چکیده

محیط کشتهاي انتخابی و غنی همیشه نمیتوانند تمام شرایط رشد مورد نیاز میکروبها را تأمین کنند به علاوه بسیاري از میکروارگانیسمها در مرحله فیزیولوژیک غیر فعال به سر میبرند و قادر به رشد بر روي محیطهاي کشت ساخته شده نیستند. تحت شرایط بسیار مطلوب، تنها %۱ میکروبهاي حاضر در یک نمونه را میتوان کشت داد.

تکنیکهاي مولکولی ابزارهاي جدیدي را معرفی میکنند که از آنها میتوان براي آنالیز ساختار و تنوع جمعیتهاي میکروبی استفاده کرد. یکی از روشهاي مولکولی نوین در بررسیهاي مولکولی میکروبی، ژل الکتروفورز با شیب ماده واسرشت کننده (DGGE) میباشد. درواقع DGGE یک شیوهي انگشت نگاري مولکولی بر پایه استفاده از ماده ژنتیکی است که امکان مطالعه میکروبی بدون نیاز به کشت را فراهم میکند. این تحقیق مروري بر کاربردهاي متعدد این تکنیک در حوزههاي مختلف علم میکروبیولوژي میباشد.

کلمات کلیدي

DGGE، ژل الکتروفورز با شیب ماده واسرشت کننده

-۱ مقدمه

مطالعات سنتی بر پایه تکنیکهاي کشت توانایی لازم در شناسایی و کمیـت سنجی تمام جمعیت هاي میکروبی را ندارد .[۷, ۳۶] در یک سیستم طبیعی، به طور کلی فقط ۱-۱۰٪ از میکرواورگانیسم هاي موجود میتوانند کشت داده شوند .[۳۰]

در سالهاي اخیر بسیاري از روشهاي زیست شناسی مولکولی براي شناسایی و مطاله میکروارگانیسمها استفاده شدهاند. این روشها، اجازه مطالعه میکروارگانیسمها را از طریق بررسی مولکولهاي DNA، RNA و یا پروتئین بدون نیاز به کشت فراهم میکنند .[۳۳]

یکی از روشهاي مولکولی بر پایه DNA که جهت بررسی تنوع زیستی در اجتماعات میکروبی استفاده میشود، DGGE میباشد.

PCR-DGGE شامل سه مرحله است: (۱ استخراج DNA از نمونه

(۲ تکثیر کنترل شده DNA با استفاده از الیگونوکلئوتیدهاي پرایمر ویژه (۳ جدا سازي انواع توالی DNA با استفاده از DGGE

در این روش DNAي استخراج شده از مخلوط جمعیت میکروبی بوسیله پرایمرهاي مخصوص قارچی یا باکتریایی به کمک PCR تکثیر می-شود. محصولات بدست آمده از PCR که از نظر تعداد باز، اندازه مساوي دارند

æ در الکتروفورز با ژل آگارز معمولی که جداسازي بر اساس اندازه است، قابل تفکیک نیستند [۳۵]، در تکنیک DGGE با استفاده از یک محیط واسرشتکننده که ترکیبی از یک دماي یکسان بین ۵۰ تا ۶۰ درجه سانتیگراد

æ یک شیب خطی واسرشت کننده متشکل از اوره و فرم آمید است، از یکدیگر تفکیک میشوند. شیب محلول واسرشت کننده میتواند قائم یا موازي با جهت الکتروفورز باشد. در ژل قائم، شیب ماده واسرشت کننده بر جهت الکتریسیته

عمود است و معمولاً طیف وسیعی از شیب ماده واسرشت کننده مورد استفاده قرار میگیرد: مثلاً %۰-۱۰۰ یا .%۲۰-۷۰ در DGGE موازي، شیب واسرشتکننده با مسیر الکتریسیته موازي است و طیف ماده واسرشت کننده باریک است، به این جهت که شرایط براي بهتر واسرشت شدن قطعات فراهم شود.

ایــن تکنیــک در زمینــههــاي مختلــف علــم میکروبیولــوژي ماننــد میکروبیولوژي پزشـکی، میکروبیولـوژي غـذایی، میکروبیولـوژي محیطـی و میکروبیولوژي صنعتی به کار رفته است .[۳۴]

-۲ بررسی تنوع باکتریایی آبها:

کیفیت میکروبی آب آشامیدنی مهم است زیرا ممکن است پس از انجام تصفیه برخی باکتريها در آب باقی مانده و دوباره تولید مثل کنند. ۱٪ از باکتريهاي آب با تکنیکهاي کشت قابل ردیابی هستند .[۳۱] جهت اسـتخراج DNA، آب از فیلترهاي ۰/۲۲ میکرومتري از جنس نیتروسلولزي عبور داده میشود و سپس DNA توسط روشهاي متداول (فنـل- کلروفـرم، set buffer و …) استخراج میگردد .[۶]

بعد از مرحله استخراج DNA ، جذب و میزان خلـوص DNA تعیـین میشود. تکثیر ژن ۱۶S rDNA بـا روش PCR انجـام گرفتـه و محصـول PCR توسط تکنیک DGGE آنالیز میشود. بعد از DGGE بانـدهاي هـر منطقه از نمونهبرداري جدا میگردد و تعیین تـوالی مـیشـود. رسـم درخـت فیلوژنیک از باکتريهاي آب نشان داده است که برخی از این باکتريهاي جدا شده براي انسان مضر میباشند.

همچنین تکنیک DGGE در بررسی تجزیه منابع زیرزمینـی آبهـاي آلوده استفاده شده است. تکنیکهاي ملکولی در بررسـی رسـوبات منـابع آب آلوده به اورانیوم و نیترات مورد استفاده قرار گرفته است. با تزریق دهندههاي الکترون افزایشی در جمعیت باکتري هاي احیا کننده آهن، نقش این باکتريها در احیا کردن آلودگیها بررسی شد. ایـن نتـایج بـه همـراه کلـون کـردن و اطلاعات توالیها اهمیت اعضاء گاما پروتوباکتريها را به عنوان احیا کنندهها در رسوبات سطوح اسیدي مشخص کرد.