محیط کشت مورد استفاده درکشت بافت گیاهی

ترکیب محیط کشت مورد استفاده در کشت بافت گیاهی مهمترین کلیدی در کشت موفقیت آمیز سلسولها و بافت های گیاهی است. لذا محیط کشت بالینی دارای مواد غیر آلی و آلی دقیقاً تعریف شده باشد و ویژگی های زیر را نیز داشته باشد:
۱ ) مواد غذایی لازم برای زنده ماندن سلولها، بفت ها و اندامهای کشت شده را داشته باشند ؛
۲ ) دارای شرایط مطلوب فیزیکی PH ، فشار اسمزی و غیره باشد.

درکشت سلول ها و بافت های گیاهی اولین بار فرمول اپتیم محیط کشت مناسب کشت درون شیری در سالهای چندی معرفی شد. کنوپ (Knop) در سال ۱۸۶۵ محلول مواد معدنی را که به طور گسترده ای توسط محققین قدیمی مورد استفاده قرار می گرفت فرموله گردید. گوتره ۱۹۳۹ ، محیط کشت مورد استفاده برای کشت کالوس را از محلول غذایی uspenskaia , uspenski 1925 ،به دست آورد.

مطالعه علمی موردنیاز مواد معدنی مورد استفاده در کشت بافت و اندامهای گیاهی در سال ۱۹۶۲ ، توسط موراشیگ و اسکوگ صورت گرفت و دنبال آنرا دانشمندانی مثل Bkooy , Linsmaier 1965 ، Hidedrant , Vasil 1966 ، و Nitsch , Nitsch 1969 ، پی گیری کرده و توانستند محیط های کشت مناسبی را معرفی نمایند.

مواد مغذی Nutrients :
محیط کشت پایه استاندارد شامل مخلوط متعادل ماکرو المانف و میکروالمان تا (معمولاً املاح کلره، نیتراتیف سولفات، فسفات و یدید کلسیم، منیزیم، پتاسیم، سدیم، آهن، روی و … می باشند) همچنین منابع کربن، ویتامین، فیتوهورمن ها و مواد افزودنی آلی هستند. مواد مذکور در بالا، بعضی ها استفاده شان ضروری بوده و بعضی اختیاری (Optronal) ترکیبات ضروری شامل مواد غذایی غیرآلی و مواد غذایی آلی مانند کربوهیدراها به علاوه فیتوهورمون ها ویتامین ها می باشد.
محیط کشت مورد استفاده برای کشت سلول، بافت و ….
محیط کشت مورد استفاده برای کشت درون شیشه ای سلول های گیاهی دارای سه جزء اساسی زیر است :

۱ ) عناصر ضروری، یا یون های معدنی تکمیل شده به صورت مخلوط کمپلکس املاح ؛
۲ ) مکمل های آلی تکمیل شده با ویتامین، اسیدهای ؛
۳ ) منبع کربن تثبیت شده که عمدتاً با ساکارز تامین می شود.
بیوتکنولوژی :
تشکیل علم بیولوژیک مثلاً از گندم و از آن خمیر بعد نان تهیه می شود. علم زیست در کنار بیوتکنولوژی قرار گرفته مثل هاست که اول شیر بعد مایه ی ماست تهیه می شود و حاصل این علم می باشد.
علم بیوتکنولوژیک راجب درخت را توضیح داده و از قسمتهای تشکیل شده و موقعیت کشت بافت آن کجاست؟ ساقه ای از درخت در واقع کشت بافت می باشد.

قسمتی از گیاه به نام (explant) جدا کردن بریده شده از یک گیاه
هدف کشت بافت :
قسمتی از گیاه استریل شده را در محیطی که مناسب قرار داده و در داخل گلخانه کشت می گذاریم با گل موردنظر برسیم.
ضعف های قدیمی :
شیشه ای invivo و داخل شیشه invitro به کشت بافت به صورت invitro می باشد.
تنها راهی که برای بیماریهای عاری از بیماری می باشد روش invitro می باشد.
رسیدن به یک گیاه عاری از ویروس به چند روش می باشد؟
۱ ) کشت هر سیستم : به خاطر میکرو ویروس سرعت تکثیر بیشتر اکسین ها غلظت بالایی دارند. آوند ارتباط قطع می شود – اکسین در هر سیستم بیشتر از جاهای دیگر می باشد.
۲ ) شی درمانی.

۳ ) ترموتراپی یا حرارت درمانی – حرارت بالا و حرارت زنده و عامل ویروس بیماری را از بین می برد.
۴ ) تولید کالوس و کشت آن.
۱ ) به وسیله سبزی کاری کارهایی می توان انجام داد : از آن سلول به دست می آید و سلول تعداد زیادی که از آن پروتوپلاست گرفته می شود و این پروتوپلاست هم می تواند در کنار هم قرار بگیرند و ترکیبی از سلولهای احتراج پرتوپلاست می باشد.
۲ ) ریز ازدیادی : قسمتهای مختلفی از گیاه را تکثیر کرده که به آن رنیز ازدیاد می گویند.
۳ ) حفظ رژم پلاسم و مبادله بین المللی : مثل قطعه و دانه و در واقع ترکیب ژنتیکی مثل جریان انباری می باشد که دو تکنیک دارد :
– کوتاه مدت slowgrowth

– بلند مدت ergoreser vation
شدت نور باعث بسته شدن کلاله در گوجه می شود و گرده افشانی دچار مشکلاتی می شود آمار موجود در کتابها به سال ۱۹۹۶ ، می باشد که طبق این آمار جمعیت کمتر از ۶ میلیارد می باشد کمتر از ۵ سال جمعیت ۲ برابر می شود. در این صورت محصولات کشاورزی را باید افزایش داد تا الگوی نیاز مردم باشد جمعیت به صورت متصاعدی افزایش می یابد در نتیجه با مشکل روبه رو می شویم. از ۱۹۸۰ تا ۱۹۹۴ جمعیت جهان و نرخ رشد جمعیت درصد افزایش شاغل در جمعیت مورد محاسبه قرار می گیرد.
سال منطقه جمعیت نرخ رشد سالیانه برحسب درصد
۱۹۸۰ دنیا ۴۴۴۷ ۸/۱%
۱۹۸۰ توسعه یافته ۱۱۷۰ ۸%
۱۹۸۰ درحال توسعه ۷۷/۳۲ ۲/۲

۱۹۹۲ دنیا ۸۰/۵۴ ۷/۱

تعداد سالهای که جمعیت ۲برابر می شود درصد جمعیت شاغل در کشور
۳۹ ۵۱%
۸۸ ۱۳%
۳۲ ۶۶%
۴۱ ۴۶%

سال منطقه

۱۹۹۲ توسعه یافته ۱۲۷۰ ۷/۰ ۱۰۰ ۸%
۱۹۹۲ در حال توسعه ۴۲۱۰ ۱/۲ ۳۳ ۵۹%
۱۹۹۴ دنیا ۵۶۳۰ ۵/۱ ۴۶ ۴۵%
۱۹۹۴ آفریقا ۷۰۸ ۸/۲ ۲۵ ۶۱%
۱۹۹۴ آمریکای شمالی ۴۴۹ ۳/۱ ۵۳ ۱۰%
۱۹۹۴ آمریکای جنوبی ۳۱۴ ۷/۱ ۴۱ ۲۱%
۱۹۹۴ آسیا ۳۳/۳۶ ۳ ۶/۱ ۵۷%
۱۹۹۴ اروپا ۶/۵ ۲۶/۰ ۲۶۹ ۸%
۱۹۹۴ اقیانوسیه ۲۸ ۵/۱ ۶/۴ ۱۵%

جمعیت دنیا و کشورها و زمین ها کلی و قابل زراعت.
کشور جمعیت ۶ ۱۰ زیر کشت کلی
جهان ۵۴۸۰ ۱۳۰۴۲ ۱۳۴۷ ۲۸/۲ ۲۵/۰
توسعه یافته ۱۲۷۰ ۵۴۵۵ ۶۴۴ ۳۰/۴ ۵۱/۰
استرالیا ۱۸ ۷۶۴ ۴۷ ۴۴/۴۲ ۶۱/۲
کانادا ۲۷ ۹۲۲ ۴۶ ۳۴۱۵ ۷۰/۱

فرانسه ۵۷ ۵۵ ۱۸ ۹۶% ۳۲/۰
آلمان ۸۰ ۳۵ ۱۲ ۴۴/۰ ۱۵/۰
ایتالیا ۵۸ ۲۹ ۶ ۵۰/۰ ۱۵/۰
ژاپن ۱۲۴ ۳۸ ۴ ۳۱/۰ ۳/۰
هلند ۱۵ ۴/۳ ۸/۰ ۲۳/۰ ۶/۰
لوئیس ۷ ۴ ۴/۰ ۵۷/۰ ۶%
انگلستان ۵۸ ۲۴ ۶/۶ ۴۱/۰ ۱۱/۰
آمریکا ۲۵۵ ۹۱۷ ۱۸۶ ۶۰/۳ ۷۳/۰
کشور در حال توسعه ۴۲۱۰ ۷۵۸۷ ۷۰۳ ۸۰/۱ ۱۷/۰
شیلی ۱۴ ۷۵ ۴ ۳۶/۵ ۲۹/۰
چین ۸۸/۱۱ ۹۳۳ ۹۳ ۷۹/۰ ۸%
مصر ۵۵ ۱۰۰ ۲ ۸۲/۱ ۴%
هندوستان ۸۸۰ ۲۹۷ ۱۶۶ ۳۴/۰ ۱۹/۰
اندولزی ۱۹۱ ۱۸۱ ۱۶ ۶۵/۲ ۸۰/۰
ایران ۶۲ ۱۶۴ ۱۴ ۶۵/۲ ۲۳/۰
مکزیک ۸۸ ۱۹۱ ۲۳ ۱۷/۲ ۲۶/۰

۱۱۶ ۹۱ ۳۰ ۷۸ ۲۶/۰
فیلیپین ۶۵ ۳۰ ۵ ۴۶/۰ ۷۰/۰

هاپلوئیدها عقیم هستند.
ریز ازدیدادی به صورت انبوه صورت می گیرد.
منظور از املاح نباتات :
۱ ) ایجاد تنوع :
– وارد کردن
– دورگ گیری
– کشت بافت (جنسی سلولهای غیرجنسی )
۲ ) سکلسیون (انتخابی )

۳ ) آزمایشات
۴ ) تکثیر.
مراحل کشت بافت :
۱ ) وجود گیاه مادری ؛
۲ ) جدا کردن ریز نمونه (explant) از گیاه مادری ؛
۳ ) کشت در محیط کشت (medium, mediam ) ؛
۴ ) محیط کشت احتیاح به یک سری مواد مختلف و وسایل دارد ؛
۵ ) نگهداری کشت ها در شرایط مناسب توسط نور، حرارت، هوا ؛
۶ ) تولید ریشه، انتقال خاک .
گیاه مادری در کجا قرار دارد؟
مزرعه ، گلخانه، آپارتمان، آزمایشات، درون شیشه
دانشمندان بررسی کردند اگر گیاه را در دماهای ۳۷ تا ۴۶ درجه قرار دهیم شرایط و عوامل نامناسب محیطی از بین می رود.

وسایلی که برای جدا کردن استفاده می شود باید توسط حرارت خشکف حرارت مرطوب که آون برای حرارت خشک می باشد ضدعفونی گردد. برای حرارت مرطوب از اتوکلاو استفاده می شود.
هدف از تاسیس آزمایشات کشت بافت از نظر شما چیست؟
آزمایشات کشت بافت از چه قسمتهایی تشکیل شده؟ یکی از این قسمتها دارای :
۱ ) محلی برای شستشو و نگهداری می باشد ؛

۲ ) محل و تأسیسات برای تهیه محیط کشت استریل کردن و نگهداری ؛
۳ ) حمل برای انتقال و دست خالی برای استریل ؛
۴ ) اتاق کشت یا انکوباتور برای نگه داری کشتها در شرایط کنترل شده ؛
۵ ) محل برای مشاده و جمع آوری اطلاعات.
حتماً باید ظرف شویی باشد آب زیاد باشد و آب سرد و گرم وجود داشته باشد. آب مقطر طرح های پلاستیکی یا استیل، حمام های گرم، انواع پیپت ها، بررسی ها که شیشه ها را بشوید، کابینت ها برای نگهداری وسایل، ظروفی که مواد زائد را در داخل آن بیندازیم، سطل زباله، تمیز کردن و شستن ظروف آزمایشگاهی.

کسانی که در آزمایشگاه کار می کنند حتماً باید واکسینه شوند. دمای آب ۷۰ درجه سانتیگراد به مدت ۵ الی ۱۰ دقیقه خیس کرده و ۵ دقیقه در آب گرم و ۳ دقیقه در آب مقطر و در نهایت آب تمیز شده که هیچ نوع املاحی نداشته باشد. ظروف پلاستیکی که به دو صورت یکی یکبار مصرف و دیگری شیشه ای می باشد.

 

انواع اتوکلاورهای جدید از اینترنت :
که باید آنها را خوب شسته و چند بار از آنها استفاده می شود.
از ظروف پلاستیکی استفاده می شود دارای چه خصوصیاتی باشد؟
۱ ) باید آنها را آب کشی کنیم مثل الکل، استون، متیل کرومات استفاده شود و در مقابل مواد مقاومت داشته باشد ؛
۲ ) گاهی برای شستن و جوشاندن از محلول رقیق که جنس آنها پلی کربنات، پلی اتیلن، پلی اکتیو استفاده شود. اسید نیتریک به مدت ۸ ساعت بعد از شستن پایه خشک و نگهدا

ری شوند.
۲ ) اتاق محیط کشت :
در این اتاق چه کارهایی باید انجام داد، و چه ظرف و ظروفی در این اتاق وجود دارد؟
بعضی مواد باید در یخچال نگهدرای شود، باید از ترازهای حساس استفاده کرد، دسترسی به دستگاه هایی مانند همزن، ماکروویو، وجود دستکش های ضخیم، ساعت های زنگ دار برای مدت معین، وجود اتوکلاو در انواه مختلف باشد.
استریل کردن، ضدعفونی کردن :
هر نوع باکتری که دراین مواد داریم باید آنها را دور کنیم که این مواد چه دارای بیماریباشد و یا نباشد ضدعفونی شود مثل مایعات و جامدات.
چه روشهای برای استریل کردن وجود دارد؟
روشهایی که برای استریل کردن می باشد :
۱ ) روشهایی فیزیکی سه روش فردی دارد که یکی از آنها حرارت heat ، مثل آب جوشیدن؛
۲ ) فیلتراسیون برای تمیز کردن استفاده می شود. از فیلترهایی که اضافه آنها کوچکتر از عوامل پاتولوژیکی باشد حرارت ۷۵/۰ تا ۳/۰ یکی از دلایل این است که خاصیت خودشان را از دست نمی دهند استفاده می کنند ؛

۳ ) پرتوتابی Irri diatiang ، این اشعه خاصیت ضدعفونی کننده دارد وبرای چشم مضر می باشد.
۲ ) روشهای شیمیایی :
ساده ترین شوینده ها مثل صابون، وایتکس، الکل سفید، و جیوه، کلسیم و هیپوکلرید و …
با استفاده از عوامل فیزیکی که یکی از آنها حرارت مثل مایعات بیشتر مطرح می شود که یک نوع استریل و عقیم سازی dioin fect می باشد که برای از بین بردن میکروآگار نیز مها که حرارت خشک و حرارت مرطوب که باید از دو دستگاه به نام آون و اتوکلاو استفاده میشود که آون حرارت خشک می باشد.
حرارت به چه صورتی باعث نابودی میکروترتا نیزها می باشد ؟

یکی از حالت ها به صورت لخته می باشد و حالت دیگر به صورت تجزیه شدن و به هم خوردن آن سیستم یا آنزیم می باشد.
چه عوامای در این حرارت دخالت دارد؟
دما، زمان، میکروارگانیزم ها، تعداد آنها. هرچه قدر مقدار حرارت تنظیم شده بالاتر باشد مدت آن کمتر می شود و بالعکس.

۱ ) شرایط لازم برای کاشتن ارگانیزیم ها در حرارت مرطوب :
ارگانیزم مرحله رشد رویش مرحله تولید اسپور
مخمر geast min 50 حرارت –C 50 تا ۶۰ min 5 – C 70 تا ۸۰
کپک mold min 30 حرارت –C 62 min 30 – C 80
باکتری ها min 10 حرارت –C 70 تا ۶۰ min 2 به بالا – C 60
ویروسها min 30 حرارت –C 60 min 5/0 تا ۱۲ دقیقه– C 121

 

آیا می توانیم زمان آنها را زیاد کنیم یا نه؟ زمانی که خطری برای ما نداشته باشد. فیلترها ۹۹/۹۹ که به آنها فیلترهای HEPA می گویند. یکی از روشهای ضدعفونی کردن استریل کردن هوا می باشد.
انواع استریل :
۱ ) استریل با روش پرتوتابی ؛
۲ ) استریل تجهیزات و لوازم :
یکی از دلایل آلودگی خودمان می باشیم، که آلودگی را ایجاد می کنیم در

کشت بافت مسئله مهم محیط کشت که شامل مایع و جامد یا فرم های استریل می باشد و وسایل موردنظر چاقو و پیپت و … می باشد.
۳ ) استریل با حرارت خشک :
تحت عنوان آون می باشد حرارت بین ۱۶۰ تا ۱۷۰ درجه به مدت ۲تا ۳ ساعت میباشد.
از خصوصیات حرارت خشک :
یک روند کند را طی می کند و اشکال دیگر از چیزهای که نسبت به حرارت مقاوم باشد استفاده می شود.
استریل کردن محیط کشت tool steqviments :
1 ) دستگاه اتوکلاو که مثل زودپز عمل می کند اتوکلاو را در ۱۲۱ درجه حرارت و ۳/۱ کیلوگرم یا بین psi 20 – ۱۵فشار را تنظیم می کنیم.
۲ ) فیلتر.
حرارت مرطوب :
دمای جوش آب یا بخار آزاد می تواند بالای ۱۰۰ درجه هم باشد. حرارت ۱۳۲ – ۱۲۱ و بخار اشباع و فشار psi 15 تنظیم کرده مایعی که می خواهیم استفاده کنیم استریل شود باید به حجم آنها نگاه کرد.
حجم محیط کشت در هر میلی لیتر حداقل زمان برحسب اتوکلاو دقیقه
cc 25 cc 20
cc 50 cc 25
cc 100 cc 28
cc 250 cc 31
cc 500 cc 35
cc 1000 cc 40
cc 2000 cc 48
cc 4000 cc 63

Marashige skoog (D62) : MS در توتون جواب خوبی گرفته اند.
در کشت بافت مناسب ترین روش MS می باشد که خیلی با ارزش بوده است.
خصوصیات ارزش MS در کشت بافت :
املاح بالا دارند مثل سدیم و پتاسیم.
wpm : گیاهانی هستند که با انواع مختلف در کشت بافت شرکت می کنند Gamborg (B5) برای کشت کالوس در گیاه سویا این محیط کشت باستی در مقابل MS قرار بگیرد تا از نیترات کمتری برخوردار باشد بنابراین هدف اولیه دانشمندان برای کشت تولید کالوس باشد.
از کالوس می توانیم مستقیم تولید جنس و سلول کنیم. و از سلول می توانیم تولید پرتوپلاست کنیم و بعد برای سوسپانسیون سلولی که در آب شناور هستند استفاده کرد. در سال ۱۹۷۲ دانشمندی به نام Hilder brandt , schenk (SH) در گیاهان همان دو لپه و تک لپه برای کشت کالوس و تولید آن استفاده می کنند.
ریز نمونه : – کالوس – جوانه – جنین
در سال ۱۹۶۲ دانشمندی به نام white یک محیط کشت تعریف کرد که محیط کشت گوجه فرنگی که ریشه های آن را کشت کرد و فرق آن با دانشمند بالای ارزش بیشتری دارد. Nitsch ، کشت بساک استفاده کرد که بساک پرچم ها را در نظر گرفته که در داخل آنها دانه گرده وبه ازای هر

دانه گرده یک گیاه می باشد. غلظت املاح نسبت به white , MS متوسط لازم داریم.
MS در افراد چه نقشی دارد؟
اجزای محیط کشت : ژنوم، محیط اطراف، اجزای محیط کشت، کنترل محیط کشت.
محیط کشت شامل چه چیزهایی است ؟
۹۵% آب، تناسب ماکروالعانت، عناصر میکروالمانت، مواد تنظیم رشد، ویتامین ها، قندها.
مواد تنظیم کننده و هورمون چه فرقی دارد؟
هورمون یعنی موادی که توسط انسان یا گیاه ساخته می شود یعنی مواد درون زا و بیرون زا، مواد تنظیم کننده موادی که مصنوعی هستند و آزمایشگاهی هستند هورمون ها به صورت تنظیم کن

نده و هورمون باشد.
هورمون اکستین (IAA) که در خود گیاه ساخته می شود IBA هورمون می باشد. NAA تنظیم کننده می باشد.

خصوصیات موادی که در محیط کشت استفاده می شود چیست؟
۱ ) مواد غذایی که در محیط کشت تهیه می شود بایستی برای سلول، بافت، اندام کافی باشد ؛
۲ ) از نظر شرایط فیزیکی مثل PH محیطکه درونی گیاه قرار دارد یا گاهی فشار اسمزی که در شرایط وجود نداشته باشد گیاه نمی تواند زنده بماند. که برای داشتن پروتوپلاست باید فشار اسمزی داشته باشیم.
اولین محیط کشت برای شرایط درون شیشه ای که چندین سال می گذرد که از سال ۱۹۳۵ تا ۱۹۳۹ استفاده می کرد.
جدول ) بعضی از عناصر مهم تغذیه گیاهی و وظایف فیزیولوژیکی آنها از این عناصر برای تامین رشد و سلامتی گیاهان به روش این وتیرو استفاده می شود.
نام عنصر وظایف

ازت جزیی از پروتئین اسیدهای نوکلئیک و کوآنزیم های است این عنصر به مقدار زیاد مورد نیاز است.
پتاسیم تنظیم کننده پتانسیل اسمزی، کالتولی غیرآلی اصلی در غشاء انجام وظیفه می کند. در علامت دهی سلول نقش سنتز دیواره سلول دارد.
کلسیم سنتز دیواره سلول
منیزیم کوفاکتور آنزیم، جزیی از کلروفیل جزیی از کلروفیل.
فسفر جزیی از اسیدهای نوکلئیک بوده، در انتقال انرژی نقش داشته در تنفس و فتوسنتز جزیی از وساطت را عمل می کند.

گوگرد جزیی از اسیدهای آمینه (میتولین، اسنتین) بوده و کار بعضی از کوفاکتورها را انجام می دهد.
کلر برای فتوسنتز ضروری است
آهن انتقال الکترون را به صورت جزیی از سیتوکروم عمل می کند.
منگنز کوفاکتور آنزیم است
کبالت جزیی از بعضی از ویتامین ها است
مس کوفاکتور آنزیم، در واکنش های انتقال الکترون نقش دارد
روی کوفاکتور آنزیم، بیوسنتز کلروفیل
مولیبدون کوفاکتور آنزیم، جزیی از نیترات ردوستاژ

برای استفاده هایی عملی عناصر ضروری را دوباره به صورت زیر تقسیم می کنند :
الف ) ماکروالمان ها ؛
ب ) میکروالمان ها ؛
ج ) منبع آهن.

برای انجام کشت بافت و سلول و … از فرمول ذکر شده در جدول زیر استفاده می شود.
اجزاء محیط کشت :
برای سهولت کار بهتر است اجزاء هر محلول پایه را به صورت انفرادی در آورده و بحث نمود :
ماکروالمان ها :
همانطوری که از نام این گروه بر می آید

، محلول پایه stock solution تهیه شده با این عناصربه مقدار زیادی لازم هستند تا گیاه بتواند رشد و نمو کند. ازت، فسفر، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، و گوگرد ( و کربن که به طور جداگانه اضافه می شود ) عموماً جزو ماکروامان ها در نظر گرفته می شوند. معمولاً این عناصرلااقل از درصد وزن خشک گیاهان را تشکل می دهند.