چکیده

مقدمه: پاسخ مرفین و نقش عوامل مختلف به ویژه نیتریک اکساید(NO)بر بیان آن در مهره داران مطالعه شده است، اما شواهد کافی براي ایـن مسـاله در بـی مهرگـانپست وجود ندارد. در این پژوهش نقش NO در بیان قدرت مرفین در Paramecium caudatum براي اولین بار مورد مطالعه قرار گرفت.
روش ها: نمونه حیوانی پس از جداسازي از محیط طبیعی و تائید گونه در آزمایشـگاه پـرورش داده شـد . یـک میلـی لیتـر از محـیط کشـت خـالص بـه لام سـلول شـمارSedgwick-Rafter اضافه و دارو در حجم یک μl تلقیح شد. اثر تلقیح مرفین (۱-۶۰μg/μl) طی فواصل زمانی (۰ -۱۸۰ sec) گزارش گردید. ال- آرژینین (۱-۸μg/μl)، پیش ساز NO، قبل از مرفین (۲μg/μl) تلقیح و آنزیم مولد NO با پیش تجویز L-NAME مهار شد. همچنین بـراي نشـان دادن دخالـت گیرنـده هـاي اپیوئیـدي در اثـرات سیگنالینگ مرفین از Naloxone استفاده شد. فعالیت سیستم NO با NADPH-diaphorase مورد بررسی قرار گرفت. در نمونه هاي شاهد آب مقطر اضافه شد.

یافته ها: سلول هايP. caudatumتحت تاثیر مرفین مجتمع شدند و بیشترین حالت تجمع نیز تحت دوز نسبتاً پائین مرفین(۲μg/μl)مشاهده شد. ال- آرژینـین اثـرمثبت بر این فرایند داشت (p<0.001) در حالیکه پیش تجویز L-NAME این اثرات را متوقف کرد. Naloxone نیز تاثیر مهاري نشان داد. تغییر فعالیت آنزیم نیتریـک اکسـاید سینتاز (Nitric Oxide Synthase) با NADPH-diaphorase در P. caudatum نشان داده شد.

نتیجه گیري: یکی از اثرات داروئی مرفین در مدل حیوانی تک یاخته اي بروز تجمع سلولی است و نتایج فوق نشان مـی دهـ د کـه سیسـتمNOبـا سیسـتم اپیوئیـدي درP. caudatum در این راستا تداخل دارد. از طرف دیگر با توجه به پاسخ تقویتی ال-آرژینین بر دوز موثر مرفین، این یافته می تواند در راستاي کـاهش اثـرات جـانبی مـرفین (در بیماران تحت درمان با مرفین) و مسائل مربوط به اقتصاد دارویی ارزشمند باشد.

واژههاي کلیدي: P. caudatum، قدرت مرفین، نیتریک اکساید

مقدمه

نیتریک اکساید (Nitric Oxide) مولکول کوچک و گازي شکل است که در انجام بسیاري از فرایندها مشارکت می کنـد. اهمیت این عامل در القاي اثرات مرفین در مدل هـاي حیـوانی نشان داده شده است .[۱۲] مسئول بیوسنتز ایـن عامـل آنـزیم

* نویسندة مسئول مکاتبات: karami@shahed.ac.ir
وبگاه مجله: www.phypha.ir/ppj

نیتریک اکساید سینتاز (Nitric Oxid Synthase) است اولین بار در ماکروفاژها و سلول هاي اندوتلیال پستانداران شـرح داده

شـد و امـروزه لااقـل ســه ایزوفـرم اصـلی

NOS3) از آن در پستانداران معرفی شده است .[۳,۱۷] امـا در رابطه با این مولکول سیگنال و نقش آن در بروز اثرات داروئـی مرفین در جانوران بی مهره شـواهد کـافی در دسـت نیسـت. از جمله معدود شواهد موجود می توان به تـأثیر مـرفین در تولیـد NO درAscarissuum (نوعی نماتد) اشـاره کـرد [۲۵] و نیـز مطالعــاتی بــراي معرفــی رونــد انتقــال ســیگنال مــرفین و

۳۱۹ ۳۱۹

-β اندورفین در تعدادي حیـوان تـک یاختـه اي مـژه دار ماننـد آبگیرهاي کم عمق و آبگاه ها جمـع آوري و بـا کشـت طبیعـی
Paramecium,Stentor و Tetrahymena انجــام گرفتــه (خیسانده یونجه) در آزمایشگاه نگه داري و تائید گونـه اي شـد
است که برهمکنش این مواد را با رسپتورهاي اپیوئیـدي و –G .[10,11]
پروتئین ها در سطح این مـدل هـاي سـلولی نشـان مـی دهـد به منظور کشت و پرورش حیوان در آزمایشگاه ابتدا مقداري
.[۱۵,۱۶] اما از آنجا کـه شـناخت مولکـول هـاي هـدف مـواد یونجه خشک ۵) گرم) را در ۵۰۰ میلـی لیتـر آب بـه مـدت ۱۰
اپیوئیدي مانند مرفین در سطح سلولی داراي کاربردهاي بسـیار دقیقه جوشانده و مخلوط را پس ازخنک شـدن در شیشـه درب
مهم فارماکولوژیک است که به گستردگی عملی استفاده داروئی دار در دماي ۴ °C (به عنوان محیط غذایی پایـه) نگـه داشـت .
این مواد در حیوانات و انسان مـی انجامـد هرگونـه مطالعـه در براي تهیه محیط کشت طبیعـی بـه ازاي هـر ۲۰۰ ml آب ۲۰
ســطح ســلولی و مولکــولی باعــث روشــن تــر شــدن جریانــات میلی لیتر از محیط مغذي یونجه اضافه شد، سپس تـک یاختـه
بیوشیمیایی مداخله کننده در بیان تاثیرات داروئـی ایـن مـواد و مورد نظر با کمک پیپت به این محیط تلقیح گردیـد. در نهایـت
صرفه بهداشتی-اقتصادي خواهد شد. با گسـتردگی عمـل NO هر ۷۲ ساعت یک بار، پاساژ کشـت تـک یاختـه مـورد نظـر از
در سلسله جانوري، دور از انتظار نخواهد بود اگر عامل مذکور در محیط قبلی به محیط تازه انجام گرفت و این عمل تا آنجـا کـه
تک یاختگان نیز عملکرد مؤثر و مشـابه بـا آنچـه در حیوانـات کشتنسبتاً خالصی از تک یاخته مورد نظر تهیـه شـود، تکـرا ر
عــالی تــر و حتــی انســان گــزارش گردیــده اســت در تمــامی گردید. سرانجام فرایند کشت دادن درمحیط مصنوعی بـه اجـرا
فرآیندهاي حیاتی از جمله اثرات داروئی مرفین داشته باشد، زیرا درآمد .[۱۱]
در P. caudatum بیوملکول هاي هـدف NO ماننـد گوانیلیـل براي تهیه محیط کشت مصنوعی ۲ g پودر مخمـر در یـک
سیکلاز [۱۳]، کانال پتاسیم و کانال کلسیمی دریچه دار وابسته لیتر آب مقطر حل و حاصل پس از اتوکلاو در دماي ۴ °C نگه
به ولتاژ [۹,۱۹,۲۰,۲۲]، کالمودولین [۴] (یکی از پروتئین هـاي داري شد. به منظور تهیه محیط کشت حاوي تک یاختـه مـورد
لازم بــراي فعالیــت آنــزیم (NOS و یــک پــروتئین بــا وزن نظر، به ازاي هـر ۶۰ ml از ایـن محـیط کـه در پتـري دیـش
[۱۴]۱۵۵kDa که بسیار شبیه به آنزیم NOS1 پستانداران مـی استریل اضافه میشد، تعدادي میکروارگانیسم از محـیط کشـت
باشد به دست آمده است. قدرت دارویی((Drug Potency مواد طبیعی به کمک پیپت به این محیط تلقیح شـد. در نهایـت هـر
مخدر مانند مرفین یکی از مشخصه هاي بارز فارماکودینامیـک ۷۲ ساعت یک بار، پاساژ کشت از محیط قبلی به محـیط تـازه،
براي معرفی پاسخ موجود زنده به ایـن مـواد اسـت [۱۰,۲۱] در انجام شد و این عمل تا زمـانی کـه مطالعـات رفتـاري و سـیتو
حالیکه ساز و کارهاي سیتو شـیمیایی ایـن جریـان بـه وضـوح شیمیایی به پایان برسد، ادامه پیدا کرد.
تبیین نشده است تنها به دخالت بعضـی مولکـول هـا از جملـه pH بهینـــه بـــراي رشـــد ســـلول هـــاي P.caudatum
NO در این روند استناد شده است همچنانکه پاسخ ضـد دردي درمحدوده۶/۸±۰/۲ میباشد. براي تنظیم pH دراین محـدوده
مواد اپیوئیدي (به ویژه مرفین) و نیز جریانات یادگیري و حافظه از محلولهاي استیک اسید و سود ۰/۱ نرمال استفاده شد .[۱۱]
را در مهــره داران بــه سیســتم نتتریــک ارژیــک نیــز منتســب همچنین دماي بهینه براي رشد سلول هـاي P.caudatum
مــی داننــد .[۵,۱۲,۱۸,۲۴] بنــابراین مطالعــه پاســخ مــرفین در در محدوده ۳۲±۲ درجه سانتیگراد میباشد [۱۴]، جهت تنظـیم
بی مهرگان، به ویژه مدل هاي حیـوانی تـک یاختـه اي ماننـد دما، محیط کشت حاوي P.caudatum در شـرایط آزمایشـگاه
Paramecium caudatum می تواند بـه شـناخت پایـه هـاي تحت دماي ۳۲±۲ درجه سانتیگراد نگـه داري شـد و مطالعـات
زیستی اثرات مواد مخدر و در راس آن ها مرفین بیانجامد. رفتاري در همین محدوده دمایی به انجام رسید.
موادوروشها مــواد مــورد اســتفاده عبارتنــد از: Morphine sulphate
(خریــداري شــده ازشــرکت تمــاد بــا مجــوز رســمی از وزارت
بهداشـــت)، L-arginine (از شـــرکت(Sigma-USA،-NG
P.caudatum از ایستگاههاي آب شیرین موقـت، ازجملـه nitro-L-Arginine methyl ester) L-NAME از شرکت

۰۲۳ ۳۲۰

تاثیر NO بر قدرت مرفین در Paramecium caudatum

(Biochemical Research Inc.,-USA و Naloxonehydrocloride (از شرکت تولید دارو).

براي تلقیح دارو به محیط کشت نمونه تک یاختهاي و تهیه دوزهاي مشخصی از داروها، این مواد با ترازوي دقیق تـوزین و در آب مقطر به صورت محلـول تهیـه گردیـده و در نهایـت در حجم یک میکرولیتر توسط سرنگ همیلتون تلقیح شد. قبـل از هر بار تلقیح داروئی، ابتدا ۱ میلی لیتر از محـیط کشـت حـاوي سلول هاي P.caudatum به درون لام استاندارد و مخصـوص شـمارش سـدویک-رافتـر (Sedgwick-Rafter CountingChamber) انتقــال داده شــد، طوریکــه تــراکم ســلولهــاي P.caudatum در درون لام برابـــر بـــا ۲۵۰paramecia/ml

۲۶۰۰± و دماي محیط در زمان مطالعات رفتاري ۳۲±۲ درجـه سانتیگراد و pH=6/8±۰/۲باشد .[۱۴] قبل از تلقیح ابتدا یک دقیقه فرصت داده شد تا سلول هاي P.caudatum بـا مکـان جدید (لام سدویک) سازگار شوند. سـپس مـواد فـوقالـذکر در نقطه مشخصی از لام سدویک (که در زیـر لنـز ۴ (تحـت (۴X میکروسکوپ نوري تنظیم شده بود) تلقیح و رفتار سـلول هـاي P.caudatum در نقطه تلقـیح از طریـق لنـز ۴ میکروسـکوپ نوري (۴X) مشاهده و بررسی گردید.

به منظور بررسی رفتار جانور تـک یاختـه اي پـس از تلقـیح رفتــار ایــن حیــوان از طریــق شــمارش تعــداد ســلول هــاي P.caudatum در نقطه تلقـیح̋درون̋ لام̋اسـتاندارد̋̋سـدویک-̋رافتــر طــی فواصــل زمــانی ۰، ۵ ، ۱۵، ۳۰، ۶۰ ، ۱۲۰ و ۱۸۰ ازطریق میدان دید لنز ۴ (تحت (۴X میکروسکوپ نـوري مورد مطالعه قرار گرفت و محاسبات مربوطه ثبت گردیـد، لازم به ذکر است که تزریق هر دوز مشخص از دارو یـا مـواد مـورد

نظر حداقل ۵ بار تکرار شد.

در کنار مطالعات رفتاري و جمـع آوري و تجزیـه و تحلیـل دادههــا مطالعــات ســیتو شــیمیایی بــا روش سیتوشــیمیایی [۱,۲۳] NADPH-diaphorase براي بررسی تداخل سیسـتم NO با مرفین، انجام شد:

به منظور اجراي مراحل تکنیـک NADPH-diaphorase هر نمونه (Sample) از سلول هاي P.caudatum را کهقـبلاً تحت تلقیح دوزهاي مشخصی از مواد قرار گرفته بودند، بر روي سطح لام هاي تمیـزي منتقـل، دقـایقی در هـواي آزمایشـگاه خشک و فیکس گردید و سپس بر روي لامهاي فـیکس شـده،

عملیات زیر، مرحله به مرحله و بلافاصله به اجرا در آمد.

-۱ آبدهی: با شستشو در درجات نزولـی الکـل از ۹۶° تـا ۵۰° هریک به مدت ۳ ثانیه و سپس شستشو در آب بـه مـدت

۱ ثانیه.

-۲ رنگ آمیزي اختصاصی: براي رنگ آمیـزي اختصاصـی

سیتوشیمیایی NADPH-d بر روي هر نمونه لام فیکس شـده

به نسبت مساوي از محلول هايNADPH 1mg/ml) در بافر
فســـفات)، و ۰٫۲ mg/ml از N.B.T (Nitro Blue

Tetrazolium) در بافر فسفات اضافه شـد (بـافر فسـفات بـه عنوان حلال تحت pH= 7 استفاده شد). به ایـن ترکیـب چنـد قطره Triton-x-100 (به عنوان Detergent مواد و رنگ هاي اضافی) که به کمک بافر رقیق شده بود ( ( %۳ اضافه گردید، و هر لام به مدت چند ثانیه تکان داده شد تا براي مراحـل بعـدي آماده شود.

-۳ انکوباسیون تحت دمـاي :۴۰°C هـر یـک از لام هـاي فیکس شده که با روش فوق تحـت رنـگ آمیـزي اختصاصـی سیتوشـیمیایی NADPH-d واقـع شــد، در بنمـاري ۴۰°C بــه مدت ۳۰ دقیقه نگه داري گردید. سپس نمونه از بنماري خـارج شدهجهت، شستشوي رنگ، نمونه از آب مقطر سریعاً عبور داده و براي مرحله بعد آماده شد

-۴ آب گیري با درجات افزایشی الکل از ۵۰° تا ۹۶° هـر یک به مدت ۳ ثانیه.

-۵ شفاف سازي با دو تعویض گزیلل هریک بـه مـدت ۱۵ ثانیه.

-۶ چسباندن :(Mounting) در نهایـت هـر نمونـه لام بـه کمــک چســب انــتلان (Entellan) خریــداري شــده ازشــرکت Merck چسبانده شد.
تجزیــه و تحلیــل آمــاري اولیــه بــا اســتفاده از آزمــون

( Kolmogrov Smirnov) K.S. مشخص کـرد کـه دادههـا داراي توزیع نرمال هستند. سپس با اسـتفاده از آنـالیز واریـانس (ANOVA) یک طرفه در محـیط نـرم افـزار آمـاري SPSS، معنی دار بودن اختلافات گروه هاي تحـت آزمـایش نسـبت بـه کنترل نشان داده شد. در ادامه به منظور بررسی اختلافات بـین گروه هـا، بـا تسـتهـاي LSD)Post-hoc و(Tukey HSD محاسبات بیشتر انجـام شـد. اخـتلاف داده هـاي (اعـداد) ثانیـه شصتم پس از تزریق دوزهاي مختلف به دادههاي ثانیه پنجم به

۱۲۳ ۳۲۱

صورت حسابی ( اختلاف تعداد) محاسبه و به صورت میانگین± خطاي استاندارد نمایش داده شد. ضریب آلفـا α=۰/۰۵ در نظـر گرفته شد. براي تجزیه و تحلیل کمی و کیفی داده هاي مربوط به تکنیک سیتوشیمیایی NADPH-d با استفاده از نـرم افـزار Image Tool از هر نمونه لام عکس برداري به عمـل آمـد، و عکــس هــا در محــیط ایــن نــرم افــزار تحــت کالیبراســیون در مساحت هاي ۱۰۰ میکرومتري مورد بررسی قرار گرفت.

یافته ها

̋ ̋بر اساس̋ مشاهدات̋̋رفتاري̋مربوط به زمان هاي مختلف ۰ ، ۵ ، ۱۵، ۳۰، ۶۰ ، ۱۲۰ و (Time interval)180، اختلاف تعداد سلول ها در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسـبت بـه ثانیه پنجم مبناي پاسخ رفتاري سلول هاي P.caudatum بـه داروها در نظر گرفته شد (پنج ثانیه اول به عنوان زمان آشـنایی و سازگاري حیوانات در مواجهه با ماده تلقـیح شـده و برقـراري

گرادیان غلظت ماده مذکور در نظر گرفته شد).

پاسخ :Morphine شکل ۱ نشان دهنده پاسـخ مـرفین در

P.caudatum است. داده ها باآنالیز واریانس (ANOVA) یک طرفه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت که بـا توجـه بـه نتیجـه آزمون: (F(9,30) = 97.813, p<0.001) اختلافات گـروههـا با کنترلکاملاً معنیدار است. آنالیز بیشتر با آزمون هاي Posthoc نشان می دهد که مـرفین در دوز ۲μg نسـبت بـه سـایر دوزها بیشترین افزایش را در تعداد سلولها دارد.

پاسخ ال- آرژینین :(L-Arginine) شکل ۲ نشان دهنـده تاثیر دوزهاي مختلف ۱)L-arginine،۲،۴،۸ برحسـب(µg/µl به تنهائی بر سلولهـاي P.caudatum در مقایسـه بـا کنتـرل است. اختلاف تعداد سلول هـا در ثانیـه شصـتم پـس از تلقـیح نسبت به ثانیه پنجم، تحـت ۴X از میکروسـکوپ نـوري بارهـا محاسبه و دادهها به صورت میانگین±خطاي اسـتاندارد نمـایش داده شده اند. نتیجه آنالیز داده ها با آنالیز واریـانس یـک طرفـه (F(4,19)=140.699, p<0.001):(ANOVA) نشــــــان

شکل -۱نمودار دوز- پاسخ مرفین در حیوان تک یاخته اي است دوزهاي مختلف مرفین۶۰)،۴۰،۲۰،۱۶،۸،۴،۲،۱،۰/۵برحسب(µg/µlمطابق دستورالعملمندرج در متن به حیوانات تجویز و در فواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار آن ها به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل که آب مقطر بود ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول هاي P. caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسبت به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوري ارائه شده است. با آنالیز Post hoc اختلافات نسبت به کنترل p<0.001٭٭٭ و p<0.01٭٭ و p<0.05٭ می باشد.

۲۲۳ ۳۲۲

شکل -۲پاسخ ال_آرژینین را به تنهائی در حیوان تک یاخته اي نشان می دهد. عامل۲)،۱،۸،۴برحسب(µg/µlمطابق دستورالعمل مندرج در متن به حیوانـات تجـویز و درفواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار آن ها به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل که آب مقطر بود ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول هاي P.caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسبت به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوري ارائه شـده اسـت . بـا آنـالیز Posthoc اختلافات نسبت به کنترل p<0.001٭٭٭ و p<0.05٭ می باشد.

شکل -۳پاسخL-NAMEرا به تنهائی در حیوان تک یاخته اي نشان می دهد. عامل۸)،۴،۲،۱برحسب(µg/µlمطابق دستورالعمل مندرج در متن به حیوانات تجویز و درفواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار حیوانات به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل (آب مقطر) ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول هاي P.caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسبت نشان به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوري ارائه شده است. با آنالیز Post hoc اختلافات نسبت به کنترل p<0.001٭٭٭ و p<0.05٭ داده شد.

می دهد که اختلاف گروه ها با کنترلکاملاً معنـیدار اسـت. از آنالیز هاي Post hoc مشـخص گردیـد کـه دوز ۲μg L-arg نسبت به سایر دوزهـاي L-arg بیشـترین افـزایش را در تعـداد سلول هاي P.caudatum به دنبال داشته است.

پاسخ :L-NAME شکل ۳ پاسخ L-NAME را به تنهائی نشــان مــی دهــد. دوزهــاي مختلــف ۱)L-NAME،۲،۴،۸ برحسب(µg/µl به حیوانات تجویز و اختلاف تعداد سلول هـاي P.caudatum درثانیه شصتم پـس از تلقـیح نسـبت بـه ثانیـه

پنجم، تحت ۴X از میکروسکوپ نـوري بارهـا محاسـبه شـد و میانگین داده ها ± انحراف معیار گزارش گردید. گـروه کنتـرل فقــط آب مقطــر را دریافــت کــرد. دادههــا بــا آنــالیز واریــانس (ANOVA) یک طرفه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت، که با توجــه بــه نتیجــه آزمــون: (F(4,19)=48.905, p<0.001) اختلاف گروه ها با کنترلکاملاً معنی دار می باشد. آنـالیز بیشـتر حاکی است که دوز ۲μg L-NAME بیشترین کـاهش تعـداد سلول هاي P.caudatum را به دنبال داشته است.

۳۲۳ ۳۲۳

شکل -۴پاسخ ال_آرژینین را همراه با مرفین در حیوان تک یاخته اي نشان می دهد. عامل سیستم نیتریک اکساید(۴µg/µl)مطابق دستورالعمل مندرج در متن مقدم بردوز موثر مرفین (۲µg/µl) به حیوانات تجویز و در فواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار آن ها به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل که فقط مرفین (۲µg/µl) بود ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول هاي P.caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسبت به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوري ارائه شده است. با آنالیز Post hoc اختلافات نسبت به کنترل p<0.001٭٭٭ و p<0. 01٭٭ و p<0.05٭ می باشد.

شکل -۵پاسخL- NAMEرا همراه با ال-آرژینین و مرفین در حیوان تک یاخته اي نشان می دهد. عامل سیستم نیتریک اکساید(۱-۸µg/µl)مطابق دستورالعمل مندرجدر متن مقدم بر دوز موثر ال-آرژینین (۴µg/µl) و این عامل اخیر مقدم بر مرفین (۲µg/µl) به حیوانات تجویز و در فواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار آن ها به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل که فقط مرفین (۲µg/µl) بود ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول هاي P.caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسبت به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوري ارائه شده است. با آنالیز Post hoc اختلافات نسبت به کنترل مثبت p<0.001٭٭٭ و p<0.01٭٭ می باشد.

پاسـخ مشـترك مـرفین و ال- آرژینـین (L-arg+2μg کردند. داده ها حاصل تکرار مکرر آزمایش و محاسبه میانگین ±
:Morphine) شکل ۴ پاسخ مشترك مرفین و ال- آرژینـین را انحراف معیار است. آنالیز واریـانس (ANOVA) ایـن داده هـا
نشان می دهد. محور افقی نشـان دهنـده دوزهـاي مختلـف-L اختلاف کاملاً معنیدار را نشان می دهد: ( F(4,15)=76.786,
1)arg+2μg Morphine،۲،۴،۸ برحسب(µg/µl میباشد کـه (p<0.001 میباشد. آنالیز بیشتر حاکی اسـت کـه دوز-۴μg L
نسبت به کنترل مورد مقایسه قـرار گرفتنـد. کنتـرل مـذکور را arg (نسبت بـه سـایر دوزهـاي (L-Arg بـه همـراه دوز ۲μg
نمونه هائی تشکیل دادند که تنها دوز مـوثر مـرفین را دریافـت Morphine بیشــترین افــزایش را در تعــداد ســلول هــاي

۴۲۳ ۳۲۴

شکل -۶پاسخ ال-آرژینین و یا پاسخ ترکیبی ال-آرژینین وL-NAMEرا همراه با مرفین در حیوان تک یاخته اي نشان می دهد. عامل پـیش سـاز (ال-آرژینـین )(۴µg/µl)یا به تنهائی مقدم بر دوز موثر مرفین (۲µg/µl) تچویز شد و یا مهار کننده سیستم نیتریک اکساید (۱-۸µg/µl) مطابق دسـتورالعمل منـدرج در مـتن م قـدم بـر دوز مـوثر ال – آرژینین (۴µg/µl) و این عامل اخیر مقدم بر مرفین (۲µg/µl) به حیوانات تجویز و در فواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار آن ها به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل هـاي منفی (فقط آب مقطر) و مثبت (مرفین (۲µg/µl ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول هاي P.caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقـیح نسبت به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوري ارائه شده است. با آنالیزPost hoc اختلافات نسبت به کنترل مثبـت p<0.001٭٭٭

و p<0. 01٭٭ و p<0.05٭ می باشد.

P.caudatum به دنبال داشته است. عامل مهار کننده آنزیم مولد نیتریک اکساید و پـیش سـاز ایـن
پاسـخ مشـترك :L-NAME+L-Arginine+Morphine مولکول (نیتریک اکساید) در حیوانات در شـکل ۶ نمـایش داده
شکل ۵ این پاسخ را نشان می دهد. محور افقی نشـان دهنـده شده است. همانگونه که این تصویر نشان می دهد با مهار آنزیم
دوزهاي مختلف ۱)L- NAME،۲،۴،۸ برحسب(µg/µl اسـت اثرات تقویتی متوقف شد کـه ایـن امـر بـر مشـارکت نیتریـک
که مقدم بر ۴μg L- arg و آن مقـدم بـر ۲μg Morphine اکساید در پاسخ تقویت شده دلالت دارد.
تجویز شد. پس از محاسبه داده ها مطابق قسـمت هـاي دیگـر پاســــــخ مشــــــترك مــــــرفین و نالوکســــــون:
داده ها با آنالیز واریانس (ANOVA) یک طرفه مورد تجزیـه و :(Naloxone+Morphine) شــکل ۷ ایــن پاســخ را نشــان
تحلیـــل قرارگرفت،کـــه بـــا توجـــه بـــه نتیجـــه آزمـــون: می دهد. محور افقی نشان دهنده آن است که دوزهاي مختلف
(F(4,19)=1.037, p<0.001) اختلاف گروهها با کنتـرل کـه ۰/۴)Naloxone، ۰/۲، ۰/۱، برحسب (µg/µl مقـدم بـر دوز
منهاي L-NAME استکاملاً معنیدار میباشد. در دوز ۴μg موثر مرفین ۲µg/µl تجـویز شـده اسـت و داده هـا بـا آنـالیز
L- NAME نسبت به سایر دوزها بیشـترین کـاهش در تعـداد واریانس (ANOVA) یک طرفه مـورد تجزیـه و تحلیـل قـرار
سلول هاي P.caudatum رخ داده اسـت. بـه منظـور مقایسـه گرفت، که با توجـه بـه نتیجـه آزمـون ( F(4,19)=400.856,
اثرات تقویتی ال-آرژینین بر پاسخ مرفین و اینکه این اثرات بـه (p<0.001 اختلاف گروهها با کنترل کاملاً معنی دار مـی باشـد .
واسطه نیتریک اکساید و نه ال-آرژینـین اسـت پاسـخ ترکیبـی نمونه کنترل را مرفین ۲µg/µl تشکیل می دهد. آزمون هـاي

۵۲۳ ۳۲۵

فیزیولوژي و فارماکولوژي جلد ۱۵، شماره ۳، پاییز

شکل -۷پاسخ نالوکسون را همراه با مرفین در حیوان تک یاخته اي نشان می دهد. عامل رقابتی(۰/۱-۰/۴µg/µl)مطابق دستورالعمل مندرج در متن مقدم بر دوز موثرمرفین (۲µg/µl) به حیوانات تجویز و در فواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار آن ها به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل که فقط مرفین (۲µg/µl) بود ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول هاي P.caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسبت به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوري ارائه شده است. با آنالیز Post hoc اختلافات نسبت به کنترل مثبت p<0.001٭٭٭ می باشد.

High reaction to NADPH-d

No reaction to NADPH-d

Low reaction to NADPH -d

C8 8A 8B

شکل -۸این شکل شواهد سیتولوژیک را با استفاده از روش سیتوشیمیاییNADPH-diaphoraseبراي نشان دادن فعالیت سیسـتمNOدر سـلول هـا يP.caudatumنشان می دهد. با این روش تحت شرایط مختلف: :A دوز موثر مرفین به تنهائی :B دوز موثر مـرفین همـراه بـ ا ال-آرژینـین و :C دوز مـوثر مـرفین همـراه ال -آرژینـین و L-NAME، میزان و شدت رنگ آبی تولید شده که شاخصی از میزان فعالیت سیستم )NO فعالیـت آنـزیم (NOS مـی باشـد، تغییـر کـرده اسـت . پیکـان هـا موقعیـت واکـنش NADPH-diaphorase را نشان می دهند.

بیشتر مشخص کرد که اثر مهاري Naloxone بر قدرت مرفین (Morphine Potency) با افزایش غلظت (دوز) بیشتر میشود.

علاوه بر شواهد رفتاري بـا اسـتفاده از روش سیتوشـیمیایی NADPH-diaphorase (مندرج در قسمت مـواد و روش هـا)

فعالیت سیستم NO در سلول هـاي P.caudatum نشـان داده شد. شواهد به دست آمده با این روش سیتوشـیمیایی مشـخص کننده آن است که تحت شرایط مختلف میـزان و شـدت رنـگ آبی تولید شده، شاخصی از میزان فعالیت سیستم )NO فعالیت

۶۲۳ ۳۲۶

تاثیر NO بر قدرت مرفین در Paramecium caudatum

آنزیم (NOS بوده و با نمونه شاهد تفاوت داشته اسـت، کـه بـا آنالیز داده ها تغییر فعالیت آنزیم NOS نشـان داده شـده اسـت (شکل .(۸

بحث

مرفین سلول هـاي P.caudatum را مجتمـع کـرد و ال-آرژینین بر این پاسخ، تاثیر مثبت و تقویتی نشان داد، در مقابـل شدت پاسخ در این جانوران بـا پـیش تجـویز Naloxone (بـه عنوان مهارگر سیستم اپیوئیدي [۷] و L-NAME (بـه عنـوان مهارگر سیستم [۶] NO کاهش یافت، همچنین ایـن جـانوران در حالت کنترل (بدون تلقیح هر گونه ماده اي) نیز تجمـع کـم تري از خود نشان دادند، که این مساله میتواند به علـت حفـظ تعادل دمایی بدن جانور باشد. چرا که این جانوران تـک یاختـه اي براي تنظیم گرماي بدن خود، سعی در تجمع در یک نقطـه را دارند [۱۴]، و اما در پاسخ مرفین، می توان بـه طـور کلـی در سطح رفتاري و فارماکولوژیک نتیجـه گرفـت کـه سـلول هـاي P.caudatum نسبت به دوزهاي مختلـف مـرفین پاسـخهـاي متفاوتی از خود نشان مـیدهنـد، بـه طـوري کـه در دوز ۲μg مرفین حداکثر قدرت مرفین (Morphine potency) در ایجـاد تجمع سلول هاي P.caudatum رخ داده است، در حالی که در دوزهــاي بــالاتر مــرفین ۸) و ۱۶ و ۲۰ و ۴۰ و ۶۰ میکروگــرم) پاســخ منفــی اســت، و کــاهش شــدید تعــداد ســلولهــاي P.caudatum و در نتیجه کاهش قدرت مرفین ( Morphine(potency مشاهده می شود. این امر نشان دهنده پاسخ وابسته بــه دوز بــوده و بــروز تعــدادي از اثــرات جــانبی را توســط دارو منعکس می کند .[۲۱] این یافته درسطح ملکولی بـه طـورکلی بیانگر وجود سیستم سیگنالینگ مرفین (رسپتورها و ملکول هاي سـیگنالینگ) در ســلولهـاي P.caudatum مــیباشـد کــه در توضیح پاسخ Naloxoneذیلاً در مورد آن بیشتر بحث خواهـد شد. و اما در توجیح پاسخ ال-آرژینین یافته ها در سطح رفتـاري بیانگر این است که سلول هاي P.caudatum نسـبت بـه ال-آرژینین پاسخ مثبتی از خود نشان می دهند یعنی ال-آرژینین به عنوان یکی از اجزاي اصلی سیستم نیتریک اکساید [۸]، با تولید NO در درون ســلول مــیتوانــد عامــل جــذب ســلول هــاي P.caudatum در نقطه تلقیح باشد، و اما در سطح ملکولی این

شاهرخی و همکاران ۱۳۹۰

یافته می تواند بیانگر ایـن امـر باشـد کـه وجـود سیسـتم NO درسلول هاي P.caudatum بسیار محتمل است. در تائیـد ایـن احتمال می توان به پاسخ منفـی ایـن سـلول هـا بـه مـاده L-NAME اشاره کرد که L-NAME بـه عنـوان یکـی از مهـار کننده هاي اصلی سیستم [۶] NO با مهار این سیستم در درون سلول می تواند عامل دفع P. caudatum در نقطه تلقیح باشد. در تلقیح مشترك مرفین با هـر یـک از مـواد-L-arginine ,LNAME وNaloxone، همانگونه که در بخش نتایج ذکر شـد، می توان به نکات جالبی اشاره کـرد، بـه طـور مثـال در تلقـیح مشترك مرفین و ال-آرژینـین، یافتـه هـا در سـطح رفتـاري و فارماکولوژیک بیانگر تأثیر مثبـت و قابـل توجـه ال-آرژینینـدر افزایش قدرت مـرفین (Morphine Potency) مـیباشـد، بـه طوریکه پاسـخ ایجـاد شـده در دوز مـؤثر ۴μg L-arg+2μgMorphine بســـیار بیشـــتر از دوز مـــؤثر مـــرفین (۲μgMorphine) به تنهایی (حالت کنترل) میباشد، و اما در سـطح ملکولی با توجه به تأثیر ال-آرژینین (به عنوان یکـی از اجـزاي اصلی سیستم (NO در تولید NO نتیجه مـی شـود کـه وجـود سیســتم NO در ســلول هــاي P.caudatum بســیار محتمــل می باشددر. ضمن احتمالاً سیستم سیگنالینگ NO در تـداخل مثبت با مرفین (Morphine Potency) است، چرا که به دنبال تأثیر ال-آرژینین و تولید NO، قـدرت مـرفین در ایجـاد پاسـخ مثبت توسط سلول هاي P.caudatum بسیار بیشـتر از قـدرت مرفین بـدون تزریـق ال-آرژینـین (حالـت کنتـرل) مـیباشـد . همچنین در تلقیح مشترك مرفین، ال-آرژینـین و L-NAME یافته ها دال بر تائید مباحث فوق می باشـد، ایـن یافتـه هـا در سطح رفتاري و فارماکولوژیک بیانگر تأثیر مهـاري L-NAME بــر سیســتم NO و بــه دنبــال آن کــاهش قــدرت مــرفین (Morphine Potency) میباشد، به طوریکـه در دوز مـؤثر ۴μg L-NAME + 4μg L-arg + 2μg Morphine نسـبت بـه حالـت کنتـرل (۴μg L-arg +2μg Morphine) پاسـخ جادای شده شدیداً کاهش یافته است. اما درسطح ملکولی، تأکید مجددي بر وجود سیستم NO و تداخل مثبت ایـن سیسـتم بـا مــرفین مــیباشــد و در نهایــت، پاســخ منفــی ســلول هــاي P.caudatum به Naloxone می تواند در بر دارنده اطلاعات بیشتري در مورد وجود رسپتورهاي اپیوئیـدي در ایـن جـانوران تک یاخته اي باشد.

۷۲۳ ۳۲۷

فیزیولوژي و فارماکولوژي

با توجه به اینکه Naloxone به عنوان آنتاگونیست رقـابتی (در برابر مرفین) براي تصاحب رسـپتور µ عمـل مـیکنـد [۷]، وجود رسپتور μ در P.caudatum بسیار محتمـل مـی شـود. از طرف دیگر میتوان فرض کرد که قدرت مرفین ( Morphine(Potency با عملکرد رسپتور μ رابطـه تنگاتنـگ و مسـتقیمی دارد .[۲۱] احتمالا” دوزهاي ۰/۵ و ۱ میکروگرم مرفین (نمودار دوز- پاسخ مرفین)، کاهش در تعداد سلول هاي P.caudatum را به واسطه کافی نبودن غلظت (دوز) مرفین بـراي تحریـک و فعال کردن رسپتورهاي اپیوییدي نشـان دادنـد، کـه البتـه ایـن مشکل غلظت (دوز) براي فعال کردن رسپتور μ دردوزهاي ۲ و ۴ میکروگرم مرفین مرتفع شـده اسـت، بـه طوریکـه بیشـترین افزایش قدرت مرفین در دوز ۲μg مرفین قابل مشاهده است. و اما در دوزهاي ۸ و۱۶و۲۰و۴۰و۶۰ میکروگرم مـرفین مـی تـوان علت کـاهش در تعـداد سـلول هـاي P.caudatum (کـاهش قدرت مرفین) نسبت به سایر دوزهـاي مـرفین را در رابطـه بـا تداخل عمـل رسـپتورهاي اپیوئیـدي µ) و δ و (κ بـا یکـدیگر توجیه کرد ۲۱]، [چراکه احتمالاً درغلظت هاي (دوزهاي) بـالاي مرفین، علاوه بـر رسـپتور µ، رسـپتورهاي دیگـر δ) و (κ نیـز تحریک و فعال می شوند، ولی از آنجاییکه سـیگنالینگی کـه در اثر فعالیت یک رسپتور به راه می افتد، ممکن است سـیگنالینگ رسپتور دیگر را مهار کند .[۲۱,۲] میتوان چنین در نظر گرفت که اولاً رسپتور µ تحریـک پـذیرتر از رسـپتورهاي δ و κ مـی باشد، که این مساله می تواند توجیه کننده حالتتقریباً سینوسی نمودار دوز- پاسخ مرفین (شکل (۱ باشد. دیگر اینکـه عملکـرد رسپتورهاي δ و κ مانع اعمال اثر رسپتور μ میشود و در نتیجه کــاهش قــدرت مــرفین (Morphine Potency) در دوزهــاي

بالاي مرفین ۸)و۱۶و۲۰و۴۰و۶۰ میکروگرم) اتفاق می افتد.