تعیین برخی ویژگی های فیزیکوشیمیایی و ردیابی سرولوژیکی جدایه ایرانی ویروس کوتولگی زبر ذرت

چکیده
ویروس کوتولگی زبر ذرت (maize rough dwarf virus – Iranian isolate , mrdv-i) یکی از ویروس های مهم در استان فارس محسوب می شود . رابطه این ویروس با ویروس های مشابه در داخل و خارج از ایران هنوز روشن نشده و ردیابی سرولوژیکی آن در سطح وسیع نیز هنوز امکان پذیر نگردیده است . هدف از تحقیق حاضر خالص سازی ویروس ، تهیه آنتی سرم بر علیه آن ، شناسایی میزبان های طبیعی و امکان ردیابی منابع آن در طبیعت و مطالعه برخی ویژگی های فیزیکوشیمیایی آن بود . خالص سازی MRDV-I از طریق سانتریفوژ کردن افتراقی و استفاده از ستون سوکروز دارای شیب چگالی انجام شد . آنتی سرم ویروس با تزریق زیر پوستی آموده خالص سازی شده ویروس به

خرگوش تهی و مورد استفاده قرار گرفت . پیکره های MRDV-I در الکترون میکروسکوپ فاقد کپسید خارجی بودند و قطری در حدود ۴۸ نانومتر داشتند. الکتروفورز پروتئین ساختمانی ویروس و متعاقب آن آزمون Westem blot سه پروتئین به اندازه های ۱۱۳،۱۱۹،۱۳۸ دالتون را مشخص کرد . الکتروفورز آر.ان.ای وجود ده قطعه ژنوم را نشان داد هر چند که قطعه دوم ضعیف تر از سایر قطعه ها به نظر می رسید . این ویژگی ژنوم MRDV-I مشابه خصوصیات گزارش شده در منابع برای فیجی ویروس ها و به ویژه جدایه های دیگر MRDV بود . براساس نتایج ELSA گیاهان زراعی گندم و برنج و علف های هرز دژگال ، پنجه مرغی ، ارزن وحشی ، جو موشی ، اویارسلام و ارزن دم روباهی به عنوان میزبانان طبیعی MRDV-I شناخته شدند . تمام گیاهان آلوده گونه های مزبور درجاتی از کوتولگی را در مقایسه با گیاهان ظاهراً سالم نشان می دادند . آلودگی به MRDV-I در جو و علف های هرز دائمی چمن ، قباق و مرغ تشخیص داده نشد . آنتی سرم بدست آمده همچنین قادر به ردیابی MRDV-I در تک زنجره های UNKANODES TANASIJEVICI و LAODELPHOX STRIATELLUS بود . زنجرک های با غلظت بالای ویروس در اوایل بهار در مزارع

ذرت ردیابی شدند . با توجه به اطلاعات بدست آمده به نظر می رسد منبع پایداری این ویروس از سالی به سال دیگر زنجرک های ناقل و یا گیاهان دائمی دیگر تیره غلات غیر از گیاهان مطالعه شده در تحقیق حاضر هستند .
واژهای کلیدی : فیجی ویروس ، خالص سازی ویروس ، کوتولگی زبر ذرت ، ذرت ، ناقلین ویروس

مقدمه
بیماری ویروسی کوتولگی زبر ذرت (Maize rough dwarf) اولین بار در سال ۱۹۴۹ در ایتالیا توجه محقیقن را به خود جلب نمود (رجوع شود به conti 1983) .سپس بیماری مشابهی با اسام مختلف در مزارع ذرت فرانسه ، پرتغال ، اسپانیا ، سوئیس ، سوئد و اسرائیل مشاهده گردید (conti 1983) . در ایران بیماری کوتولگی زبر ذرت برای اولین بار در سال ۱۳۶۰ به عنوان یکی بیماری ویروسی در مزارع مختلف ذرت فارس شناخته شد (Izadpanah et al.1983) . میزان آلودگی در مزارع مختلف ذرت طبق یک برآورده مقدماتی در سال ۱۳۶۰ بین صفر و ۳۵ درصد بود . در سال ۱۳۶۲ میزان آلودگی در برخی در برخی مزارع بع ۵۰ درصد نیز می رسید . در سالهای بعد میزان آلودگی به این ویروس کاهش یافت اما از سال ۱۳۸۲ به این طرف ، مجدداً طغیان وسیع آن مخصوصاً در شمال فارس موجب خسارات سنگین شد ، میزان آلودگی بعضی از مزارع از ۸۰ درصد تجاوز کرد و میزان خسارت ناشی از آن به صد درصد نزدیک شد .
عامل بیماری کوتولگی زبر ذرت در کشورهای اروپایی و اسرائیل ویروسی از جنس Fijvirus ( تیره Reoviridae) به نام (MRDV) Maize rough dwarf virus شناخته شده است . دو ویروس دیگر با علائم و مشخصات مشابه در غلات گزارش شده اند ، یکی به نام mal de rio cuarto virus در ذرت از آرژانتین و دیگری به نام (RBSDV) Rice black – streaked virus در برنج از جنوب شرقی آسیا . هر دو ویروس از لحاظ تاکسونومیکی به MRDV نزدیک هستند (Van regenmortel et al .2000) .RBSDV در چین علاوه بر برنج ، ذرت را نیز آلوده کرده و در آن علائم کوتولگی زیر ایجاد می کند (Azuhata et al . 1993) .
در سالهای اخیر یک بیماری مشابه در مزارع برنج استان مشاهده و عامل آن ویروسی از جنس Fijivirus تشخیص داده شد . این ویروس موقتاً بنام کوتولگی گال سیاه برنج (Rice black gall dwarf virus,RBGDV) نامیده شد (kamran et al.2000) . همزمان با طغیان MRDV در شمال فارس ، RBGDV نیز در مزارع برنج به ویژه در حوزه سد درودزن طغیان نموده و موجب نگرانی کشاورزان شد . تعیین رابطه این دو ویروس می تواند نقش موثری در طراحی روش های کنترل بیماری داشته باشد . هدف از تحقیق حاضر مطالعه برخی جنبه های بیولوژیکی و سرولوژیکی MRDV-I از طریق خالص سازی و تهیه آنتی سرم آن و تعیین برخی ویژگی های فیزیکوشیمیایی این ویروس می باشد . قبلاً گزارشی دربار خالص سازی مخدود این ویروس در ایران منتشر شده است (Behjatnin & izadpanah 1991).

روش بررسی
خالص سازی ویروس
برای خالص سازی MRDV-I از بوته های ذرت با آلودگی طبیعی استفاده شد .بوته های جوان با علائم واضح کوتولگی زیر شامل کوتولگی شدید گیاه توأم با راست ایستادن برگ ها و گال ها

ی پشت برگ ( شکل ۱ ) از مزارع باجگاه واقع در ۱۵ کیلومتری شمال شیراز جمع آوری و به آزمایشگاه منتقل شدند . سعی شد که بوته ها فاقد علائم ویروس ها و عوامل بیماریزای دیگر ذرت باشند . خالص سازی از بافت ریشه ذرت طبق روش وتر و همکاران (wetter et al.1969) با تغییراتی انجام گرفت . در هر نوبت خالص سازی ۲۰۰ گرم بافت ریشه پس از شستشوی کامل با آب ، در یک حجم بافر استخراج (۰٫۳ M NA2HPO4 , 0.01 M NA2SO3 , 0.001 M EDTA)همگن سازی شد . به همگنه بدست آمده نیم حجم کلروفوم اضافه و به مدت ۱۰ دقیقه به هم زده شد . پس از سانتریفوژ کردن در سرعت پائین (۴۵۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه ) ، رونشین جدا و به مدت ۹۰ دقیقه در ۲۷۰۰۰ دور در دقیقه در گردان شماره ۳۰ بکمن سانتریفوژ شد . رسوب حاصل در ۲ میلی لیتر بافر فسفات ۰۲/۰ مولار ، ۵/۷ =PH ، حل و به مدت یک شب در دمای C 4 روی بهم زدن مغناطیسی به هم زده شد . پس از سانتریفوژ کردن مخلوط در سرعت کم ، رونشین حاصل روی ستون سوروز دارای شیب چگالی (۶۰-۱۰ گرم سوکروز در ۱۰۰ میلی لیتر بافر ) قرار داده و در گردان SW28 بکمن به مدت ۴۵ دقیقه با سرعت ۲۸۰۰۰ دور در دقیقه سانترفوژ شد . لایه محتوی ویروس از ستون سوکروز جدا و در گردان ۱۰۰ بکمن در ۵۰۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ گردید . رسوب حاصل در ۴۰۰ میکرولیتر بافر فسفات ۰۱/۰ مولار ، ۵/۷ = PH ، حل شد و به عنوان آموده ویروس خالص سازی شده مورد استفاده قرار گرفت .

اسپکتروفتومتری
طیف جذبی ویروس خالص سازی شده در ناحیه ماوراءبنفش با استفاده از اسپکتروفتومتر SPEKOL UV بدست آمد . برای تعیین غلظت ویروس از ضریب جذب ۴ و میزان جذب آموده ویروس در ۲۶۰ نانومتر استفاده شد .
الکترون میکروسکوپی
از آموده های ویروس در مراحل مختلف خالص سازی نمونه هایی تهیه و در الکترون میکروسکوپ Leo 906E مورد بررسی قرار گرفت . به این منظور نمونه هایی روی پولک های مسی یا نیکلی پوشش داده شده با فرموار قرار داده شدند و با یورانیل استات رنگ آمیزی منفی گردیدند .
سرولوژی
آنتی سرم اختصاصی چند همسانه ای MRDV-I به روش هپتون و همکاران (Hampoton et al.1990) تهیه شد . چهار تزریق از آموده تازه ویروس امولسیون شده با آجوانت ناقص با فواصل یک هفته در زیر پوست گردن یک خرگوش انجام گرفت و در هفته پنجم خونگیری به عمل آمد و

سرم جدا گردید . برای جدا کردن ایمونوگلوبولین از آنتی سرم ، از سولفات آمونیوم اشباع شده و کروماتوگرافی در ستون سلولز DEAE طبق روش بال و همکاران (Ball et al.1990) استفاده شد . آزمون سرولوژیکی مورد استفاده در این تحقیق ، الیزای غیر مستقیم (Converse and Martin 1990 ) بود .
الکتروفورز پروتئین و نوکلئیک اسید
به منظور تعیین تعداد و اندازه پروتئین های ساختمانی ویروس از الکتروفورز عمودی در ژل پلی آکریل امید طبق روش لملی (Laemmli 1970) استفاده شد . ژل الکتروفورز از دو قسمت متراکم کننده (۶ درصد) و جدا کننده (۱۲ درصد) تشکیل شده بود . آموده ویروس خالص سازی شده و آموده بدست آمده از گیاه سالم در بافر نمونه (۰٫۰۲۵% , ۰٫۵% ۲-mercaptoethanol , 10% geycerol , 2% SDS , 0.1 M Tris HCL , PH 6.8 bromophenol blue ) به مدت یک دقیقه در آب جوش قرار داده وسپس در ۱۴۰ ولت همراه با پروتئین های نشانگر الکتروفورز شد . آزمون western blot با استفاده از آنتی سرم تهیه شده . در محل طبق روش هماند (Hammond 1990) انجام گرفت . برای تعیین تعداد قطعات ژنوم ویروس از الکتروفورز افقی در ژل آگاروز ۲ درصد در بافر TBE طبق روش سمبروک و همکاران (Sambrook et al.1989) استفاده شد .
ردیابی ویروس در گیاهان و زنجرک ها
برای بررسی امکان ردیابی و تعیین منابع ویروس نمونه هایی از گیاهان مزروعیو غیر مزروعی از مناطق آلوده جمع آوری و پس از ثبت علائم آنها به روش غیرمستقیم الیزا مورد بررسی قرار گرفتند . همچنین زنجرک های Laodelphax striatellus و Unkanodes tanasijevici از مناطق مزبور جمع آوری و بهمان نحو آزمایش شدند . بافت گیاه در پنج حجم بافر و زنجرک ها به تعداد یک تا چهار زنجرک در ۱۰۰ میکرولیتر بافر نمونه همگن سازی شدند . در آزمون الیزا از ایمونوگلوبولین و آنتی بادی ثانویه با غلظت یک در ۳۰۰۰ استفاده شد .

نتیجه و بحث
خالص سازی
برای اولین بار در ایران MRDV-I به مقدرا کافی خالص سازی شد . بدلیل عدم امکان خالص سازی بیولوژیکی MRDV-I از یک سو و مشکلات تکثیر ویروس در شرایط گلخانه از سوی دیگر ، در این تحقیق از بافت آلوده طبیعی برای خالص سازی استفاده شد . معهذا نتایج بدست آمده از آمایش های سرولوژیکی نشان داد که هیچکدام از ویروس ها ی متداول ذرت رد منطقه ، یا در بافت های مورد استفاده وجود نداشتند و یا در جریان ملیات خالص سازی حذف شدند . ویروس موزائیک ایرانی ذرت (IMMV) به دلیل داشتن ناقلین مشترک با احتمال بیشتری تولید آلودگی توأم می کند و همراه با MRDV-I در بوته های ذرت مشاهده شده است . لکن این ویروس تحمل تیمارهای خالص سازی MRDV-I را ندارد . وتر و همکاران (Wetter et al.1969) و میلنی و همکاران (Milne et al. 1973) نیز به دلیل غلظت بالاتر MRDV در آلودگی های طبیعی ، از این نوع بافت ها برای خالص

سازی ویروس استفاده کردند . عملیات خالص سازی ویروس از ریشه تازه ذرت مبتلا به MRDV-I منجر به تشکیل دو لایه اختصاصی به فواصل ۱۵-۱۰ و ۳۵-۲۵ میلی متر از سطح ستون سوکروز شد . از این لایه ها در ستون های بار گذاری شده با آموده گیاه سالم دیده نشدند . باند پایینی پس از تغلیظ ، طیف جذبی نوکلئو پروتئینی داشت ، در حالیکه باند بالایی پس از تغلیظ ، طیفی داد که در آن نقاط کمینه و بیشینه اختلاف چندانی نداشتند . الکترون میکروسکوپی باندهای تشکیل شده ، وجود پیکره های ایزومتریک را در باند پائینی تایید شد . از هر ۲۰۰ گرم بافت ریشه با این روش خالص سازی ۳۷/۲ میلی گرم ویروس بدست آمد . ماهیت باند بالا در ستون شیب چگالی تعیین نگردید .
خالص سازی ویروس ، از برگ و ساقه ذرت و یا بافتهای نگهداری شده در یخچال و فریزر موفقیت آمیز نبود .
در الکترون میکروسکوپی آموده خالص سازی شده ویروس، قطر پیکره های ویروس ۴۸ نانومتر تخمین زده شد . لذا به نظر می رسد که این روش خالص سازی مثل بسیاری از روشهای دیگر منجر به حذف کپسید خارجی ویریون ها شده است . این کپسید در شرایط خارج از سلولی ناپایدار است و به سهولت حذف می شود (Milne et al.1973) .
سرولوژی
آنتی سرم بدست آمده علیه MRDV-I بخوبی و بطور اختصاصی قادر بود ویروس را در گیاه و زنجرک آلوده شناسایی کند . در الیزای غیر مستقیم ، ایمونوگلوبولین جدا شده از آنتی سرم با غلظت ۵۴۰۰ : ۱ ، قادر به ردیابی ویروس کوتولگی زبر ذرت در عصاره گیاه آلوده بود و لذا غلظت ۵۴۰۰ : ۱ به منظور تفکیک بوته های سالم و آلوده غلظتی مناسب تشخیص داده شد . پس از جذب آنتی سرم با عصاره گیاه سالم ، در حالیکه ایمونوگلوبین استخراج شده با آموده خالص MRDV-I و بافت آلوده به ویروس موزائیک کوتولگی ذرت (MRDV) ، ویروس موزائیک ایرانی قیاق (IJMV) ، ویروس موزائیک نیشکر (SCMV) و ویروس موزائیک ایرانی ذرت (IMMV) واکنش ناچیزی داشت .
آنتی سرم تهیه شده قادر بود وجود MRDV-I را در بدن زنجرک هایU.tanasijevici و L

.striatellus تشخیص دهد . تعداد زنجرک های مورد استفاده (۴-۱ در هر چاهک ) اثر بارزی در میزان جذب نداشت .
الکتروفورز پروتئین و نوکلئیک اسید کاردو (Redolfi and Boccardo 1974) نه باند آر.ان.ای دولارا ردیابی کردند . در تحقیق حاضر نه باند کاملاً مشخص اند و یک باند به طور ضعیف در بین دو باند سنگین تر به نظر می رسد . اندازه باند ها تعیین نشد .
در الکتروفورز پروتئین در ژل پلی آکریل آمید چند باند مشاهده شد . لکن در آزمون Western blot تنها سه باند رنگ آمیزی گردید که وزن مولکولی آنها به ترتیب ۱۳۸، ۱۱۹ و ۱۱۳ کیلودالتون بود ( داده ها نشان داده نشده اند ) . این باند ها احتمالاً مربوط به کپسید داخلی هستند و پروتئین های مربوط به کپسید خارجی به علت ناپایداری پیکره ها در حین خالص سازی حذف شده اند . بوکارد و میلنی (Boccardo & Milin 1975) نیز ردیابی سه پروتئین مربوط به کپسید خارجی را مشکل یافته اند .