بروسلوزیز

بروسلا شامل باكتريهاي گرم منفي، داخل سلولي اختياري هستند كه باعث بروز بروسلوزيز در حويانات بخصوص گاو، گوسفند و بز مي گردد. انسان با مصرف گوشت و فرآورده هاي لبني دامهاي آلوده، به بروسلوزيز مبتلا مي گردند. برويلوزيز در دامها باعث ناباروري و سقط جنين و در انسان باعث بروز تب مواج، مننژيت، آرتريت و آندوكلوويت ميگردد. بروسلوزيز هنوز از جمله عفونتهاي شايع در كشورهاي در حال توسعه و حتي برخي كشورهاي پيشرفته بشمار مي آيد.

امروزه با كنترل اين بيماري بر سه پايه كشتن دامهاي آلوده، پاستوريزاسيون و واكسناسيون مي باشد. واكسيناسيون دامها كبر اساس تلقيح سويه هاي زنده ضعيف شده بروسلا آبورتوس (۴۵/۲۰ و ۱۹S) و بروسلاملي تنسيس (Rev1) است. استفاده از اين واكسنها در دامها با محدوديتهايي روبرو است. تحريك تولدي آنتي بادي در دامهاي واكسينه كه مانع از تفكيك آنها از دامهاي مبتلا مي گردد، همچنين بروز سقط جنين و ابتلا به بروسلوزيز در اين حيوانات باعث شده است تا تلقيح اين واكسنها در انسان ممنوع و در دامها با احتياط انجام شود.

با توجه به مشكلاتي كه در اثر واكسيناسيون دامها بوجود آمده است، تحقيقات گسترده اي در زمينه طراحي واكسنهاي جديد در دست مي باشد. اين تحقيقات در سه راستاي كلي زير جهت يافته اند.
۱- استفاده از سويه هاي زنده ضعيف شده خشن نظير RB51
2- تلقيح زير واحدهاي پروتئيني ايمني زا و يا باكتريهاي كشته شده
۳- استفاده از روشهاي نوين واكسيناسيون نظير DNA واكسنها
با اينكه نتايج تحقيقات مربوط به سويه هاي زنده ضعيف شده خشن (RB

۵۱) حاكي از موفقيت اين سويه ها در كنترل بيماري است ولي هنوز بررسي اين واكسنها بمراحل نهايي هود نرسيده است. ايمني زايي آنتي ژنهاي مختلفي از بروسلا بشكل طبيعي و يا نو تركيب بررسي شده اند. از جمله اين آنتي ژنها مي توان HtrA، GroEL، GroES، CuZnSoD، yajc، uvrA، L7/L12 و P39 را نام برد. اين بررسي نشان مي دهند كه تنها سه آنتي ژن P39، L7/L12 و Cu,ZnSoD توانايي تحريك پاسخهاي ايمني سلولي و هومورال را دارند. با توجه به شكل حيات بروسلا در داخل بدن كه بصورت سلولي است، تنها پاسخهاي ايمني سلولي بخصوص پاسخهاي سيتوتوكسيك قادر به حذف اين باكتري از بدن مي باشند. بنابراين واكسنهايي كه بتوانند اين

پاسخها را تحريك كنند توانايي بروسلوزيز را دارند. در اين پاسخها لمفوسيتهاي T از نوع Th1 القا مي شوند كه در منيجه ترشح سيتوكانيهايي از جمله انترفرون گاما را مي توان از اين سلولها مشاهده نمود. در بروسلوزيز تحريك پاسخهاي Th2 كه باعث توليد آنتي باديها مي گردد علاوه بر اينكه در بهبودي اثر چنداني ندارند بلكه حتي ممكن است روند بيماري را به سوي مزمن شدن سوق دهند.
تحقيقاتي كه برروي واكسنهاي آنتي ژنتيك و يا حتي فرم كشته شده بروسلا انجام شده است ثابت مي كند كه اين عوامل قادر به تحريك پاسخهاي ايمني سلولي نيستند. بطور كلي اينگونه واكسنها قادر به توليد پروتئينها در داخل سلولهاي عرضه كننده آنتي ژن (APC) نيستند، درنتيجه توانايي تحريك پاسخهاي سيتوتوكسيك را ندارند.
امروزه براي حل اين مشكلات از روشهاي جديد عرضه آنتي ژن به بدن استفاده شده است تا تحريك پاسخهاي ايمني سلولي مناسب را براي حذف عوامل داخلي سلولي بهمراه داشته باشد. از جمله اين روشها DNA واكسيناسيون است كه بسياري داز مشكلات و مسايل مربوط به آزادسازي آنتي ژن در بدن را حل نموده است. درذ اين واكسنهاي بيان آنتي ژن تحت كنترل يك پروموتور قوي است كه توانايي ابراز آن را در سلولهاي يوكاريوتيك دارند.

DNA واكسنها طيف وسيعي از پاسخهاي ايمني ازجمله سلولهاي سيتوتوكسيك، سلولهاي T كمكي و آنتي باديها را تحريك مي كند. با اينكه مكانيزم دقيق عملكرد اين واكسنها مشخص نشده است ولي فرضياتي مبني بر تحريك پاسخهاي ايمني ما اين روش مطرح است. بيان آن مورد نظر و توليد پروتئين و در نهايت جذب اين پروتئينها توسط سلولهاي عذضه كنندة آنتي ژن (APC) باعث ميشود تا شاخصهاي آنتي ژنتيك در كنار سلولهاي mHCII عرضه و درنتيجه با فعال شدن سلولهاي كمكي T با توليد آنتي بادي را بهمراه داشته باشد. تحريك پاسخهاي ايمني سلولي و بخصوص پاسخهاي سيتوتوكسيك با واسطه پديده Cross-Priming انجام مي گيرد.

در اين پايان نامه، هدف مطالعه قدرت ايمني زايي پروتئينهاي حاصل از ژنهاي P39، L7/L12 و بروسلا آبورتوس در موش Balb/c است. روش ارائه اين آنتي ژنها به بدن با استفاده از DNA واكسيناسيوم استن. ايمني زايي هر يك از ژنهاي فوق مبتلا بصورت مجزا مورد بررسي قرار گرفته است. ولي تا كنون ايمني زايي تجويز همزمان ايندوژن مطالعه نشده است. در گروههاي واكسينه (سه گروه) بترتيب پلاسميدهاي PcDNA3-L7/L12، PcDNA-P39 و PcDNA3-

P39+PcDNA3L7/L12 بصورت عضلاتي تزريق شده است. اندازه گيري آنتي باديهاي اختصاصي توليد شده و نوع پاسخهاي سلولي نشان از حركت ايمني به سمت Th1 دارد.
تيتر آنتي باديهاي IgG20 و IgG1 اختصاصي ضد آنتي نوتركيب L7/L12 و در بدن موشهاي واكسينه، توليد نسبتاً بالاي ياين آنتي بادي IgG20 را نشان مي دهد. تيتر بالاي IgG2a نتيجه تحريم پاسخهاي Th1 است. بعلت اينكه آنتي ژنهاي مورد مطالعه داخل سلولي هستند تيتر بالاي IgG2a تأثيري را در ايمني حذف كننده باكتري بوجود نمي آورد. ولي مقياس بالاي توليد اين‌آنتي

بادي در هر سه گروه واكسينه حاكي از بيان ژنها در سلولهاي عضلاني و سلولهاي عرضه كننده آنتي ژن (APC) دارد. در عين حال بالا بودن نسبت تيتر IgG2a به IgG1 نيز دال بر تحريك پاسخهاي Th1 است.
القاء پاسخهاي ايمني سلولي پس از واكسيناسيون با اندازه گيري تكثير لنفوسيتهاي T (LTT) و پاسخهاي سيتوكاسيني پس از تحريك سلولهاي طحال با پروتئينهاي نوتركيب P39 و L7/L12 ارزيابي گرديد. همانطور كه نتايج تحقيقات گذشته نيز نشان مي دهد، پروتئينهاي فوق توانايي بالاي القاء تكثير لنفوسيتهاي T و توليد انترفرون گاما را داشته اند. در عين حال توليد انترلوكين ۵ اندك بود. در اين تحقيق ميزان توليد انترلو.كين ۴ سنجيده نشده است ولي با توجه بهع تيتر آنتي بادي IgG1 (تيتر پائين) اين نتيجه را نيز مي توان استنباط كرد كه سطح توليد اين سايتوكاين هم بايد پائين باشد.
بالا بودن مقدار انترفرون كاما و پائين بودن مقدار انتركولين ۵ توليد شده، نشاندهنده تحريك ايمني سلولي در جهت است. نتيجه اخير تأئيد كننده نتايج مربوط به اندازه گيري آنتي باديها است. با القاء ايمني سلولي Th1 و درنتيجه ترشح سيتوكانيهاي انترفرون گاما، توانايي ماكروفاژها در كشتن باكتريهاي داخل سلولي افزايش مي يابد. بررسي نتايج مربوط به چالش بروسلاآبورتوس بيماريزا (سويه ۵۴۴) در موشهاي واكسينه شده نيز تاييد اين موضوع را مي رساند. تعداد باكتريهاي جدا شده از گروههاي واكسينه در مقايسه با گروههاي كنترل منفي نشان مي دهد كه علاوه بر اينكه تعداد باكتريها افزايش تيافته بلكه كاهش نيز يافته است.

بررسي نتايج ايمني هومرال و سلولي نيز تاثير همكاري ژنهاي توليد كننده ايندو آنتي ژن را در افزايش پاسخ ايمني نشان مي دهد. يكي از دلايل مربوط به اين اثر همكاري را بايد در قطع رقابت بين ايندو آنتي ژن ديد. تزريق پلاسميدهاي متعدد كه هركدام كد كننده آنتي ژن مجزايي هستند مانع از بروز رقابت بين آنتي ژنها در بيان سلولي آنها مي شود. بعبارت ديگر بعلت اينكه پلاسميدها به سلولهاي مجزايي وارد مي شود، عملاً هر سلول تنها يك آنتي ژن را بيان مي كند، بنابراين

رقابتي بين اين آنتي ژنها واقع نمي شود. در نهايت اگر ماهيت آنتي ژنها سركوب كننده ايمني نباشد همكاري بين آنها باعث افزاتيش پاسخ ايمني ميگردد. آنچه از اين تحقيق نتيجه مي شود، همكاري بين آنتي ژنهاي P39 و L7/L12 در حذف بروسلاآبورتوس واكسينه شده و تأثير ارائه آنتي ژن با روش DNA واكسيناسيون است.