پروتئين هاي مثوك حرارتي

همانطور كه مي دانيد يك دسته از عواملي كه در رشد و فعاليت ميكروارگانيسمها موثر هستند عوامل محيطي مي باشند كه به ۲ دسته فيزيكي و شيميايي تقسيم مي شوند. يكي از مهمترين اين عوامل كه به عنوان يك عامل فيزيكي مطرح مي گردد گرما ( حرارت) مي باشد. حرارت بر كليه فعل و انفعالات سلولي اثر دارد و متابوليسم سلول را تحت تاثير قرار مي دهد. اگر حرارت تاحد معيني افزايش يابد واكنش ها را تسريع مي كند ولي اگر از حد معين تجاز كند فعاليت هاي متابوليكي را متوقف مي كند زيرا باعث مي گردد كه پروتئين ها ماهيت

خود را از دست بدهند، دناتوره گردند، آنزيم هاي مهم و اساسي سلولي از كار افتاده روي غشا و فشار اسمزي اثر كرده در نتيجه نقل و انتقال مواد را تحت تاثير قرارداده و روي مواد غذايي كاهش مي يابد و نفوذ مواد سمي و زايد افزايش پيدا كرده و خروج آنها كند مي گردد. در نتيجه فعاليتهاي سلولي مختل مي گردد. همچنين دما روي فعاليت هايي مثل توليد اسپور، توليد پيگمان، عمل تخمير و تنفس هم اثر مي گذارد.

حرارت اپتيمم: مناسبترين درجه حرارت براي رشد يك باكتري را گويند.
حرارت لتال: حرارت كشنده باكتري ها كه سبب مي گردد تمام ميكروارگانيسمهاي يك گونه درعر ۱۰ دقيقه كشته شوند.
ترموتولورانس : تحمل گرمايي
چاپرون ها : مولكول هايي پروتئيني هستند كه براي فولدينگ و تثبيت پروتئين ها اختصاص پيدا كرده اند و به پروتئين هاي جديد در حال ترجمه متصل مي گردند.
Folding : تا شدگي پروتئين ها
Unfolding :باز شدن تاي پروتئين

Refolding : تاخوردگي مجدد پروتيئن
باكتري ها از نظر نيازهاي حرارتي به ۳ دسته تقسيم مي شوند:
ترموفيل ها يا گرما دوست ها با دماي opt بالاي ۴۵ درجه كه در مناطق گرم، خاك و كود و … زندگي مي كنند و از نظر صنعتي نيز مهم هستند.
باكتريها هايپرترموفيل نيز گروهي از باكتري ها هستند كه در حرارت بسيار بالا مثل مناطق آتشفشاني زندگي مي كنند و قادر به رشدهستند و opt بالاي ۸۰دارند. مثل Bacillus steavo thermophilus

گروه دوم مزوفيل ها هستند مثل E coli كه در حرارت هاي مياني رشد مي كنند گروه سوم نيز ساكروفيل ها هستند مثل polaromonas كه در حرارت هاي زير ۲۰ و حتي زير صفر صفر رشد مي كنند.

به طور كلي ۲ پاسخي كه سيستم هاي بيولوژيكي به حرارت مي دهند شامل موارد زير است:
۱- fiuidity of the lipid bllayer
2- activity of enzyme systems
مورد اول و افزايش رواني غشاي ۲ لايه ليپيدي مي تواند نهايتاً باعث تراوش يك سري از يون ها به خارج گردد كه آركياها اين مسئله را با داشتن يك سري اتصالات اتدي حل كرده و مقاوم شده اند.

مورد دوم فعاليت سيستم آنزيمي است كه به ازاي هر ۱۰ درجه باعث ۲ برابر شدن فعاليت مي گردد كه اين داراي محدوديت است. اغلب ترموفيل ها آنزيمهايي دارند كه داراي مقاومت حرارتي هستند از جمله با داشتن يكسري اتصالات و باندهاي اضافه.
از جمله پاسخهاي مهمي كه ارگانيسم ها به تغييرات دمايي مي دهند القا و تحريك توليد يك سري پروتئين ها مي باشد كه به ۲ دسته تقسيم مي گردند:
۱- cold shock pro

۲- Heat shock pro
Hsp ها ۲ وظيفه كلي دارند كه در شرايط فيزيولوژيكي به عنوان چايرون هاي مولكولي فعاليت مي كنند و كاتاليز refoding پروتئين هاي دناتوره شده و كمك به بلوغ pro هاي تازه نستز شده و ممانعت از تراكم aggve pation پروتئيها.
دوم اينكه در پاسخ به استرسهاي سلولي نقش دارند از جمله به طور عمده در برابر افزايش حرارت و به ميزان كمتر از برابر فلزات سنگين، حضور راديكالهاي اكسيژن و اتانول و … توليد مي گردند. ( ۲ و ۳ و ۴ )

بدست آوردن ترموتولورانس به افزايش بقا ارگانيسم ها در حرارت هاي كشنده برمي گردد وقتي كه براي يك مدت زمان كوتاه در معرض حرارت هاي بالا و كشنده قرار بگيرند.
اين پاسخ لازمه سنتز تعداد كمي از پروتئين ها است كه بنام HSP ها شناخته شده اند. تحقيقات بسيار زيادي براي بررسي اين فرضيه انجام شده و نقش HSPها در مقاومت گرمايي مشخص گرديد.

۲ نتيجه كلي از اين تحقيقات بدست مي آيد:
۱- HSP ها حقيقتاً نقش مهم را در بدست آوردن مقاومت گرمايي بازي مي كنند.
۲- گونه هاي مختلف از استراتژي هاي مختلفي براي بدست آوردن مقاومت گرمايي استفاده مي كنند ( با استفاده از HSPها و ديگر ماكرومولكول ها)
اغلب تحقيقات انجام شده روي باكتري هاي ترموفيل فوكوس كرده اند و تعداد كمي نيز بر روي ترموفيل ها. ( ۱)
HSP ها اولين بار بعد از اينكه سلول ها به درجه حرارت هاي بالا عرضه گرديدند شناسايي شدند، در واقع به عنوان تركيبات حياتي از يك مكانيسم دفاعي سلولي بسيار حفاظت شده براي حفظ حيات سلول تحت شرايط محيطي شناخته شده اند.

اين ها در پاسخ به عوامل يادشده در بالا همچنين فلزات سنگين و التهاب و عفونت ايجاد شده توسط پاتوژن ها بيان مي گردند و در چند پروسه ضروري براي عملكردهاي سلولي تحت شرايط فيزيولوژيكي دخالت دارند.
HSPها پروتئين هايي مربوط به استرس هاي سلولي بسيار محافظت شده اند كه در هر ارگانيسم از باكتري ها تا انسان حضور دارند. اولين توضيح از يك پاسخ سلولي به فشار حرارت بيش از ۳۷ سال پيش داده شد.

اين اولين بار مشاهده شد در سال ۱۹۶۲ كه كروموزومهاي غدد بزاقي يك مگس سركه Drosophila meanogaster يك الگوي puf fing را بعد از قرار گرفتن در معرض حرارت نشان داد.
اولين محصول ژني كه در اين پافينگ كروموزومي دخالت داشت ۱۲ سال بعد شناسايي شد و heat shock protein نام گرفت.
از آن زمان به بعد بسياري از تحريك كننده هاي ديگر كه مسئول پاسخ شوك حرارتي بودند شناسايي شدند و مكان كروموزومي ژن هاي مربوط به اين Pro ها نيز مشخص شدند. ژنها تعيين توالي شدند و كانفور في شن pro هاي حاصل شرح داده شد و مكانيسم فعاليت ژن با فاكتورهاي رونويسي شوك حرارتي مشخص گرديد.

از آنجا كه پاسخ شوك حرارتي يك مكانيسم حياتي سلولي است، اين قابل فهم است كه HSP ها در رشته هاي پزشكي قابل توجه هستند.
تمام ارگانيسم ها با سوئيچ آف كردن سنتز تعداد زيادي pro ها و آغاز سنتز ميزان زيادي از HSP ها به شوك ها پاسخ مي دهند.

حتي ارگانيسم هاي ترموفيل كه حرارت Opt رشدشان بين ۵۰ تا ۹۰ درجه ميباشد نيز به افزايش ناگهاني حرارت با افزايش سريع بيان HSP ها پاسخ مي دهند.
تركيب آمينواسيدي HSPها در طول تكامل خيلي تغيير نكرده است و HSPهاي بسياري ارگانيسم ها بسيار شبيه يكديگر است ( ساختمان آنها حفظ شده است).
برخي اعضاي فايل HSP با استرس القا شده در حالي كه ديگر اعضا در حرارتهاي نرمال هم بيان مي شوند. ( ۴ )

ميكروارگانيسم هاي هايپر ترموفيل كه مي توانند در ۱۰۰ درجه يا بالاتر رشد كنند اكنون به خوبي مطالعه شده اند اگرچه در رابطه با پاسخ هاي آداپتيو آنها در برابر حرارت هاي بسيار بالا ميزان اطلاعات كمي وجود دارد.

HSP هاي برپايه وزن مولكولي شان به ۵ Class تقسيم مي گردند:
HSP هاي ۶۰ و ۷۰ و ۹۰ و ۱۰۰ و HSP Small ها.
HSP Small ها يا s HSPs يك كلاس متداول از HSP ها هستند و رنج وزن مولكولي آنها از ۱۵ تا ۴۵ KDa مي باشد و آنها بطور نرمال از كمپلكسهاي چند زير واحدي ( مولتي ساب يونيت) از ۲۰۰ تا ۸۰۰ KDa تشكيل مي شوند.

برخي از s SHP ها در حالت عادي در سلول هاي بدون استرس حضور دارند ولي سايرين با استرس القا مي گردند.
اغلب s HSP ها به Pro هاي x- كريستالين كه در لنزهاي چشم يافت مي شوند اشتراك فعاليت دارند و از نظر عملكردي نيز به عنوان چاپرون هاي مولكولي شناخته شده اند. ( ۳)
القا HSP ها در ابتدا در پروكاريوت ها و هم در يوكاريوت ها در سط رونويسي تنظيم مي گردد و در ارگانيسم هاي مختلف عملكردي مشابه دارند و در طول شوك حرارتي رونويسي از آنها با القاي ژن هاي آنها افزايش مي يابد در پروكاريوت ها پاسخ شوك حرارتي بعد از ۱۰ دقيقه معمولاً خاموش مي شود (۲)
در اينجا پاسخ هاي شوك حرارتي و مكانيسم هاي تنظيمي و انواع HSP ها و HSP s هاي توليدي در باكتري هاي مختلف شرح داده شده است از جمله:
۱- حصول ترموتولورانس در ۳ دومين فيلوژنتيكي شامل ۳ ميكروارگانيسم:

Bacillus Caldly ticus ،
Sulfo lobus shibatae ،
Thermomyces lanuginosus از ۳ حوزه (Bacteria , Archaea , Eucarya)
2- Borre lia Burydorferi
3- بدست آمدن ترموتولورانس و شوك حرارتي در آركياباكتري اكستريم ترموفيل sulfo lobus sp. Stran B12
4- مكانيسم و عملكرد HSP sها درآريكاي هايپرترموفيل pyrococus furiosus
5- باكتري ترمواسيدوفيل آركيايي sulfolobus tokodaii strain 7
6- باكتري مزوفيل Ecoli بطور كامل و دقيق
۷- باكتري Bacillus subtilis
عنوان
* بررسي حصول ترموتولورانس و HSP ها در ترموفيل ها از ۳ حوزه
فيلوژنتيكي:
ارگانيسم هاي ترموفيل از هر ۳ حوزه ژنتيكي باكتري ها و آركياها و يوكاريوتها بعد از شوك حرارتي مقاومت گرمايي بدست آورده اند.
Bacillus caldoly ticus در ۶۰ درجه رشد داده شد و در ۶۹ درجه براي ۱۰دقيقه شوك گرمايي داده شد و مقاومت گرمايي تا ۷۴ درجه نشان داد.
Sulfolobus shibatae در ۷۰ درجه رشد داده شد و شوك حرارتي در ۸۸ درجه براي ۶۰ دقيقه، مقاومت گرمايي تا ۹۵ درجه نشان داد.

Thermomyces ;amigompsus در ۵۰ درجه رشد داده شد و شوك حرارتي در ۵۵ درجه براي ۶۰ دقيقه مقاومت گرمايي تا ۸۵ درجه را نشان داد. تعيين سنتز pro در طول شوك حرارتي اختلاف در HSP هاي عمده براي هرگونه را آشكار كرد.

براي B.caldoly ticus يك پروتئين kda 70 غالب است در حالي كه s.shibatae يك KDa pro 55 و براي T .lanuginosos pro هاي ۳۱ تا ۳۲ KDa غالب هستند.
همچنين معرف هايي كه سنتز pro هاي نرمال را در طول شوك حرارتي مي شكند مانع افزايش مقاومت گرمايي شد. ( ۱ )
* حصول ترموتولورانس :

روش مورد استفاده مشابه ساير پروسه هاي توضيح داده شده است، اساساً يكي از ۲ نمونه يكسان از يك كشت در حال رشد فعال شوك حرارتي داده شد در حالي كه ديگري در حرارت معمول و آغازين رشد نگهداري مي گردد.

در پايان دوره شوك هر ۲ نمونه به يك حرارت كشنده انتقال داده شدند و بقاي آنها بصورت تابعي از زمان نشان داده شد.
نمونه هاي باسيلوس در ۶۰ درجه رشد داده شدند با شيك شديد در محيط مايع BC محتوي ۵/۰ درصد كلوكز و ۲/۰ % گاز امينواسيد و NH4CL
و در ۶۹ درجه براي ۱۰ دقيقه شوك داده شدند و در يك حرارت كشنده ۷۴ درجه قرار داده شدند. سلول هاي زنده در محيط BC شمارش شدند داراي آگار و عصاره مخمر و تريپتون با يك شب انكوبه شدن در ۶۰ درجه .

– نمونه هاي سولفولوبوس در ۷۰ درجه رشد داده شدند با تكان ملايم در محيط مايع SS محتوي دكسترين و براي ۶۰ دقيقه در ۸۸ درجه شوك داده شده و در معرض ۹۵ درجه قرار گرفتند و سلولهاي زنده با تهيه رفت هايي از محيط SSشمارش شدند.

– سرانجام نمونه هايي از Conidia از ترموماسيس براي ۴ ساعت در ۵۰ درجه انكو به شدند با شيك در يك محيط YPS تغيير يافته ( محيط T1 ) كه بالاي ۹۰درصد آنها رشد كردد. در ۵۵ درجه براي ۶۰ دقيقه شوك داده شدند و در ۵۸ درجه منتقل گرديدند و Conidia هاي زنده شمارش شدند با شمارش كلني هاي ميسليوم كه روي محيط T1 جامد و سخت شده با ۲ درصد آگار بعد از ۴۸ ساعت در ۴۵ درجه از دقت ها رشد كردند.

– تحت شرايط آزمايش ها تمام ۳ گونه ترموفيل ترموتولورانس را بدست آوردند اگرچه زمان پاسخ آنها وميزان تحمل آن ها متفاوت است ( شكل ۱)
اختلاف در حيات سلول ها با شوك حرارتي و بدون شوك به قدركافي زياد بود كه عليرغم تفاوت بين آزمايش ها شكي وجود ندارد كه برخي تطابق هاي مولكولي اتفاق افتاده است.
براي بررسي چگونگي وقوع اين تطابق ها، تغيير در سنتز Pro در طول آزمايش ها نمايش داده شد.(۱)

* سنتز پروتئين هاي شوك حرارتي و الكتروفورز ژن :
سنتز Pro در شرايط و حرارت هاي نرمال و حرارت هاي شوك با سلولهاي pulse – labeling با methionine ‍[ S 35 ]- L تعيين گرديد.
– ۵ ميلي متر نمونه از باسيلوس در فاز Log براي ۵ دقيقه با ۱۰ MC با ميتونين در محيط BC نشان دار شدند با جايگزين كردن كارامينواسيد با يك آمينواسيد ميتونين Free
– يك ميلي ليتر از نمونه سولفولوبوس در فاز log با ۱۰ MC از ميتونين نشاندار براي ۱۵ دقيقه در محيط استاندارد.

– ۵ ميلي ليتر نمونه Conidia از ترموماسيز كه در محلول نمك شسته شدند و با ۱۰۰ MC از ميتونين براي ۱۰ دقيقه در محيط T1 نشاندار شدند.
– در پايان زمان Labeling سلول هاي باسيلوس و سولفولوبوس با سانتريفيوژ حاصل شدند و در محيط كشت شسته شدند و در SDS لايز شدند. الكتروفور ژن SDS انجام شد و ژن با كوماسي بلو رنگ آميزي گرديد و آتوراديوگرافي آن انجام شد.

– Conidia هاي labele شده از ترموماسيز توسط سانتريفيوژ جدا شده و در يك محلول نمكي با ميتونين هاي unlabele شسته شدند و دوباره در ۳۰۰ ميلي ليتر از همان محلول حل شدند.
Conidia ها لايز شدند با تكرار سيكل هايي از freeze – thawing, sonication در ۸۰ – درجه.
به دنبال آن با انجام سانتريفيوژ pro ها از مايع رويي رسوب داده شدند با ۱۰درصد ice-cold از تري كلرو استيك اسيد.
رسوب شسته شده توسط ۵/۰ ice- cold ml استون ، در خلا خشك گرديد و دوباره در ۱۵۰ m1 از SDS gel Buffer براي الكتروفورز آماده شدند.
تمام نمونه ها تا ۱۰۰ درجه براي ۵ دقيقه مستقيماً حرارت داده شدند قبل از الكتروفورز بعد از الكتروفروز ژن رنگ آميزي گرديد با كوماس برليانت بلو و براي اتو راديوگرافي استفاده شد.
درهر ۳ گونه ترموفيل شوك حرارتي بطور واضح الگوي سنتز pro ها را تغيير داد(شكل۲)

اين تغيير در الگوي pro ها شامل تغيير هم در تعداد pro ها و هم در شدت و درجه بانداي visible بود.
در باسيلوس باندها با توده هاي مولكولي ۱۹ ۳۹ ۵۴ ۶۰ و ۶۷ و ۷۸ kda بطور واضح از نظر شدت افزايش يافتند در حالي كه شدت ديگر Pro ها كاهش يافت و در همان حد باقي ماند ( fig 2 A )، فقط رويت باند KDa 78 از نظر شدت كاهش يافت از دوره اول شوك ( ۰ تا ۵ دقيقه ) تا دوره دوم ( ۵ تا ۱۰ دقيقه ).
۵ باند ديگر القا شده با حرارت نيز افزايش شدتشان را در طول هر ۲ دوره شوك حفظ كردند ولي باند KDa 78 از نظر شدت روي ژل رنگ آميزي شده با كوماسي برليانت بلو شدتش افزايش يافت.

– در ۲ گونه ديگر باسيلوس B.steavothermophilus , B.subtilis تقريباً ۱۲ HSP شناسايي شدند و همان رنج از توده مولكولي را براي B. caldolyticus مشاهده كرديم.
در اين باسيل ها HSP اصلي وزن مولكولي ۷۰ KDa را دارد.
– در S.Shibatae يك باند اصلي از تقريباً ۵۵ KDa و ۵ باند minor از ۲۷ ۳۲ ۴۹ ۶۵ و ۸۲ KDa مشاهده شدند ( شكل ۲B )
اين مشاهده مسلم گزارش كرد وجود يك Major pro 55 KDa و ۲ Minor 28، ۳۵ KDa در اين ارگانيسم.
۳ باند ديگر القاشده با حرارت ۴۹ ۶۵ و ۸۲ KDa نسبتاً خفيف نيز ديده شد.

ما متوجه شديم كه باند ۵۵ KDa بطور قابل توجهي هم در شرايط نرمال و هم حرارت غلبه دارد.
گزارشات ثابت كرد كه اين باند ۴ تا ۶ برابر در طول يك دوره شركت حرارتي ۸۶ تا ۸۸ درجه از نظر شدت افزايش مي يابد و pro منسوب به كلاس ۶۰ HSP از چاپرون هاي مولكولي است.
در T. lannginosus كل ۸ باند ۳۱/۳۲/۳۳/۵۷/۶۵/۷۸/۱۰۰ و ۱۱۰ KDa در طول اولين مرحله شوك شدتشان افزايش يافته در طول دوره دوم ۳۱ و ۳۲ و ۳۳ kDa در شدت‌هاي افزايش‌ يافته در طول دوره دوم labeling (50 تا ۴۰ min)باقي ماندند. (شكل c2)
تمام اين باندها در محدودة مورد انتظار برايHSP هاي گزارش شدة ساير قارچ‌ها هستند.

در ديگر قارچ‌هاي رشته‌اي MSP. Neurospora Crassa 70 و ۸۰و۹۰ بيشتر القا مي‌شوند البته اين به محيط رشد نيز بستگي دارد.
در T. lannginosus MSP هاي بزرگ فوراً القا مي‌شدند پس از انتقال حرارتي اما گروه HSPهاي Small بطور واضح در پاسخ شوك حرارتي در طول هر دوره labeling غلبه دارند.
سنتز HSPهاي Small براي Dictyostelium discoideum و N.Crassa گزارش شده است. (۱)
* ارتباط بين ترموتولورانس و سنتز pro :

اثرات بازدارنده‌هاي سنتز pro روي توسعة ترموتولورانس در طول شوك حرارتي در B.caldolyticns و S.shilatae در شكل fig3 نشان داده شده است.
براي B.caldolyticns ؟ (۲۰۰ mg/ml200) سنتز pro را در طول شوك حرارتي ممانعت مي‌كند و افزايش بقا در رابطه با ترموتولورانس را از بين مي‌برد.
براي S.shilatae آمينواسيد آنالوگ azitidine در يك غلظت ۵٫۰ Mm به سنتز pro عملكردي در طول شوك حرارتي آسيب مي‌زند و ترموتولورانس را از بين مي‌برد.
آزمايشات كنترل كه در آن‌ها اين معرف‌ها بعد از شوك حرارتي يا حرارت‌هاي نرمال اضافه شدند نشان داد كه هيچ يك سمي نبودند و اگر بعد از شوك اضافه گردند ترموتولورانس بدست آمده دوباره مشاهده مي‌گردد.

در S.shilatae تحت شرايط آزمايش‌ها azetidine به طور آشكاري سرعت تشكيل متيونين هم در دماهاي نرمال و هم شوك حرارتي را كاهش داد. اين سنتز هيچ يك ازباندهاي القا شده با حرارت توضيح داده شده در بالا را تحريك نكرد اگر چه به طور قابل ملاحظه‌اي تشكيل باندهاي ۵۳ و ۶۰ kDa را در حرارت‌هاي نرمال افزايش مي‌دهد و باعث مي‌شود كه باند اصلي القا شده با شوك حرارتي (۵۵ KDa) نمايان شود.

اثرات سيكلوهگزاميد روي ترموتولورانس در T. lannginosus در table 1 نشان داده شده است.
حضور اين ممانعت كننده در طول شوك حرارتي اساساً ترموتولورانس را كاهش مي‌دهد.

– تعداد condia زنده مانده در حرارت‌هاي كشنده تا ۵ درصد كاهش يافت. اگر چه براي اين ارگانيسم حضور سيكلوهگزاميد بعد از شوك حرارتي چنين اثري داشت و درصد حيات را به حدود نصف كاهش داد اين عقيده وجود دارد كه سنتز pro در حرارت‌هاي كشنده تحت تأثير قرار مي‌گيرد.
و وقتي سيكلوهگزاميد حاضر باشد ۴۴% كاهش در حيات مشاهده مي‌گردد.

– در ۳ گونه توموفيل مورد مطالعه مثل ديگر ارگانيسم‌ها قرار گرفتن در معرض حرارت‌هاي بالا توانايي آن‌ها را براي بقا در حرارت‌هاي كشنده افزايش مي‌دهد كه بدست آمدن اين ترموتولورانس در رابطه با افزايش سنتز پروتئين‌هاي شوك حرارتي است و افزايش آن‌ها در سلول به وفور اگر ضروري نباشد ولي به نظر مي‌رسد كه براي بقا در حرارت‌هاي بالا در سلول بسيار مهم مي‌باشد. (۱)

* بررسي سنتز و بازچيني HSP ها توسط Borrelia burgdorferi :
سنتز و بازچيني HSPها توسط اسپيروكت ياد شده كه عامل بيماري لايم مي‌باشد توسط راديولي بلينگ از همة اسپيروكت‌ها و اسفروپلاست‌ها، مقايسة يك بعدي و ۲ بعدي با الكتروفورز ژن‌ پلي ساكاريد SDS و استفاده از ايمونوشيمي مورد مطالعه قرار گرفت.

به دنبال تغيير حرارت از ۲۸ به ۳۹ درجه هومولوگ KDA 72 , Dnak و ۳ HSP ديگر ۲۱ و ۲۷ و ۳۹ KDA از نظر مقداري ۳ تا ۱۵ برابر بين ۲ تا ۶ ساعت افزايش يافتند.
آزمايشات انقال عكس حرارت به پايين با انتقال اسپيروكت‌ها از ۴۰ به ۲۸ درجه ادامه يافت كه نشان داد در ۱۵ تا ۳۰ دقيقه سنتز اغلب HSP هاي اصلي به سطوحي كه در حالت عادي نگهداري اسپيروكت‌ها در حرارت‌هاي پائين مشاهده مي‌شود برمي‌گردد.

اسفروپلاست‌هاي بورليا بورگدورفري با در معرض گذاري با لايزوزيم و EDTA بدست آمده و سپس راديو لي بل شدند و HSPهاي خاص از نظر مكان در غشا يا سيتوپلاسم قرار داشتند.
آناليز بيشتر با الكتروفورز ۲ بعدي ۳ ايزوفرم اصلي بيان شده Dnak با pis نزديك ۵٫۵ را نشان داد.
به دنبال كشف و بررسي شوك حرارتي يك الگو حاكي از تجزية Dnak مشاهده شد اما نه در اسپيروكت‌هايي كه در يك حرارت پايين قرار گرفتند.
برخي محصولات حاصل از تجزيه با آنتي بادي‌هاي مونوكلونال مستقيم در برابر پروتئين Dnak آزبورليا شناسايي شدند.
اين جزئيات پيشنهاد مي‌كند كه به دنبال يك دورة سنتز Dnak بطور فعال تجزيه مي‌گردد بطوريكه باكتري فعاليت‌هاي گرماسنجي متابوليك‌اش را تجديد مي‌كند. و ۱۰ تا ۱۵ پلي پتپر بورليا شامل DRAK يك اپي توپ معمول و رايج دارند.

بيماري ؟ كه يك بي نظمي پيچيده در چند سيستم است كه توسط اسپيروكت بورليا كه بوسيلة كنه منتقل مي‌گردد ايجاد مي‌گردد. در مرحله اوليه زخمهاي پوستي و سپس در مراحل سيستمي ثانويه و مرحلة سوم نشانه‌هايي مثل myocarditis و arthritis و … مشاهده مي‌گردند.
مطالعات زياد به فاكتورهاي بورليايي خاص كه مسئول خسارت به بافت ميزبان هستند و تصور مي‌شود در ايجاد پاسخ خود ايمن به اسپيروكت نقش مهمي در واكنش بين ميزبان و پاتوژن باز مي‌كنند اشاره مي‌كند.