اثر وزن مولكولي و DD كيتين و كيتوسان روي فرآيند ترميم زخم

خلاصه :
در اين مقاله اثر كيتين و كيتوسان روي فرآيند ترميم زخم ها و برش هاي خطي در موش ها بررسي شده است . تحكام شكاف زخم در گروههاي كيتوسان (cos),D-glucosamine (GL¬c¬NAc¬¬)] N-acetyl –D-glucosamine و Chiti – aligosaccharide (NACOS) و كيتين ) بيشتر بود .
فعاليت آنزيم هاي كلاژناز هم در گروه هاي كيتوسان بيشتر از گروههاي كتين است

.
ميزان تغييرات در مورد تجمع و استحكام و فعاليت آنزيم هاي كلاژ ناز در نمونه هاي مختلف زياد نبود.
دريافته هاي بافت شناسي رشته هاي كلاژن به صورت عمود بر خط برش در گروه هاي (NACOS,COS) رشد كردند و در گروههاي كيتوسان تعدادي فيبروبلاست فعال شده در اطراف زخم ديده شد.
در DD هاي بالا استحكام خط برش ترميم يافته بيشتر است مچنين سميزان فيبروبلاست هاي ظاهر شده اطراف زخم .
مقدمه :
كيتين و كيتوسان تعدادي خواص بيولوژيكي مفيد در كاربرد هايي نظير : ۱- پوشش زخم ها ۲- زيست سازگاري بالا ۳-قابليت زيست ستخريب پذيري ۴- عامل انعقاد خون ۵- عامل ضد عفونت ۶- عامل تسريع در ترميم زخم در اين تحقيق روي اثر كيتين و كيتوسان روي ترميم زخم كار شده و بهايننتيجه رسيده كه اين موارد ست هاي ترميم و سلول هاي (PMN) Polymorphonuclear و فيبروبلاست ها و سلول هاي اندوتليال رگ ها را فعال مي كنند .

وقتي كيتين و كيتوسان در بدن استفاده مي شوند توسط آنزيم هاي كيتيناز و كيتوساناز خريب مي شوند و متعاقباٌ به متومر و اليگومر هايشان تبديلمي شوند .
در تحقيقات گذشته ثابت شده كه نه تنها كيتين و كيتوسان بلكه ايگومرها و منومرهاي آنها نيز روي مهاجرت سلول هاي ساندوتليان و فيبروبلاست ها اثر دارد و منومرها و اليگومرهاي آنهابر روي ترميم زخم ها در محيط in-vivo موثرند . هر چند كه رابطة بين خواص شيميايي و كيتين و كيتوسان و ترميم زخم هستند شناخته نشده است .

در تحقيق حاضر كيتين و كيتوسان با وزن هاي مولكولي مختلف و DD هاي مختلف آماده شده اند و اثر آنهاروي ترميم زخم هاي برشي ايجاد شده در موشها آزمايش شده . و همچنين استحكام زخم ترميم شده و ميزان آنزيم كلاژناز در بافت هم اندازه گيري شده كه اين دو عنوان شاخص براي ترميم زخم هستند .
آزمايشات :
در اين تحقيق تين و كيتوسان توسط شركت Sunfive + ژاپن ساخته شه است
كيتين ( باوزن مولكولي ۳۰۰KD ) و كيتوسان ( با وزن مولكولي ۸۰KD ) ا ميانگين سايز ۵/۳ ميكرو متر بوسيله اكسيد اتيلن استريل شدند و در محلول بافر فسفات ( PBS با PH=7/2 ) با غلظت ۱۰ ميلي گرم بر ميلي ليتر معلق مي شوند .
كيتين و كيتوسان به ترتيب شامل DD هاي كمتر از ۱۰ درصد و بيشتر از ۸۰ درصد هستند .
NACOS و COS به ترتيب از تركيب [GLcNAcNAc5] و [GLCN1, GLCN6] بدست آمده اند .
اليگومرها و منومرها در محلول PBS با غلظت ۱۰ ميلي گرم بر ميلي ليتر حلشدند و از فيلترهاي با روزنه هاي ۴۵/۰ ميكرو متر عبور كرده و استريل شدند .
هر نموه با غلظت ۱/۰ تا ۱۰ ميلي گرم بر ميلي ليتر با PBS تنظيم شد.

چهار نمونه مختلف deacetylation شده كيتين (dac) ( با ۱۴% و ۲۳% و ۶۳% و ۹۶% ) يك وزن مولكولي يكسان (۵۰KD) بوسيله شركت Sunfive تهيه شده و بصورت پودري با ميانگين سايز ۶ تا ۸ ميكرومتر استرل شده و به همان روش تنظيم كيتين و كيتوسان تنظيم شده است .
پودر ها با DD 100% رابا (DAC100) نشان مي دهند .
وزن مولكولي هم در اين تحقيق توسط روش viscosity تعيين شده
DD هم در اين تحقيق سط روش IR و يا روش colloidal titration تعسسن شده .
طرح آزمايش :
از ۷۲ عدد موش مؤنث Wistar ( با وزني حدود ۳۰۰+۲۰gr ) در اين تحقيق استفاده شده است .
بعد از اينكه موهاي پشت موشها كنده شد و آن قسمت با يد ضد عفوني شد ۲ زخم برشي ضخامتكامل (با طول ۴ سانتي متر ) در حالت بي هوشي با چاقوش جراحي روي پشت موش ها ايجاد مي شود .

بعد از اينكه حونريزي بند آمد با ۱۰۰ ميكروليتر از هر نمونه زخم شتسشو داده مي شود و سپس زخم با بخيه هايي از جنس Stainless Steel بخيه مي شوند . هفت روز بعد از جراحي حيوانات انانازي (كشته) مي شوند و از بافت پوست در محل زخم نمونه برداري مي شود .
در آناليز استحكام زخم بهبود يافته يك نوار از پوست ( با ۱س سانتي متر عرض و ۲ سانتي متر طول ) از وسط محل زخم در هر نمونه برداشته مي شود .

حداكثر استحكام تا زماني كه پوست از محل برش ه شود با lood gauge و كشش سنج اندازه گيري شود .
Data هاي بدشت آمده به سطح مؤثر تقسيم شده ( ۵ ميلي متر از خط برش در هر نمونه ) و در آخر بر حسب نيوتون بر ميلي متر مربع بيان شده (N/mm2) در ديگر نمونه ها ( نمونه هاي دوم ) ميزان آنزيم كلاژ ناز با دستگاه اندازه گيري كلاژ نوع I ازه گرفته شد و مشاهدات بافت اسي ز انجام . و بالاخره ميزان آنزيم كلاژ ناز فعال با واحد Unit/mg پروتئين بافت بيان مي شود .
نتايج و تحليل ها :
اثر وزن مولكولي روي استحكام بهبود يافته و فعاليت آنزيم كلاژناز :
اثر وزن مولكولي روي استحكام زخم بهبود يافته در شكل ۱ نسان داده شده است . استحكام زخم بهبود يافته در همة نمونه ها افزايش قابل توجه اي در مقايسه بانمونة شاهر (Saline) داشت . در گروه كيتين ( شامل : كيتين GlCNAc , NACOS ) و كيتوسان ( شامل :‌ كيتوسان و GLCNAC ) و كتيسان و GLCN ¬ و COS ) بيشترين تأثير مربوط به اليگومر ها (NACOS , COS ) بوده و قتي گروههاي كتين و گروههاي كتيوسان با هم مقايس شدندنشان داده شد كه گروههاي اثر بيشتري دارند از گروههاي كيتين در يك وزن مولكولي يكسان اثر وزن مولكولي روي فعاليت آنزيم كلاناژ در شكل ۲ نشان داده شده است .
فعاليت آنزيم كلاناژ در همة نمونه ها افزايش قابل توجه اي در مقايسه شاهد (saline) داشت . در گروههاي كيتوسان منومر (GLCNAC , GLCN) اين فيبرها به صورت موازي با خط برش رشد مي كنند اين تحقيق شان مي دهد كه نه تنها كيتين و كيتوسان بلكه منومرها واليگومرهاي آنها نيز سرعت ترميم زخم را افزايش مي دهند . در گزارشاتقبلي نشان داده شده كه كيتين و كيتوسان سرعت ترميم زخمرا افزايش مي دهند . هر چند كهاين قضيه كاملاٌآشكار نيست به هر صورت كيتين و كيتوسان مستقيماٌ اثر مي گذارند براي اينكه آنهابوسيلة خي از آنزيم هابه مونومرها و اليگومرهايشان در محيط زخم تخريب مي شوند .

در اين تحقيق ثابت شدهكه ذات تخريب پذيري كيتين و كيتوسان بر روي ترميم رخم تأثير گذار است . اليومرها تأثير بيشتري دارن .
در مشاهدات بافتي نشان داده شده كه فيبرهاي كلاژني در نمونه هاي اليگومري به صورت عمود بر خط برش نمي توانند رشد كنندكه بهترميم زخم سرعت بدهند .
نمي توان به درستيتوضيح داد كه چرا اليگومرها اثر بيشتري بر روي ترميم زخم دارند . با وجود اين يك جواب مطرح است : وقتي هر نمونه با سايز مولكولي كم . به ع لاوه اليگومرها هم از اين مولكولي بالا. در حالي مترمرها به سرعت جذب مي شوند به علت وزن مولكولي كم به علاوه اليگومرها هم از هم اين جهت مناسب هستند. نه فقط كتينين و كيتوسان بلكه اليگومرها و منومرهايشان هم فعاليت انزيم كلا‍فاز را ا فزايش ki مي دهند.

فعاليت انزيم كلا‍ ناز با تغيير شكل زخم در طي فرآيند ترميم زخم رابطه دارد. اين آنزيم به طور عمده توسط فيبروبلاست ها و سلول هاي التهابي توليد مي شوند. در مشاهدات بافت شناسي فيبرو پلاست هاي بيشتر و سلول هاي التهابي كمتري در اطراف زخم ديده شده كه نشان دهنده اين است كه فيبروپلاست ها به طور عمده آنزيم كلا‍فاز را توليد مي كنند. اين پديده به اين معني است كه كيتين و كيتوسان و مواد حاصل از تخريب آنها بر روي شكل زخم در طي فرآيند ترميم زخم تاثير مي گذارند. تحقيقاتي كلينيكي وجود دارد كه نشان مي دهد كه جاي زخم در حضور كيتين و كيتوسان به حداقل ميزان خود مي رسد.
در اين تحقيق رنج رسوب همه ن مونه ها از ۱/۰ تا ۱۰ ميلي گرم بر ميلي ليتر ترميم زخم و فعاليت آْنزيم كلا‍فاز را افزايش داد.

اين پديده پيشنهادي كند كه نمونه در ميزان رسوب كمتر ممكن است در ترميم زخم موثر باشد.
در تحقيق از نمونه ها با ميزان رسوب كمتر ممكن است در ترميم زخم موثر باشد.
در تحقيقات گذشته اين نتيجه حاصل شده است كه كيتين با وزن ۱/۰ ميلي گرم و كيتوسان با وزن ۰۱/۰ ميليگرم باعث رشد بافت در محيط in-vivo مي شوند.
در اين تحقيق از نمونه ها با ميزان رسوب ۱/۰ تا ۱۰ ميليگرم بر ميلي ليتر ا ستفاده شده و ۱/۰ ميلي ليتر از هر نمونه روي زخم ها قرار داده شده (۴ سانتر متر x 1 سانتي متر سطح زخم) كمترين وزن هر نمونه ۰۱/۰ ميلي گرم (۱۰ ميكروگرم) است.

نويسنده اين تحقيق فكر كرده كه اين وزن معقول ا ست و سپس اين ازمايش را طراحي كرده است.
در نتيجه همه غلظت ها براي تسريع بهبود زخم كافي هستند بنابراين بايد اثر غلظت هاي كمتر هم بررسي شود.
اثر DD روي استحكام زخم هاي بهبود يافته و فعاليت كلا‍ژفاز:
تجدول ۱ اثر DD را روي استحكام زخم هاي بهبود يافته و فعاليت كلا‍فاز را نشان مي دهد.
حد هر دو پارامتر در همه نمونه ها افزايش قابل توجه اي نسبت به نم ونه شاهد دارد.
هر چه DD بيشتر باشد ا ستحكام زخم بهبود يا فته و فعاليت آنزيم كلافاز بيشتر است. و همچنين در مطالعات بافت شناسايي در DD هاي بالا فيبروپلاست هاي فعال شده بيشتري مشاهده شده است. (شكل ۵ و ۶)
در اين تحقيق اثر DD روي سرعت بهبود زخم اثبات شده است در نتيجه ما فرض مي كنيم كه آمينوهاي باقي مانده با قدرت و سرعت ت رميم زخم را بازگو مي كنند
مطالعات بافت شناسي فيبروپلاست هاي فعال بيشتري نشان داده است.
در سال ۱۹۸۶ توسط Nishimura و Ishihara و همكارانشان گزارش شده كه ۷۰ درصد كيتين deacetylation شده بيشترين اثر را روي فعاليت ماكروفاژها د ارد.
Suzuki در سال ۱۹۹۷ نشان داد كه DD بالاتر كيتين يك فعاليت تكميلي قوي رادر مقايسه با نمونه اي با DD كمتر دارد .
در آينده مطالعه رابطه آمپنوهاي باق مانده با فعاليت فيبروبلاست ها لازم است .
نتيجه :‌
وه بركيتين و كيتوسان منومرها و اليگومرهاي آنها هم فرآيند ترميم زخم را تسريع مي كنند . استحكام زخم بهبود يافته و فعاليت آنزيم كلاژناز در گروههاي كيتوسان س بيشتر از گروههاي كيتين است .
دربافته هاي بافت شناسي كلاژن در جهت عمود بر خطذ برش در گروههاي اليگوساكاريدها (NACOS,CAS) و تعداي فيبروبلاست هاي فعال شده در اطراف زخم در گروههاي كيتوسان نشان داده شده اتس .
در مورد DD :
هرچه DD بالاتر باشد استحكام زخمبهبود يافته فيبرو بلاست سها افزايش بيتري را نشان مي دهد .