پلاسمين و بستن يا دلمه شدن شير
فعاليت پلاسمين و بستن يا دلمه شدن شير
چكيده مطالب:
نمونه‌هاي شير به صورت ماهانه از ۱۹ گاو Holstein و ۱۹ گاو Jersey طي ۱۰ ماه لاكتوزسازي و در گله‌هاي جداگانه گرفته شدند (در كل ۳۸۰ نمونه شير). تأثيرات ناشي از پرورش گله‌ها، تعداد لاكتوزسازي، فصل و مرحلة لاكتوزسازي و تعامل ميان اين پارامترها و پلاسمين، پلاسمينوژن و اندازه‌گيري مشخص شده و مورد بررسي قرار گرفتند. تعداد لاكتوزسازي بيشترين تأثير را بر فعاليت پلاسمين بر جاي گذاشت، فعاليتي كه در طول دورة لاكتوزسازي افزايش يافت اما تحت تأثير مسائل مربوط به پرورش گله‌ها، PH، پروتئين يا چربي قرار نداشت. مرحلة لاكتوزسازي و فصل تنها

فاكتورهايي بودند كه بر روي پلاسمينوژن تأثير گذاشتند. درصد پلاسمينوژن فعال شده در طول لاكتوزسازي‌هاي چهارم و آخر و همچنين در فصول پاييز و زمستان به بيشترين ميزان خود رسيد. فعاليت پلاسمين، پارامترهاي دلمه شدن شير را تحت تأثير قرار ند

اد. زمان دلمه شدن شير هم ‌زمان با افزايش ميزان چربي و پروتئين و كاهش ميزان PH، كاهش يافت. پروتئين و چربي افزايش يافته باعث شدند كه ميزان دلمه شدن افزايش يابد. نمونه‌هاي شير جمع‌آوري شده در فصل پاييز داراي بالاترين ميزان استحكام بودند و مرحلة لاكتوزسازي تأثيري بر ميزان استحكام و تزلزل ناپذيري شير بر جاي نگذاشت. هر چه ميزان PH كمتر مي‌شد و ميزان پروتئين و چربي افزايش مي‌يافت، از مدت زمان دلمه شدن كاسته مي‌شد. افزايش ميزان پروتئين و چربي باعث افزايش ميزان استحكام دلمه شدن شير مي‌شد. شير گرفته شده از گلة Jersey داراي دلمه‌هاي مستحكم‌تري نسبت به گلة Holstein بود. شمار لاكتوزسازي و مرحلة مربوط بدان بر روي استحكام دلمه‌ها تأثيري نداشتند.
لغات كليدي: پلاسمين، پلاسمينوژن، دلمه شدن شير، لاكتوزسازي
مخفف‌ها: A3= فاصله ميان ميزان Formagraph زمانيكه زمان مو

جود، سه برابر RCT مي‌باشد ـ A45= فاصله ميان ميزان Formagraph كه ۴۵ دقيقه بعد از افزودن پنير مايه مي‌باشد ـ K20 = زمانيكه فاصله ميان ميزان Formagraph برابر ۲۰ ميلي‌متر است ـ RCT = زمان دلمه شدن ماية پنير (از زمان افزودن مايه پنير تا فاصله ميان خط‌هاي Formagraph)
مقدمه:
پلاسمين (EC 3.4.21.7) كه يكي از آنزيم‌هاي proteolytic موجود در شير نرمال مي‌باشد، آنزيم خوني است كه داخل شير مي‌شود. فعاليت آن ناشي از توليد كازئين ـ Y و peptoneـ proteose در كازئين B مي‌باشد. مقدار پلاسمين در شير نرمال كم است و اين آنزيم اكثراً بعنوان آنزيم پلاسمينوژن موجود مي‌باشد. فعال كنندة پلاسمينوژن، آنزيم خوني است كه ميزان آن در شير گاو اندازه‌گيري شده است. اين آنزيم، ميزان فعاليت پلاسمين را خصوصاً در شير پاستوريزه افزايش مي‌دهد. عوامل بازدارندة فعال كننده‌هاي پلاسمين و پلاسمينوژن نيز از طريق خون وارد شير مي‌شوند. فعال كننده‌هاي پلاسمين و پلاسمينوژن با كازئين در ارتباط‌اند اما بازدارنده‌هاي آن‌ها را مي‌توان در سرم شيري يافت. هر چه به انتهاي مرحلة لاكتوزسازي نزديك‌تر مي‌شويم فعاليت پلاسمين طي mastitis و در شير گاوهاي پيرتر افزايش مي‌يابد. اين موضوع باعث افزايش ميزان تجزية كازئين B در اين نوع شيرها مي‌شود. بنابر پيشنهاد Richardson، فعاليت پلاسمين در اواخر مرحلة لاكتوزسازي شير افزايش مي‌يابد چون در اين مرحله، پلاسمين بيشتري از طريق خون وارد شير مي‌شود كه اين موضوع هيچ ارتباطي به افزايش فعاليت پلاسمينوژن نخواهد داشت. به گزارش politis و همكارانش، نسبت پلاسمينوژن به پلاسمين در طول مراحل اوليه لاكتوزسازي ۵۵/۶ و در اواخر اين مرحله ۲۹/۳ خواهد بود كه اين موضوع بيانگر آنست كه فعاليت پلاسمينوژن در اواخر مرحلة لاكتوزسازي افزايش مي‌يابد. بنابر گزارش Richardson، پلاسمين در شير گاوهاي Friesianـ Holstein نسبت به گاوهاي Jersey داراي فعاليت بيشتري مي‌باشد. بنابر مشاهدات Schaar، چنين گرايشي در شير گله‌هاي Swedish Friesian و Jersey نيز

به چشم مي‌خورد اما فعاليت پلاسمين در محتواي كازئين هيچ تفاوتي ايجاد نمي‌كند. كازئين در اندازه‌گيري ميزان فعاليت پلاسمين تداخل ايجاد مي‌كند كه اين موضوع بدليل وجود زير لايه‌هاي سينتتيك مي‌باشد. شير در مراحل پاياني لاكتوزسازي كمتر دلمه مي‌شود (افزايش زمان دلمه شدن و كاهش استحكام دلمه شدن). سطح peptone ـ proteo

se، كازئين و ديگر محصولات شكسته شدة كازئين زمانيكه كازئين αs و β در چنين شيري تجزيه مي‌شود افزايش مي‌يابد. فعاليت پلاسمين ممكن است استحكام شير دلمه شده را در مراحل پاياني لاكتوزسازي تحت تأثير قرار دهد چون استحكام دلمة شير بستگي دارد به غلظت كازئين β. Pearse و همكارانش، شير مصنوعي Micelle را به همراه پلاسمين در شرايط مساعد قرار دادند پلاسمين پُرسين باعث شد تا ۵۰ درصد از كازئين β در ۳ ساعت تجزيه شود اما در طول اين مدت، دلمه‌ها هنوز به شكل اولية خود بودند. بعد از ۸ ساعت فرآيند دلمه شدن رخ داد اما دلمة شكننده‌اي شكل گرفت. شير مصنوعي Micelle به مدت بيش از ۸ ساعت به همراه پلاسمين در شرايط مساعد قرار داده شد اما دلمه نَبَست. در مقايسه با اين موضوع، Grufferty و Fox به اين نتيجه رسيدند كه زمان دلمه بستن ماية پنير در تجزية كازئين Micelle، قبل و بعد از قرار گرفتن آن به مدت ۷۲ ساعت در دماي°c37 تغييري نخواهد كرد.
(بدون افزودن پلاسمين). آن‌ها مشاهده كردند كه ميزان RCT (زمان و دفعات دلمه بستن ماية پنير) بعد از ۹۶ ساعت دو برابر مي‌شود. Mcmahon و Brown فاكتورهاي تأثيرگذار بر مدت زمان دلمه بستن شير را مورد بازبيني قرار دادند. اين فاكتورها عبارتند از: سطح PH، دما، فعاليت يون كلسيم و نوع آنزيم بكار رفته. غلظت كازئين تأثير چنداني بر مدت زمان دلمه بستن شير ندارد زيرا اين زمان در شير تغليظ شده به ميزان ۲ تا ۴ برابر با تصفية بيش از حد تغييري نمي‌كند. محتواي كازئين هر چه بيشتر باشد ميزان استحكام و تغيير ناپذيري دلمه‌ها نيز افزايش مي‌يابد. وجود پلاسمين از غلظت كازئين تماسي مي‌كاهد كه احتمالاً اين موضوع استحكام دلمه‌ها را بيشتر از مدت زمان و دلمگي شير تحت تأثير قرار مي‌دهد. Pearse و همكارانش و همچنين Grufferty و Foxميزان استحكام دلمه شدن را ارزيابي نكردند. به گزارش
Okigbo، شير گرفته شده از برخي از گاوها سريع‌تر مي‌بندد اما ويژگي‌هاي مربوط به استحكام دلمه‌ها را كمتر دارد. هم‌زمان با افزايش ميزان PH شير به ۳/

۶، مدت زمان دلمه بستن شير كاهش يافت اما استحكام دلمه‌ها كمي بيشتر شد. استحكام و تغييرناپذيري دلمه‌ها حتي زماني‌كه شير دلمة مناسبي هم به شير موجود افزوده شد افزايش نيافت. هدف از اين تحقيق تأثيرات ناشي از پرورش گله‌ها، تعداد لاكتوزسازي، فصل و مرحلة لاكتوزسازي و تعامل ميان اين پارامترها و پلاسمين، پلاسمينوژن و ارزيابي دلمگي شير مي‌باشد.
مواد و روش‌ها:

نمونه‌گيري: نمونة شير مورد نياز از ۲۱ گاو Jersey (UT، Farmington، لبنيات RichardS) و ۲۱ گاو Holstein (لبنيات برادران perkes، park Hyde، UT) گرفته شد. نمونه‌ها يكبار در ماه و در طول اولين، سومين و چهارمين و آخرين مرحلة لاكتوزسازي با استفاده از پروسه‌هاي نمونه‌گيري DHIA از گاوها گرفته مي‌شدند. سپس دماي نمونه‌ها فوراً تا °c4 پايين آورده مي‌شد و تا زمان انتقال به آزمايشگاه در آن دما نگهداري مي‌شدند. به منظور جلوگيري از بروز اثرات ناشي از لاكتوزسازي و تغيير فصول، گروه‌هايي از ۲ تا ۳ گاو هر ماه و از فورية سال ۱۹۸۸ تا اكتبر همان سال تجديد نيرو شدند. مسئله مربوط به پرورش گله تعجب انگيزند. اولين گروه از گاوها در نوامبر ۱۹۸۸ لاكتوز سازي mo10 را به پايان رساندند و گروه آخر در جولاي ۱۹۸۹ اين مرحله را تمام كردند. دو گاو از هر گله لاكتوزسازي mo10 را بدليل مرگ و مير نتوانستند به پايان برسانند و از اين رو ۱۹ گاو Holstein و ۱۹ گاو Jersey باقي ماند. در اين آزمايش، مجموعه‌اي از ۳۸۰ نمونه مورد تجزيه و تحليل قرار گرفتند.
آناليز شيميايي:
پروتئين و چربي با اشعة مادون قرمز تجزيه شدند. سلول‌هاي Somatic با استفاده از كانتر سلول Fossmatic مشخص شدند. فعاليت پلاسمين به روش schaar و Funke و با استفاده از نيتروآنيليد ـ P ـ ليسليل ـ L ـ ليئوسيل ـ L ـ واليل ـ D ـ H مشخص شد. شير به نسبت ۳ به ۱ به همراه سيترات سديم m4/0 و بعد از اين كه به مدت ۱۵ دقيقه در دستگاه گريز از مركز در g ×۰۰۰/۲۵ قرار گرفت رقيق مي‌شود. m85 از supernatant با m525 از assay buffer (mm50 Tris، mm110 نمك طعام، mm3 اسيد كاپروييك ـ n ـ آمينو ـ ۴ به همراه HCL به۴/۷ PH = رسانيده مي‌شوند) وml 150 از محلول بنيادين mg/ml5 رقيق مي‌شود. حجم كلي براي تمامي مخلوط‌هاي assay به ميزان ml850 مي‌باشد. پلاسمين به همراه پلاسمينوژن يا فعاليت كلي با افزودن ۰۱/۰ سيگما واحد يوروكيناس بهType equation here. مخلوط‌هاي واكنش بدست مي‌آيد. درصد پلاسمين را مي‌توان از طريق معادلة زير بدست آورد: فعاليت (كه به ازاي قدرت جذب در هر دقيقه تغييري مي‌كند) در سطح nm405 و از طريق سلول يك سانتي‌متري در۴/۷ PH =و در دماي °C37 اندازه‌گيري مي‌شود. پارامترهاي دلمه شدن با استفاده از Formagraph تخمين زده مي‌شوند. Rennin به نسبت ۱ به ۱۰۰ با استفاده از آب مقطر رقيق شد و ml200 به ml 10 از شيري اضافه شد كه به مدت حداقل ۳۰ دقيقه در دماي °C35 نگهداري شده بود. نمونة ‌PH اندازه‌گيري شد و محصول بدست آمده از شير هر ماه ثبت مي‌شد.
آناليز آماري:
به كمك آناليز حداقل مربع‌هاي Covariance، تأثيرات ناشي از پرورش گلة گاوها، شمار لاكتوزسازي، فصل و مرحلة لاكتوزسازي در پلاسمين، پلاسمينوژن، آنزيم كلي (پلاسمين به همراه پلاسمينوژن)، درصد پلاسمين و پارامترهاي دلمه شدن شير تخمين زده شدند. تمامي تعاملات دو طرفه در اين مدل گنجانده شدند البته بجز مرحلة لاكتوزسازي x فصل كه سلول‌هاي از دست رفته يا جا افتاده داشت. محصول شير، PH، SCC، پروتئين و چربي بعنوان Covariate به مدل‌هاي مناسب افزوده شدند. مقدار SCC با گرفتن لگاريتم ۱۰۰۰/ SCC بدست مي‌آيد. Covariateهايي كه مقدارشان قابل توجه نيست به صورت مرحله به مرحله از مدل در دست جدا مي‌شوند. تنها mo10 لاكتوز براي هر گاو در مدل موجود مورد استفاده قرار مي‌گيرد تا توازن ايجاد شود. گاو بعنوان يك متغير مورد توجه قرار گرفت (گاو گلهx تعامل سن) و به منظور بررسي سن، پرورش گله و سن x پرورش گله بعنوان واژه‌اي خطا مورد استفاده قرار گرفت. فصول مورد نظر عبار

ت بودند از بهار (مارس و آپريل و مِي)، تابستان (ژوئن و جولاي و آگوست)، پاييز (سپتامبر، اكتبر و نوامبر) و زمستان (دسامبر، ژانويه و فوريه).
تعداد lacfation داراي سه گروه مي‌باشند. مرحلة لاكتوزسازي داراي ۱۰ گروه مي‌باشد به ازاي هر ماه. مدل‌هاي خطي كلي SAS مورد استفاده قرار مي‌

گيرند. مدل آماري عبارتست از: Yijkl
كه در اين فرمول داريم:
M: ميانگين كلي
αi: پرورش گله i
βj: تعداد lacfation
YK: مرحلة lacfation
1 δ: فصل I
: گاو m نگهداري شده در گله x تعداد lacfation
‌αBij: پرورش گله x تعداد lacfation
αyik: پرورش گله x مرحلة lacfation
αδ: پرورش گله xفصل
βyjk: تعداد lacfation x مرحلة lacfation
βδji: تعداد lacfation x فصل
b1x1: Covariate براي محصول شير
b2x2: Covariate به ازاي هر In (1000/ SCC)
b3x3: Covariate براي PH
b4x4: Covariate براي پروتئين و
b5x5: Covariate براي چربي
نتيجه‌گيري و مباحثه:
فعاليت پلاسمين:
فعاليت متوسط پلاسمين برابر۳-۱۰× ۵۳/۱ به واحد جذب بر دقيقه در ۳/۱۳ برابر شير رقيق شده‌اي كه چربي‌اش را گرفته‌اند مي‌باشد. اين موضوع مطابق با گفته‌هاي Rollema و همكارانش مي‌باشد، كسي كه دريافت فعاليت پلاسمين ميان ‍۳-۱۰× ۴۰/۰ و ۳-۱۰× ۶/۲ در ۱۰ برابر شير رقيق شده‌اي كه خامه‌اش را گرفته‌اند متغيير است. سلول Somatic و محصول شير هر دو جزء Covariate ‌هاي قابل توجهي هستند. ضريب تناظر سلول Somatic و پلاسمين معادل ۴۲/۰ مي‌باشد. به گزارش Politis و همكارانش، ۶۲/۰= r با توزيع نرمال SCC

همراه مي‌باشد. سلول Somatic در اين تحقيق مقدار پاييني دارد؛ ۹۰ درصد از اين نمونه‌ها كمتر از ۰۰۰/۳۰۰ سلول/ml گنجايش دارند. ميان پلاسمين و SCC در دامنة ۰۰۰/۱۰۰ تا ۰۰۰/۳۰۰ سلول Somatic رابطه‌اي خطي وجود ندارد. محصول شير با فعاليت پلاسمين رابطه‌اي منفي دارد و حداقل ميانگين مربع فعاليت پلاسمين متناظر است با محصول شيري بدست آمده. پروتئين، چربي و PH در فعاليت پلاسمين تغييري ايجاد نمي‌كنند. ضريب تناظر ميان ‌PH و فعاليت پلاسمين برابر است با ۲۲/۰= r.
پرورش گله بر روي فعاليت پلاسمين تأثيري بر جاي نگذاشت. عواملي

چون فصل، تعداد lacfation و مرحلة lacfation فعاليت پلاسمين را تحت تأثير قرار دادند. Politis و همكارانش نيز به اين نتيجه رسيدند كه تعداد lacfation و مرحلة lacfation قابل ملاحظه‌تر از عامل فصل مي‌باشد. در شكل ۱، حداقل ميانگين مربع فعاليت پلاسمين در سه گروه سني و در طول سه دوره نشان داده شده است. فعاليت پلاسمين در شير گاو سوم، چهارم و آخر افزايش يافت اما در شير گاوهاي اول بدون تغيير باقي ماند. شير گرفته شد

ه از گاوهاي مسن‌تر بالاترين ميزان فعاليت را دارا مي‌باشند. Schoar و Funke نيز نشان دادند كه فعاليت پلاسمين هم‌زمان با تعداد و مرحلة lacfation افزايش مي‌يابد. چون فعاليت پلاسمين بعد از mastitis به سطح قبل از آلودگي باز نمي‌گردد از اين‌رو احتمالاً گاوهاي مسن‌تر كه در طول عمر خود mastitis بيشتري را تجربه كرده‌اند فعاليت پلاسمين بيشتري نسبت به گاوهاي جوان‌تر دارند. تأثيرات فصلي بر جاي مانده بر فعاليت پلاسمين در شكل ۲ ن

شان داده شده است. فعاليت پلاسمين موجود در شير گاوهاي lacfation سوم به بعد در تابستان و پاييز بالاتر است از بهار و زمستان اما فعاليت شير گاوهاي چهارم و جديدتر در بهار پايين‌تر است. بنابر مشاهدات Richardson، در نيوزلند فعاليت پلاسمين موجود در شير پاستوريزه طي دورة lacfation افزايش مي‌يابد. در اين تحقيق، فعاليت پلاسمين

در طول ماه‌هاي آگوست تا دسامبر افزايش يكنواختي دارد و در طول ماه‌هاي ژانويه تا آپريل كه همان تابستان و پاييز نيوزلند است تثبيت مي‌شود. تأثيرات فصلي مذكور در برخي از گزارشات اين تحقيق با يكديگر متفاوت است شايد بدين دليل كه تأثيرات فصلي و لاكتوزي نتايج حاصل از ديگر تحقيقات را نقش بر آب مي‌كند. زمانيكه تمامي گاوها به طور همزمان مورد آزمايش قرار مي‌گيرند نمي‌توان تأثيرات فصلي و لاكتوزي را از يكديگر متمايز ساخت. در برخي از تحقيقات، جزئيات نمونه‌گيري براي تشخيص اين رويداد ناكافي مي‌باشند.
پلاسمينوژن:
ميانگين كلي فعاليت پلاسمينوژن ‍۳-۱۰× ۲۴/۸ مي‌باشد كه اين مقدار متناسب است با مقادير‍۳-۱۰× ۸/۴ تا ‍۳-۱۰× ۶/۱۶ گزارش شده توسط Rollema و همكارانش. ميانگين فعاليت پلاسمينوژن (كه بعد از افزودن urokinase مشخص شد)،۴/۵ برابر فعاليت پلاسمين مي‌باشد به همراه دامنة گزارش شده توسط Richardson و Pearce كه ۷/۲ تا ۳/۷ برابر فعاليت پلاسمين مي‌باشد. پلاسمينوژن متناظر با SCC نمي‌باشد. Politis و همكارانش به اين نتيجه رسيدند كه تناظر و رابطة قوي ميان SCC و پلاسمينوژن وجود دارد. اين اختلاف را مي‌توان با توزيع نامتناسب SCC در اين تحقيق توضيح داد. محصول شير، پلاسمينوژن را بيش از پلاسمين تحت تأثير قرار مي‌دهد و ميانگين مربع پلاسمينوژن با محصول شير در تناظر است. پروتئين، چربي و PH، پلاسمينوژن را تحت تأثير قرار ندادند. پرورش گله، تعداد lacfation و پرورش گله x

تعدادlacfation ميزان پلاسمينوژن شير را تحت تأثير قرار نداد. پلاسمينوژن در طول ۵ مرحلة اول lacfation افزايش چشم‌گيري داشت و سپس به سده كرده بودند. عامل فصل تنها عامل تأثير‌گذار بر محتواي پلاسمينوژن مي‌باشد. بيشترين مقدار پلاسمينوژن در فصول پاييز و زمستان رخ مي‌دهد.
كل (پلاسمين و پلاسمينوژن):
از ميان فاكتورهاي آناليز شده، مرحلة lacfation

بيشترين تأثير را بر روي فعاليت كلي بر جاي گذاشت. مسيرهاي موجود در فعاليت كلي مشابه مسيرهاي پلاسمينوژن مي‌باشند (شكل ۳) ميزان فعاليت كلي در پاييز و زمستان بيشتر از بهار و تابستان افزايش دارد (جدول ۱).