در تمام پیکر گیاه از آنجائیکه پاسخ گیاهان به خشکی پیچیده و مختلف است، بنظر نمی رسد که فقط یک ژن در ایجاد تحمل خشکی نقش داشته باشد. بنابراین نیاز به درک پاسخ فیزیولوژیکی گیاهان تحت شرایط کمبود آب از اهمیت خاصی برخوردار است. (رجوع شود به Alpert and Oliver, 2002; Levitt,

۱۹۸۰, Walters et la. 2002 برخلاف گیاهان عادی، که پتانسیل آب را بالاتر از محیط حفظ می کنند و تلاش می کنند به فعالیت خود در دوره های کمبود آب ادامه دهند، گیاهان مقاوم خشکی یک استراتژی کاملاً متفاوت را به کار می گیرند: بافت های زنده تمام آب آزاد خود را از دست می دهند و سپس به طور آنی آب در دسترس بافت ها قرار می گیرد. این توانایی غیرعادی برای بقا در فقدان شدید آب در بافتهای زنده فقط در ۱۰۰ نهاندانه مشاهده شده است (Gaff, 1977). اگر چه

گیاهان قیامت ارزش اقتصادی چندانی برای کشاورزی ندارند، فهم بیشتر این پدیده می تواند نگرشهایی در مکانیسم های ممکن برای بهبود مقاومت گیاهان زراعی، ایجاد کند. در واقع روشهای زیادی وجود دارد که بوسیله آنها گیاهان مختلف به خشکسالی پاسخ می دهند (خلاصه شده در نمودار ۱)

پاسخ نهاندانگان قیامت به کمبود آب با اکثر گیاهان دیگر (که قادر به بقاء در شرایط کمبود شدید آب نیستند) تفاوت زیادی دارد. نهاندانگان قیامت دارای برخی مکانیسم های حفاظتی برای به حداقل رساندن تنش های مربوط به کمبود شدید آب داخل سلول می باشند، که این مکانیسم ها در طی خشک شدن گیاه شکل می گیرند (Farront, 2000; Gaff, 1989; Oliver et al., 1998; Vertucci and, Farrant, 1995: مقاله)

یکی از تنشهای مرتبط با بافتهای فعال فتوسنتزی، نور است. تحت شرایط محدود بودن آب، انرژی فعالسازی جذب شده توسط کلروفیل نمی تواند از طریق فتوسنتز دفع شود و ممکن است منجر به تشکیل رادیکالهای آزد اکسیژن شود که حالت غیراشباع دارند و باعث آسیب دیدن شدید اجزای سلولی می شوند. (Halliwell,1987; Kaiser, 1987; Larson, 1988; Smirroff, 1993).
نهاندانگان قیامت می توانند که دو روش شناخته شده مجزا، از خودشان در برابر آسیب اکسیداسیون نوری محافظت کنند. نهانداگان هومیوکلروفیلوس (homiochlorophyllous) مانند Myrothamnus flobellifolius, Craterostigma wilmsi بوسیله تا خوردن برگ و انباشته شدن آنتوسیانین از کلروفیل های خود محافظت می کنند.

در حالیکه نهاندانگان پویکیلوکلروفیلس (Poikilochlorophyllous) مانند Eragrostis nindensis, Xerophya viscasa، مکروپلاست و کلروفیل های خود را در طی خشکسالی از بین می برند. (Farrant, 2000; Gaff, 1989; Oliver et al., 1998). چنین مکانیسم های حفاظتی مانند قرار دادن ماشین فتوسنتز در سایه یا از بین بردن آن، مخصوص گیاهان قیامت است و کاهش کنترل شده میزان خالص فتوسنتز، مشابه با این گیاهان، در مواقع کمبود آب در سایر گیاهان عالی تر مشاهده نشده است (شکل ۲)

___________________________________________________

میزان خالص فتوسنتز در نهاندانگان قیامت در طی خشک شدن
X. humilis : Xh , M. flabellifolius : Mf
(گیاهی علفی مقاوم به خشکی)E. curvula : Ec , E. nindensis : En
میزان خالص فتوسنتز به صورت درصد بافت هیدراته شده برگ بیان شده است، فلش نشان دهنده محتوی آب نسبی (RWC) است که Ec نمی تواند میزان پایین تر از آنرا تحمل کند.
___________________________________________________
گر چه ممکن است پاسخ سایر گیاهان عالی به خشکی متفاوت باشد ولی در مکل خاموش شدن فرآیند چرخه کربن بتنهایی نتیجه محدودیت آب است. حتی در گیاهانی که قادر به ادامه رشد تحت کمبود متوسط آب هستند، مثل E. curvula میزان فتوسنتز در نزدیکی RWC (میزان آب نسبی) کشنده آن گونه تنزل می کند. به محضل اینکه میزان آب در محیط محدود می شود، حجم سلولی که در بافتها گیاهی کاهش می یابد. در گیاهان حساس به خشکسالی، با از بین رفتن تورگور

سلولی، فشار مکانیکی روی غشاها و دیواره های سلولی منجر به سیتوهیز (فرو ریختن دیواره سلولی، و آسیب غشایی جبران ناپذیر می شود (Vander Willigen et la., 2001 a). اما در گیاهان قیامت، چندین مکانیسم مختلف حفاظتی وجود دارند که از فشار مکانیکی مربوط به کاهش حجم سلولی جلوگیری می کنند. در برخی گونه ها مانند (Forrant, 2000; Vicre et la. 1999) C. Wilmsii, M. flabellifolius و (Vander Willinger et la., 2001 b) E. nindensis، سلول های دسته جات آوندی بوسیله تشکیل دادن چندین واکوئل کوچک حجم سلول را ثابت نگه می دارند. آب از واکوئل ها همراه محلولهای سازگار (compatible) مانند پروسین آزاد می شود.

جدا از این تغییرات ساختاری که در پاسخ به خشک شدن بروز می کند، چندین تغییر بیوشیمیایی برای حفاظت در برار نامتعادلی متابولیکی (که از طریق کمبود آب ایجاد می شود) الزامی است، در زیر برخی از این تغییرات را مرور می کنیم.

نقش گونه های فعال اکسیژن در تنش خشکی
یک جنبه کلی اکثر شرایط نامطلوب محیطی، افزایش تولید گونه های فعال اکسیژن (ROS) است که بوسیله چندین بخش داخلی سلول گیاهی تولید می شوند (Van Breusegem et al., 2001). ROSها می توانند به عنوان محصول فرعی متابولیسم سلولی عادی مانند فتوسنتز ایجاد می شوند. ولی تحت شرایط تنشی تشکیل آنها شدیدتر می شود. تنش خشکی منجر به آشفتگی در

سیستم های انتقال الکترون می شود، بنابراین تحت شرایط کمبود آب اصلی ترین جایگاه تشکیل ROS در سلول گیاهی، اندامکهایی می باشند که دارای فعالیت بالای اکسندگی متابولیکی و یا جریان الکترون می باشند: مانند کلروپلاست، میتوکندری و میکروبادی ها. در دستگاه فتوسنتزی، فتوسیستم II (PS II) به خاطر داشتن مجموعه Oxygen-evolving و مراکز واکنش بیشتر تحت تأثیر تنش خشکی قرار می گیرد (Toivonen and Vidaver, 1988; He etal., 1995).

در کل، ROSها (مخصوصاً رادیکالهای هیدروکسیل و سوپراکسید) به اجزای اصلی سلولی مانند DNA، پروتئین ها و چربی ها آسیب وارد می کنند. پروکسیداسیون چربی انسجم غشایی سلول گیاهی را مختل می کند. در نتیجه، محلولهای اصلی از اندامک ها و سلول بیرون ریخته شده و باعث اختلال در عملکرد غشاء و نامتعادلی متابولیکی می شود. DNA الگوی تعیین کننده هم

عملکرد و هم سرنوشت سلول
می باشد. هر آسیبی که به انسجام آن وارد شود، بدین معنی است که پروتئین هایی که برای عملکرد مطلوب گیاه ضروری هستند، سنتز نمی شوند. به طور مشابه واسرشت شدن پروتئین های مهم و ضروری بیان واکنش های بیوشیمیایی منجر به اثر منفی روی کل گیاه می شوند و گیاه قابلیت تحمل خود را از دست می دهد.

گیاهان دارای مکانیسم های حفاظتی تکامل یافته برای جلوگیری از آسیب رادیکالهای آزاد می باشند. اعضای اصلی این مکانیسم ها، آنزیم های آنتی اکسیدان مانند سوپراکسید دیسمیوتاز (superoxide dismutase)، کاتالازها و پراکسیدازها و ترکیبات رادیکال زدا مانند کارتنوئیدها، اسکوربات، توکوفرول ها و گلوتاسیون اکسید شده و احیاء شده (به ترتیب GSH, GSSG) می باشند (Price et la., 1994).

آنزیم سوپراکسید دیسمیوتاز غلظت سلولی و را تنظیم می کند. بوسیله کاتالازها و پراکسیدازها شکسته می شود. تحت شرایط تنش متوسط، رادیکال ها به طور موثر بوسیله این سیستم دفاعی آنتی اکسیدانی جمع آوری می شوند. ولی، در مواقع تنش شدید در گیاهان حساس به خشکسالی، سیستم جمع آوری رادیکالی بوسیله میزان افزایش یافته تولید رادیکال اشباع می شود و آسیب رسیدن به گیاه اجتناب ناپذیر خواهد بود.

گیاهان قیامت، علاوه بر تغییرات ساختاری که تشکیل ROS را به حداقل می رساند (شرح داده شده در بالا)، عمل حفاظت کننده های آنتی اکسیدانی مختلف را در طی خشک شدن و نیز در طی هیدراته شدن تنظیم می کنند (Farrant, 2000; Kranner et la., 2002; Sherwin and Farrant, 1998) مشاهده شده است که در X. viscose فعالیت های اسکوربات پروکسیداز، گلوتاسیون ردوکتاز و سوپراکسید دیسمیوتاز در هنگام از دست رفتن آب افزایش می یابد.
یک آنتی اکسیدان متفاوت و جدید که بوسیله تنش در X. viscose القا می شود

بوسیله screening افتراقی یک بانک cDNA از X. viscosa یک آنزیم آنتی اکسیدانی القا شونده بوسیله تنش جدید به نام XvPery شناسایی شده است/ (Mowla et al., 2002. این آنزیم به عنوان یک پروکسی ردوکسین (Prx) رده بندی می شود. اگر چه این آنزیم از لحاظ فیلوپنی به یک گروه قدیمی از آنزیمها متعلق است، ولی عملکرد کاتالیتیکی آن در زمان حال مورد بررسی قرار

گرفته است (Dietzetal., 2002). چهار دسته مختلف از پروتئین های مشابه Prx وجود دارند: ۲Cys-Prx, 1Cys-Prx و تیپ PrxQ., II-Prx. که هر کدام از آنها بوسیله داشتن یک یا دو ریشه سینستین کوتاه شده که برای عملکرد کاتالیتیکی آنها ضروری است، مشخص می شوند. XrPer1 از زیر تیپ ۱Cys-Prx می باشد. اگر چه عملکرد سلولی ۱Cys-Prx کاملاً درک شده است ولی ساختار پروتئینی آن مشخص شده است ۱Cys-Prx. (Stacy et al,. 1996) یک پروتئین نسبتاً کوچک است (۲۴۳ کیلودالتون) و در ارگانیسم های متفاوتی مثل آرکی باکتری ها، گیاهان و انسان حفظ شده

است (Keng et al., 1998). اولین ۱Cys-Prx گیاهی در حین بررسی پدیده خفتگی دانه کشف شد (Goldmark et al., 1992). از آن پس بیان این پروتئین در هسته جنین نابالغ و سلول های آلئورون (Aleurone) در دانه نهاندانگان و عدم حضور آن در بافتهای زنده هم تحت شرایط تنش و هم تحت شرایط عادی مشخص شده است (Stacy et la., 1996). ویژگی ۱Cys-Prx موجود در X. viscosa این است که آن در بافتهای زنده و تحت شرایط تنشی بیان می وشد و در گیاهان سالم و غیرتنشی وجود ندارد. این مطالب پس از اینکه گیاه درمعرض چندین تنش محیطی و غیرزیستی مانند آبزدایی، گرما، سرما، نور شدید و آبسیزیک اسید (ABA) قرار گرفت، گزارش شد. (Mowlo et al., 2002).

ما قبول می کنیم که X. viscosa به عنوان یک گیاه قیامت، دارای چندین رفتار خاص دانه ای است، مانند اینکه می تواند در مدتهای طولانی بدون متحمل شدن آسیبی، خفته باقی بماند. پس تعجب انگیز نخواهد بود که ژن های خاص دانه ای «سنتی» هنگام تنش در بافت مرگ گیاه بیان می شوند. علاوه بر آن با مطالعات ایمونولوکالیزاسیون (immunolocalizotion) X. Pery در هسته

سلولهای X. viscosa آبزدایی شده، مکان یابی شده است. آزمایشات قبلی روی ۱Cys-Prx نشان داده است که آن یک آنزیم حفاظت کننده DNA است (Stacy et al., 1996). یک ۱Cys-Prx موجود در برنج که با میزان بالا در گیاه تراژنی تنباکو بیان شد، مقاومت آنرا در برابر تنش اکسیداتیو ارتقاء داد. (Lee et la., 2000) این ژن بنابراین ارتباط زیادی با هدف ما برای توسعه گیاهان مقاوم به خشکی دارد.

اثرات تنش خشکی روی هومئوستازی یونی
هومئوستازی به طور وسیع می تواند به این صورت تعریف شود که: پاسخ ارگانیسمی به یک تغییر محیطی که در آن برخی جنبه های شرایط درونی گیاه به طور نسبی ثابت باقی می ماند یا تغییر اندکی می کند، برخلاف تغییرات شدید آن عامل در محیط (Solisbury and Ross, 1992 b). هنگامی که این تعریف برای هومئوستازی یونی در گیاهان بکار می رود، بدین معنی است که گیاهان یک وسیله مبارزه با نوسانات شدید غلظتهای یونی در سطح سلول، بافت و گیاه کامل را بکار می گیرند. براساس «برنامه محیطی سازمان ملل متحد» تقریباً ۵۰ درصد زمین های کشاورزی تحت تأثیر شوری قرار گرفته است (Flowers and Yeo, 1995). در نواحی کم باران کشاورزان نیاز به آبیاری بیشتر محصولات کشاورزی خود دارند و آب به عنوان یک منبع عمل می کند (Serrano et la., 1999)، هنگامی که آب تبخیر

می شود، یونهایی مانند کلسیم و منیزیم اغلب به صورت سریع به کربناتها تبدیل
می شوند و در اغلب موارد به عنوان کاتیون غالب باقی می ماند. تنش شوری بسیاری از اوقات بوسیله افزایش داخل سلولی نمایان می شود. خشکسالی و شوری، بوسیله کاهش دادن فعالیت شیمیایی آب و در نتیجه از بین رفتن تورگورسلولی، روی گیاهان تنش سموتیک اعمال می کنند.
نقش واکوئل ها در هومئوستازی یونی

نقش اصلی واکوئل گیاهی حفظ تورگور سلولی است که در کنار آن عملکردهای دیگری نیز دارند: مانند دادن شکل و انسجام به سلول، افزایش سطح سلول برای تسهیل فتوسنتز کارآمد و جذب مواد غذایی و ذخیره ترکیبات مختلف مانند قندها، پلی ساکاریدها، اسیدهای آلی، آمینواسیدها، ترکیبات پیگمانی و ترکیباتی که می توانند با آزاد شدن به سیتوپلاسم برای سلول سمی باشند (Taiz, 1992). واکوئل همچنین نقشی حیاتی در حفظ هومئوستازی بین خود و سیتوپلاسم دارد