روش های ورود DNA یه درون سلول

ورود DNA خارجی به سلول و بقای آن، پایه و اساس بیو تکنولوژی است. «تراژن» موجودی است که DNA خارجی دارد. روش های تغییر ژنتیکی، باکتری ها، قارچ ها، جانوران و گیاهان تراژنی را تولید می کنند که در تحقیقات پایه از آن ها استفاده می شود و کاربردهای عملی نیز دارند.
در این مختصر سعی بر این است، روش های ورود DNA به سلول، شامل الکتروپوریشن (منفذ زایی الکتریکی) ، بیولیستیک (تفنگ الکترونی)، میکرواینجکشن (ریز تزریق) و DNA – T اگر باکتریوم و کاربردهای آن ها شرح داده شوند.

تغییر ژنتیکی باکتری
تعدادی از گونه های باکتری به طور طبیعی توانایی جذب DNA را دارند. این توانایی شایستگی طبیعی نامیده می شود که قابل افزایش است. مثلا گونه ای از استرپتوکوکوس ها قابلیت تغییر دارند و زمانی که غلظت سلول ها به حد معینی برسد، این قابلیت، افزایش می یابد. و یا هموفیلوس آنفلونزا زمانی که در شرایط گرسنگی قرار می گیرد، می تو.اند DNA را جذب کند.

گونه هایی از سیانوباکترها نیز وجود دارند که در هر مرحله از چرخه رشدشان، می توانند DNA را جذب کنند.

برای ساختن گونه های تغییر یافته، از تیمارهای مصنوعی استفاده می شود. سلول ها به صورتی آماده می شوند که توانایی جذب DNA را به دست آورند. البته اغلب این دستکاری ها، طول عمر باکتری ها را کاهش می دهند، اما سلول های باکتریایی که زنده می مانند، بهتر میتوانند DNA را جذب کنند.

تغییر ژنتیکی اشریشیاکلی با پلاسمید نو ترکیب، روش مهمی در کلون سازی DNA نوترکیب است. برای ایجاد تغییر ژنتیکی در E.coli ، وسوسپانسیونی از باکتری در محلولی از کلرید کلسیم ۱/۰ مولار وارد می شود و روی یخ قرار می گیرد. پس از آن،ظرف حاوی باکتری به محیط o 42 منتقل می شود. در شرایط کلی ۷ ۱۰×۵ تا ۸ ۱۰ DNA پلاسمید تغییر یافته، به ازای هر میکروگرم پلاسمید به دست می آید. کلرید کلسیم سرد تغییراتی در غشا ایجاد می کند . طی این تغییرات، DNA بهتر به غشا متصل می شود و در شوک حرارتی o 42 ، با مکانیسمی نا معلوم وارد سلول می شود. در حال حاضر، با اصلاح روش های موجود، بیش تر از ۹ ۱۰ پلاسمید تغییر یافته به ازای هر میکروگرم پلاسید، DNA تولید می شود.

DNA ، پس از ورود، برای بقا در سلول ، باید وارد ژنوم سلول و جزئی از آن شود . یا به درون DNA پلاسمیدی که قادر است تکثیر کند، رود و با آن شروع به تکثیر کند. یا آن که در سلول میزبان حمایت شود و باقی بماند.
منفذزایی الکتریکی (ایجاد منفذ در باکتری به وسیلۀ الکتریسیته)
در منفذزایی الکتریکی، سلول های باکتری در محلولی از DNA وارد شده، در معرض میدان الکتریکی با ولتاژ بالا قرار می گیرند. ولتاژ بالا سوراخ های کوچکی در غشای لیپدی سلول ایجاد می کند و در نتیجه، مولکول های کوچک و ماکرومولکول ها می توانند از این طریق وارد سلول و یا از آن خارج شوند. این سوراخ های به وجود آمده در برخی از سلول ها، خود به خود بسته می شوند.

ولتاژی که در منفذ زایی الکتریکی به کار می رود، حدود ۵۰ درصد سلول ها را می کشد . تعدادی از سلول ها نیز به علت بسته نشدن سوراخ ها می میرند. بنابراین سلول هایی که زنده مانده اند، احتمالا تغییر یافته اند. این روش، تغییر ژنتیکی را در تعدادی از گونه های باکتری آسان کرده است و در برخی گونه ها برای اولین بار، امکان تغییر را مهیا ساخته است.

در روش معمول منفذ زایی الکتریکی، سلول های باکتری در آب یا بافری با چگالی ۱۰۱۰× ۵-۱ سلول در هر میلی لیتر (ml) وارد می شوند. در قسمت خاصی از بازار منفذزایی (شکل ۱) ۲۰۰ میکرولیتر از سلول ها با یک نانو گرم تا یک یکروگرم از DNA پلاسمیدی مخلوط می شود و روی یخ قرار می گیرد. ولتاژ بالای الکتریکی برقرار می گردد.میدان الکتریکی معمولی برای منفذزایی الکتریکی باکتری ها از ۲۰ تا ۲۵ کیلو وات بر سانتی متر (KV/cm) متغیر است. مایع ویژه ای برای

رشد سلول ها افزوده شده و آن ها بین یک تا دو ساعت در گرمخانه قرار می گیرند. این کار، برای بیان ژن مقاومت به آنتی بیوتیک که قبلا در DNA پلاسمید وارد شده است، صورت می گیرد. این ژن علامت مشخص ژنتیکی است. سپس باکتری ها روی محیط جامد آگار که دارای آنتی بیوتیک

مناسب است، کشت داده می شوند. باکتری هایی که تغییر یافته اند، و ژن مقاومت به آنتی بیوتیک را کسب کرده اند، زنده مانده و رشد می کنند. باکتری های تغییر نیافته، در اثر آنتی بیوتیک محیط از بین می روند.
با استفاده از روشمنفذ زایی الکتریکی، ۱۰ ۱۰ DNA تغییر یافته، به ازای هر میکروگرم از DNA پلاسمیدی برای گونه های معینی از coli.E مشاهده شده است.
انتقال ژنتیکی سلول های یوکاریوتی

منفذ زایی الکتریکی یوکاریوت ها
منفذ زایی الکتریکی برای تغییر ژنتیکی سلول های جانوری شامل: فیبروبلاست ها، لنفوسیت ها، سلول های عصبی، سلول های اندوکرین، سلول های اولیه جانوری، سلول های کبدی و سلول های پایه خونساز به کار می رود.
میزان فراوانی سلول های تغییر یافته از یک سلول در ۱۰ ۱۰ تا ۱۰۱۰ سلول متفاوت است و به نوع سلول متفاوت است و به نوع سلول و غلظت DNA خارجی بستگی دارد منفذ زایی الکتریکی همچنین برای ورود DNA به پروتوپلاست گیاهی (سلول خهای فاقد دیواره) به کار می رود. بدین منظور، دیواره سلول های گیاهی با آنزیم هضم و حذف می شود.
دیکیسر و همکارانش، در سال ۱۹۹۰ برای بررسی بیان ژن به روش فوق، DNA را به بافت سالم و نمو یافته گیاهان برنج گندم ، ذرت و جو وارد کردند.
مطالعات آن ها نشان داد، بیان گذرایی از ژن ها القا می شود. زیرا که پروتوپلاست ها، از نظر فیزیولوژیکی، با سلول هایی که از آن ها مشتق شده بودند فرق داشتند.

مطالعات بعدی نشان داد، استفاده از قطعاتی از گیاهان به جای پروتوپلاست پاسخ بهتری خواهد داد. لذا محققان برای تغییر ژنتیکی بافت های سالم گیاهی به روش منفذزایی الکتریکی زمیان گرمخانه گدازی DNA با بافت را قبل ازپالس الکتریکی اضافه کردند و پالس طولانی تری نیز به کار بردند. دو اتفاق ممکن است رخ داده باشد: ۱- پالس الکتریکی توانسته است هم در دیواره سلولی و هم در غشای سلولی گیاه شکاف هایی ایجاد کنند. ۲- DNA به طور غیر فعال از میان سوراخ هایی که به طور طبیعی در دیواره سلولی ایجاد شده اند، عبور کرده و پالس الکتریکی فقط غشای سلولی را باز کرده است.

ریز تزریق یوکاریوت ها
ریز تزریق روش دیگری برای وارد کردن DNA به درون سلول های یوکاریوت است. در روش معمول، از سلول های تخمک بارور شده موش استفاده می شود. DNA خارجی با استفاده از میکروسکوپ و دستگاهی به نام میکرومانیپولاتور وارد می شود لوله باریکی که مختصری خلا دارد، کنار سلول تخمک آورده می شود و به علت خلا موجود، سلول به لوله چسبیده و بدین طریقسلول در جای

خود ثابت می شود. سپس با یک سوزن خیلی باریک که قطر خارجی آن یک میکرومتر است، DNA خارجی به سلول تزریق می شود. تقریبا در هر تزریق دو پیکولیتر از DNA با غلظت یک نانوگرم بر میکرو لیتر وارد می شود. اگر حجم خیلی زیادی از ان تزریق شود، هسته ها متلاشی می شوند. تخمک های بارور شده، پس از وارد شدن DNA خارجی به درون آن ها، در رحم مادرهای پرورش دهنده، کاشت می شوند. پس از تولد موش ها، بخشی از دم آن ها بریده و DNA ژنومی از بافت

آن ها استخراج می شود و با روش دور گه سازی DNA وجود DNA خارجی مورد بررسی قرار می گیرد(شکل ۲)
وجود DNA خارجی در موش تراژن باید به طور کامل مشخص شود زیرا DNA تزریق شده ممکن است، در چندین کپی پشت سر هم تنها در یک مکان وارد شود و یا جداگانه و مستقل در دو مکان یا بیش تر قرار گیرد و در جای مطلوب خود وارد نشود.
تغییر بیوبیستیک یوکاریون ها
بیو لیستیک از دو کلمه بیولوژیکال به معنی زیست شناسی و بالیستیک به مفهوم پرتابه شناسی مشتق شده است و ابزاری برای تغییر ژنتیکی گیاهان، جانوران اندامک ها، میکروب های یوکاریوتی و پروکاریوت هاست. این روش در واقع نوعس شلیک DNA به درون سلول است.
سنفورد و همکارانش در سال ۱۹۸۷ اولین تغیر ژنتیکی را به این روش انجام دادند. در این روش، DNA به ذرات کوچک تنگستن متصل شده، سپس با سرعت زیاد به وسیله تفنگی مخصوص به طرف سلول های هدف پرتاب می شودو مولکول های DNA می تواند روی ذرات کوچک تنگستن با قطر ۵/۰ تا ۵ میکرومتر یا روی ذرات طلا قرار گیرند. مخلوطی از ذرات، درون بخشی از ابزار ویژه این

روش، به نام ماکروپروجکتایل قرار داده شد و با سرعت زیاد به سمت هدف شلیک میشود. این وسیله بخشی شبیه سیلندر دارد که پیستون داخل آن قرار می گیرد. در نوع اولیه آن، از فشنگ به عنوان ماکروپروجکتایل و از گوگرد برای شتاب دادن به آن استفاده می شدو صفحه متوقف کننده ای نیز تعبیه شده بود که مانع عبور پروجکتایل ها می شد، در حالی که ذرات می توانستند از سوراخ

های کوچک موجود در صفحه عبور و به بافت هدف اصابت کنند. بافت هدف نیز در خلا قرار داده می شد. اما در نوع پیشرفته آن از یم میدان الکتریکی با گاز فشرده برای شتاب دادن به ماکروپروجکتایل استفاده می شود.