پاتوبيولوژي و پاتوفيزيولوژي روتاويروس

۱-۱ لزيون هاي پاتولوژيك ايجاد شده توسط عفونت روتاويروسي
به طور كلي روتاويروس تمايل بافتي (tissue tropism) بسيار محدودي دارد و در بيشتر موارد فقط بافت اپيتليوم پرز (villus) روده كوچك را عفوني ميكند. به علاوه به نظر مي رسد كه عفونت روتاويروسي به طور كلي گونه هاي جوان محدود شود تغييرات هيستو پاتولوژيك روده كوچك لزيون هاي پاتولوژيك توسط عفونت هاي روتاويروسي القا مي شود.
در اغلب موارد مطالعات بر روي حيوانات عفوني شده به صورت آزمايشي و طبيعي صورت گرفته و بر روي لزيون هاي روده اي ايجاد شده بر اثر روتاويروس در انسان محدود مي شود.
اما به طور كلي تغييرات ايجاد شده در انسان با شبيه به گونه هاي حيواني است كه همه شامل از دست دادن ميكروويلي ها (microvilli) و متورم شدن (swelling) ER مي باشد. بيشتر نمونه هاي انساني از قسمت ابتدايي (proximal) روده كوچك بدست مي آيد.

۲-۱ تغييرات ايجاد شده در روده به دنبال عفونت روتاويروسي
به طور كلي در ابتدا رشد ويلي ها متوقف شده و به صورت كوتاه درمي آيند به علاوه انتروليت هاي (Entrocytes) در نوك بافت اپيتليوم پرز (پيلوس) به صورت نامنظم شده و واكوئول دار مي شوند و برخي از اين سلولها جدا مي شوند.
لايه بافت همبندي غشاء مخاطي (Lamina propria) در سلولهاي شبه رتيكولوم (reticulum-Like cells) افزايش پيدا مي كند.
تغييرات در ظرف ۲۴ ساعت از عفونت در زمانيكه سلول آغاز مي شود ايجاد شده و اينگونه به نظر مي رسد كه عفونت از قسمت ابتدايي (proximal) روده كوچك شروع شده و به سرعت به قسمت انتهايي (distal) پيشرفت مي كند.
در سال ۱۹۸۱ Carpio گزارش كرد كه عفونت تغييرات مشخص تري را در قسمت Jejunum نسبت به ileum القا مي كند. اين تغييرات شامل آتروفي ويلوس (villus atrophy) و كاهش نسبت ويلوس به كريپت (reduced villus/ crypt ratios) و پهن شدن مركزي سلولهاي اپيتليال (focal flattening of epithelial cells) مي باشد. سويه هاي ايجاد كننده بيماري با شدت كم تغييرات هيستولوژيك كمي را نشان مي دهد. به علاوه در بررسي هاي انجام شده در سال ۱۹۸۴ توسط Torres Media نشان داده شده كه عفونت منجر به از دست دادن Mcell ميكروويلي مي شود. در صورتيكه رپيليكاز درون اين سلولها انجام نمي شود. محل همانند سازي ويروس با استفاده از ميكروسكوپ الكتروني ايمونوفلورسانس و آزمايشات كشت سلول در نوك اپيتليوم ويروس شناسايي شد كه درست با محل ايجاد تغييرات غيرطبيعي (abnormality) هيستولوژيك منطبق مي باشد. در يك مطالعه انجام شده در سال ۱۹۷۹ توسط Mebus كه با روشهاي تشخيصي كشت بافت انجام شد ويروس عفوني در يك تيتر پايين از ندول هاي لنف در قسمت مرانتريك (mesentric lymph nodes) و شش (lung) جدا شد.

۲- پاتوفيزيولوژي عفونت روتاويروسي
۱-۲ مكانيسم اسهال
طي بررسي هاي انجام شده در سال ۱۹۷۷ توسط Davidson و همكارانش مشخص شد كه جريان هاي يوني شبكه اي (net ion fluxe) در نمونه هاي آزمايشي تغيير نمي يابد اما جذب سديم به واسطه گلوكز (glucose mediated sodium absorption) كم مي باشد. به علاوه اپيتليوم عفوني شده با روتاويروس ترشح Cl- تغيير در پاسخ به تئوفيلين (theophylline) ندارد و سطوح AMP حلقوي (cyclic AMP levels) تغيير نمي كند. فعاليت تيميدين كنياز (thymidine kinase) افزايش يافته در حايكه فعاليت سوكراز لاكتاز و آلكالين فسفاتاز كاهش مي يابد.
جذب Na+ آب ۳ ارتومتيل گلوكز (۳-O-Methylglucose) در بيماري كاهش مي يابد. و طي بررسي هاي انجام شده در سال ۱۹۸۱ توسط HyAMS و همكارانش مشخص شد كه جذب ناقص لاكتوز در طي عفونت در انسان نيز ديده مي شود. به طور كلي لاكتاز و سوكراز روده اي به نسبت كمتري از Na+ – K+ Atpase كاهش مي يابد. همزمان با اين تغييرات هيتولوژيك در روده gap اسموتيك مدفوعي و غلظت لاكتوز مدفوعي افزايش مي يابد. به علاوه تخريب سولهاي نازك ويلوس بالغ منجر به جذب ناقص (Malabsorption) كربوهيدرات شده و اسهال اسموتيك ايجاد مي شود.
۲-۲ تغيير در جذب ماكرومولكولها از بين سطح موكوزال روده در طي عفونت
به طور كلي به نظر مي رسد كه عفونت روتاويروس نفوذپذيري روده را نسبت به مولكولهاي مختلف تغيير مي دهد. عفونت توانايي روده را نسبت به جذب مولكولهاي پلي اتيلن گليكول (PEGs) با وزن هاي مولكولي مختلف (۱۲۵۰ – ۲۸۲) و D-xylose كاهش مي دهد. به علاوه بر نفوذپذيري روده اي نسبت به لاكتور و لاكتولوز افزايش يافته در حاليكه جذب L – رامنوز كاهش مي يابد.
جذب HRP نيز در طي عفونت افزايش يافته كه تحت تاثير وجود يا عدم وجود فلور روده اي مي باشد.

واكسن هاي روتاويروسي
۱-۱ نسل ااول واكسن هاي روتاويروسي
اولين سري واكنش هاي روتاويروسي ايجاد شده واكسن هاي مونووالانت زنده تضعيف شده از روتاويروسي حيواني با مصرف خوراكي بود. ۳ واكسن مونووالانت كانديد شده از روتاويروسهاي حيواني RIT 4237 و ويروس گاوي سروتايپ G6P6G6 ‌RRV MMU 18006 ويروس ميمون رزوس سروتايپ G3P5G3 و WC3 ويروس گاوي سروتايپ G6P7G6 بود كه در برنامه واكسيناسيون رد شد. كه بر اساس يافته هاي Jennerian بود (۵۰ و ۵۳) .
واكسن RIT 4237 10 سال بعد از اينكه روتاويروس به عنوان اصلي ترين عامل ايجاد كننده گاسترانتريت حاد شناسايي شده در سال ۱۹۸۳ توسط Vesikari و همكارانش گزارش شد. از اين ۳ واكسن كانديد شده تنها واكسن MMU 18006 رزوس، تيپ Vpv موجود در سويه هاي انساني روتاويروسي را نشان مي دهد. واكسن هاي مونووالانت شامل VPV هترولوگوس ، ايمني protective هتروتايپيك را ايجاد مي كند كه بر عليه بيماري القا شده با سروتايپ هاي VPV متفاوت با سروتايپ واكسن است. (۱۰۰)
اين واكسن ها ايمن و ايمونولوژيك مي باشند اما نمي توانند ايمني هتروتايپيك ذاتي را به طور پيوسته بعد از واكسيناسيون القا كنند. (۵۰)
بيشترين اثر MMU 18006 در برنامه واكسيناسيون و نزولا مشاهده شد به طوريكه سويه روتاويروس در گردش در اين كشور G3 بود كه همان سروتايپ استفاده شده در واكسن بود، بر اساس اين مشاهده پيشنهاد شد كه ايمني اختصاصي سروتايپ بر عليه هر كدام از سويه هاي مه ماز نظر اپيدميولوژي در يك منطقه براي حداكثر piotection ضروري است. (۵۳)
واكسن ديگر مورد استفاده، واكسني به نام LLR يا Lamb stroin vaccin مي باشد. (۹۹ و ۵۰) كه اخيرا جهت استفاده به كشور چين مورد تاييد قرار گرفته است. اما استفاده روتين از اين واكسن در سيستم ايمني سازي كودكان انجام نشده است. (۹۹)

۲- نسل دوم واكسن هاي روتاويروسي
نسل دوم واكسن هاي روتاويروسي ، واكسن هاي روتاويروسي reassortant حيواني – انساني زنده و واكسن هاي روتاويروسي انسان است. (۱۰۰) كه عبارتند از: Rhesus RRV ×HRV VPV
(G4, G2 , G1) (ST3×RRV(G4) – DS1×RRV(G2) – D ×RRV(G1) و Bovine UK×HRV VPV(G1-G4) و W179-9(G1) است.
كه هدف از اين تغييرات توسعه واكسن زنده مالتي والانت شامل ويروسهايي همراه با ويژگي VPV براي هر ۴ سروتايپ رايج است. (۱۰۰) كه در اين روش از يك روتاويروس حيواني به عنوان يك فنوتايپ تضعيف شده براي توليد واكسن reassortant كانديد شده كه مشتق از ۱۰ ژن از روتاويروس حيواني و ۱ ژن از روتاويروس انساني است كه اين ژن آخري ژروتئين خنثي كننده Vpv راكد مي كند كه بر اساس سروتايپ هاي G رايج و معمول از نظر ايپدمولوژي مي باشد. (۵۰ و ۱۰۰ و ۵۳)
واكسن هاي reassortant Rhesus-human روتاويروسي توسط كشت هاي سلولي coinfecting با RRV سويه MMU18006 (سروتايپ G3 و سويه هاي D روتاويروس انساني (سروتايپ G1) ، DS-1 (سروتايپ G2) و ST3 (سروتايپ G4) توليد شد (۵۳ و ۱۰۰) به اين ترتيب سويه هاي reassortant حاصل شامل D×RRV و DS-1×RRV و ST3×RRV است كه هر كدام از آنها ژن VPV را از HRV (با سروتيپ هاي مختلف ۴ و ۲ و ۱) و ۱۰ ژن ديگر را از RRV دريافت كرده اند (۵۳ و ۱۰۰).
اين واكسن RRV-TV در آمريكا تهيه شده و در اوت ۱۹۹۷ مورد تاييد قرار گرفت. (۹۹)
در جمعيت هاي گوناگون در قسمت هاي مختلف جهان بررسي شده است. مشاهده شده كه ايمن ايمونولوژيك و با خاصيت عمل بسيار بالا بر عليه اسهال هاي ناشي از روتاويروسي است. (۵۰ و ۵۳)
تتراوالانت RRV-TV با مقدار PFU104 از هر ۴ ويروس آزمايش شده و در دوز PFU105 كامل شد در واقع دوز تاييد شده براي واكسن (PFU105 ×۴) بود. (۵۳)
كه اغل به صورت خوراكي در ۳ دوز جدا از اهم در فاصله حداقل كمتر از ۳ هفته (۵۳) در ۲ و ۴ و ۶ ماهگي تجويز شد (۹۹).
بررسي هاي انجام شده نشان دهنده كارآمد بودن اين واكسن در ۵۰ تا ۶۰% از كل موارد اسهال هاي روتاويروسي و ۷۰ تا ۹۰% از بيماريهاي شديد روتاويروسي (اسهال منجر به بستري شدن) بود. اما در سال ۱۹۹۹ مشخص شد كه استفاده از اين واكسن در كودكان مي تواند منجر به ايجاد intussuception (افتادگي و يا كلاپس بخشي از روده به درون مجراي روده) شود كه باعث انسداد در روده مي شود. در كارگاه آموزشي كه در پنجم تا هفتم سپتامبر سال ۲۰۰۱ در ويرجينياي آمريكا برگزار گرديد ميزان ريسك اين عارضه پس از واكسيناسيون يك مورد به ازاي هر ۱۰۰۰۰ نفر فرد واكسينه شده اعلام گرديد. (۹۹)
به علت اينكه واكسن WC3 در القا آنتي بادي بر عليه سروتايپ ۱ كارآمد تبود نوع reassortant انساني – گاوي WC3 (سويه W179-9) تهيه شد (۱۰۰) كه واكسن reassortant تتراوالانت WC3 مي باشد كه ژن كد كننده VPV را از ۳ سروتايپ اصلي روتاويروس (G1-G2-G3) (53 و ۵۰) و G6 را از همان WC3 مي گيرد (۱۰۰) به علاوه W179-7 يك reassortant VP4 انساني با خصوصيت P[n] است. (۵۳) در يك دوره درمان موثر در ۳ دوز از اين واكسن protection بر عليه همه اسهال هاي روتاويروسي ۶۷% و بر عليه اسهال هاي شديد (منجر به بستري شدن) ۶۹% بود. (۵۳)

۳- نسل سوم واكسن هاي روتاويروسي
اين واكسن هاي از سويه هاي انساني زنده تضعيف شده تشكيل شده اند كه شامل (G1)M37 و (G3)RV3 و (G1)cold adapted virus مي باشد. (۵۰ و ۱۰۰)
در آغاز به دليل سخت كشت بودن سويه هاي انساني و در نظر گرفتن اين نكته كه ويروسهاي انساني ممكن است به اندازه كافي تضعيف نشده باشد اين نوع واكسن ها بررسي شد. اما در نهايت نتايج آزمايشات ايمني immunogenicity از اولين واكنس انساني كانديد شد (M37) در سال ۱۹۹۰ توسط Flores و همكارانش منتشر شد. اين ويروس از نوزاد بدون علامت (asymptomatic) در ونزوئلا گرفته شد و در سلولهاي كليه ميمون (Monkey kidney cells) رشد كرد.
M37 ويژگي VP7 با سروتايپ ۱ روتاويروس انساني همراه با ويژگي Vp4 سويه هاي ديگري از تيپ هاي ۲ و ۳ و ۴ و ۱ داراست و به علت اينكه از يك نوزاد بدون علامت گرفته شود بود تصور بر اين بود كه به صورت طبيعي تضعيف شده مي باشد.
زمانيكه با دوز PFU104 در هفته هاي ۱۰-۱۲ به كودكان بزرگتر تجويز شد در ۲۰% از كودكان ايمن شده (reactogenicity) تب پايين ديده ولي اين اثر جانبي قابل چشم پوشي بود در ۶۴% از كودكان پاسخ آنتي بادي خنثي كننده نسبت به M31 ديده شد. (۱۰۰)
وليكن طي يك دوره تجويز در كشور فنلاند در دوز PFU105 يا ۱۰۴ هيچ تاثيري مشاهده نشد . (۱۰۰)
۴-۱- نسل بعدي (آينده) واكسن هاي روتاويروسي
اين واكسن ها بر پايه توسعه بيولوژي مولكولي استوار است. واكسن هاي ساب يونيت در مقايسه با واكسن هاي ويروس زنده تضعيف شده داراي مزاياي زير مي باشد: ۱- ايمن تر بودن بخصوص براي افراد
۱- ايمن تر بودن بخصوص براي افراد immuno compromised (با نقص سيستم ايمني)
۲- كاهش قيمت براي توليد كنندگان
۳- ثبات و پايداري بيشتر در طي انتقال
۴- حذف مداخله با ديگر واكسن ها يا ارگانيسم هاي انتريك
انواعي از واكسن هاي ساب يونيت بالقوه جدول زير آمده است:
۱- پروتئين هايي از كپسيدهاي ويروسي . ويروس تخليص شده
۲- پروتئين هاي سنتز شده از ژنهاي كلون شد
A . پروتئين هاي تخليص شده از وكتورهاي بياني پروكاريوتيك
B . پروتئين هاي تخليص شده از وكتورهاي بياني يوكاريوتيك
C . پروتئين هاي توليد شده در مجراي gastrointenstianl توسط وكتورهاي ويروسي يا باكتريهاي زنده
۳- ذرات شبه ويروسي (virus like particles) توليد شده از (co-expression) بيان با هم از ژنهاي كلون شده.
۴- پپتيدهاي سنتيك
۵- واكسن هاي اسدي نوكلئيك

پروتئين هاي گروه A روتاويروسي
پروتئين هاي ساختماني
VP1 : بزرگترين پلي پپتيد روتاويروسي است كه به عنوان RNApol عمل مي كند (Cohen, 1977, Hruska, etal 1978) پلي مرازها با شوك حرارتي يا غلظت هاي پايين از عوامل شلات كننده مانند EDTA فعال مي شوند به طوريكه پوسته خارجي روتاويروس را حل مي كنند و ويروس هاي تك پوسته اي single shell را ايجاد مي كنند (Cohen etal 1979) در حضور CaCl2 (M5/0) پروتئين داخلي VP6 از ذرات single-shell جدا شد و باعث رها شدن core ويروسي شده كه در نتيجه منجر به عدم فعاليت ترانس كريپتاز مي شود. (Sandino 1986).
پلي مراز سنتز ssRNA به صورت dsRNA template را تنها از يك پلاريته صورت مي دهد. (Bernstein and Hruska 1981, Patton 1989)
ssRNA مثبت به عنوان templet در replication استفاده مي شود.
وجود يونهاي فلزي ۲ ظرفيتي مانند Mg2+ براي فعاليت پلي مراز هم در ترانس كريپشن و هم در ريپليكشن ضروري است. (Cohen, 1977: Cohen 1994)
توالي حفاظت شده اي از پروتئين هاي متصل شونده به GTP در ژل VP1 وجود دارد اما هيچ فعاليت گوانيليل ترانسفرازي در ارتباط با پروتئين VP1 ديده نشده است.
VP1 به عنوان RNA پلي مراز وابسته به RNA محسوب مي شود. (Fukuhara and coworkers 1988) اما فعاليت رپليكازي VP1 به وجود ساختار core از پروتئين VP2 نياز دارد. (Patton 1996)
پروتئين VP1 ممكن است به انتهاي آمين VP2 (25-1a) به صورت متوقت شود.
سيگنال cis-aeting لازم براي replication 26 نوكلئو تلاآفري از انتهاي ۳ templet RNA مي باشد. (Cohen et al 1994).