مروري برفرآيند ساخت واكسن و نقش حيوانات آزمايشگاهي
در ارزيابي آن

سپاسگزاري
بدين وسيله از مساعدت هاي بي دريغ جناب آقاي قاسمي مسئول كتابخانه دانشكده دامپزشكي دانشگاه آزاد اسلامي واحد كرج كمال تشكر و قدرداني مي نمايم.

مقدمه
ازاولين تلاش علمي بشر براي پيشگيري از بيماري عفوني به وسيله ايمن سازي بدن كه توسط Edward jenner در سال ۱۷۹۰ صورت گرفت،‌تاكنون واكسيناسيون به يكي از مهم ترين ركن هاي پيشگيري از بيماري عفوني به خصوص آن هايي كه توسط ويروس ها ايجاد مي شوند تبديل شده است(۷) در قرن هجدهم لويي پاستور براساس مشاهداتي كه روي طرز انتقال بيماري وباي مرغان و پيشگيري اتفاقي آن با تزريق كشت كهنه ي عامل بيماري داشت، اولين واكسن تخفيف حدت يافته را عليه بيماري شاربون (سياه زخم) وسپس هاري توليد كرد(۲)

محققان اولين واكسن DNA نوتركيب را بر ضد هپاتيت B درسال ۱۹۸۶ بهسازي كردند(۷)
سابقه واكسناسيون نوين در ايران به اوايل سلسه اي قاجاريه يعني پادشاهي فتحعلي شاه باز مي گردد كه در سال ۱۲۴۵ به دستور عباس ميرزا نايب السطنه ايران، لشگر او توسط پزشكان انگليسي درتبريز آبله كوبي شد، و در ادامه به دستور ميرزا تقي خان به تمام ايران تعميم داده شد(۱) با انجام واكسناسيون جهاني در سال ۱۹۷۰ بيماري آبله ريشه كن شد. به دنبال اين دستاروردها توليد واكسن به خصوص درقرن بيستم سرعت يافت به طوري كه امروزه بيش از ۵۰ نوع واكسن دردامپزشكي و پزشكي توليد و مصرف مي شوند. كه اين رقم تنها شامل واكسن هاي باكتريايي و ويروسي مي باشد. با توجه به توليد انواع ديگري از واكسن عليه بيماري هاي انگلي و تك ياخته اي (مانند كوكسيديوز طيور، تيلريوزگاو) اين رقم بيشتر نيز خواهد بود(۷) كه البته تمام اين دستاوردها ارتباط غير قابل انكاري با حيوانات آزمايشگاهي وانجام آزمايش هاي كنترلي بر آن ها دارد.
با توجه به اهميت واكسن ها در طب نوين و لزوم افزايش آگاهي در اين مقاله به مروري بر روند توليد واكسن ها و كنترل كيفيت آن ها و نقش حيوانات آزمايشگاهي در اين روند پرداخته مي شود كه البته به علت گستردگي علم واكسن شناسي تنها به واكسن هاي باكتريايي ويروسي اشاره مي شود.

توليد و بهسازي:
هدف از توليد واكسن فراهم كردن محصولاتي با كيفيت بالا به منظور

ايجاد ايمني اختصاصي است كه به دنبال تجويز آن واكنش مضر وجدي ايجاد نشود.
به طور كلي اغلب واكسن هاي موجود منشأ باكترياي يا ويروسي دارند و تغييرات ايجاد شده روي آن ها اكثراَ شامل غير فعال سازي تا تخفيف حدت خود ميكروارگانيسم حاد يا تركيبات آن مي باشد در مواردي هم برحسب نياز سويه هاي غير حاد (مانند واكسن يا لاسوتا عليه بيماري نيوكاسل طيور) استفاده مي شود.
توليد و بهسازي محصولات جديد يكي از مهم ترين مراحل تحقيقات واكسن است تا چندي پيش بيشتر توجهات روي بيماري هاي باكتريايي و ويروسي بود ولي اخيراَ پيشرفت هاي علمي افق هاي باز ديگري را گشوده است و در حال حاضر واكن هاي متعددي به منظور كنترل بيماري هاي تك ياخته اي و انگلي استفاده مي شود.

امروزه واكسن هاي زيادي از جمله واكسن هاي Subunit و واكسن هاي فراوري شده بامهندسي ژنيتيك توليد و بهسازي شده اند شيوه هاي بهسازي واكسن هاي جديد بسيار متغير است و بر حسب انواع ويروس يا باكتري متفاوت است. معمولاَ براي انتخاب مواد اوليه، فرمولاسيون، ايجاد تثبيت فرمول و تعيين روش و دفعات تجويز واكسن به حيوانات آزمايشگاهي نياز است(۷) به طور كلي براي بهسازي يك واكسن نياز به تحقيقات گسترده اي روي حيوانات است، اگر جه اين نياز هميشگي نمي باشد در حال حاضر وجود يك حيوان تحقيقاتي مناسب براي تحقيقات آسيب شناسي و ميكروب شناسي اهميت بسيار دارد.
موش اولين گونه حيواني بود. كه در توليد واكسن از آن استفاده شد(۷) البته حيوانات آزمايشگاهي بيشتر در كنترل كيفيت محصولات نقش دارند تا توليد. به خصوص در توليد واكسن هاي باكتريايي نقش آنها فرعي مي باشد و تنها گاهي براي تهيه محيط كشت به محصولات حيواني مثل سرم و يا خون مورد نياز است ولي شرايط در مورد واكسن هاي ويروسي متفاوت است. و براي تهيه كشت سلولي اوليه كه به طور مستقيم از حيوانات منشاء مي گيرد از آن ها استفاده ميشود. به دنبال جايگزيني كشت هاي اوليه با محيط Subculture cell

(مثل: سلول هاي تترادبراي فلج اطفال) تعداد حيوانات مورد نياز براي توليد واكسن به تدريج كاهش يافته است(۵)
درمورد واكسن هاي انساني قبل از آزمايشات كلينيكي روي انسان بايد يك مدل حيواني مناسب طراحي شود، كه نتايج حاصله با داده ها و اطلاعاتي كه در مورد انسان موجود است مقايسه شود.
اين داده ها معمولاَ بر اساس نتايج آزمايشاتي است كه واكسيناسيون بر روي يك جمعيت بزرگ تحت شرايط كنترل شد اجرا شده باشد(۲)

۳- مراحل توليد واكسن باكتريايي
۱)اولين مرحله توليد واكسن هاي باكتريايي تعيين ماده اوليه يا همان سويه باكتري است كه معمولاَ اين سويه ها سال هاست براي مقاصد توليدي مورد استفاده قرار گرفته اند.به همين منظورسويه درون نيتروژن مايع يا به صورت يخ خشك در محيط بدون آب فريز شسده و ذخيره مي گردد تا به عنوان يك منبع ثابت ماده اوليه هميشه دردسترس باشد كه به آن Seed lot مي گويند. براي هر سري توليد(batch) نمونه ميكروارگانيسم از Seed lot گرفته شده و در محيط هاي اختصاصي جامد يا مايع كشت داده مي شود. پس از طي دوره لازم، حاصل كشت هاي باكتريايي يا مايع كشت هاي حاوي سموم باكتريايي جمع آوري مي شود كه به آن Bulk واكسن خام گويند. چون اين

محصول معمولاَ با ترشحات باكتريايي و يا تركيبات و اجزاي محيط كشت آلوده است و مهمتر اين كه غلظت پادگني پايين دارد. مرحله بعد شامل تغليظ و تخليص آن مي باشد.
در مورد واكسن هاي كشته فرايند غير فعال سازي كه اغلب با فرمالين انجام مي شود در همين مرحله است در صورت لزوم، افزودن ماده ي ياور ايمني به واكسن نيز در همين مرحله صورت مي گيرد. محصول اين مرحله بالك پالايش شده يا توكسوئيد پالايش شده نام دارد. مرحله آخر پروسه توليد، پركردن آمپول ها يا ويال هاي واكسن با ذز مناسب مي باشد كه به آن ها Final lot مي گويند كه در صورت لزوم آن ها را در محيط بدون آب فريز مي كنند (ليوفيليزه)(۶)(۵)
seed lot را سويه باكتريايي يا ويروسي كه در master seed lot استفاده مي شود، اين سويه از طريق پيشينه تاريخي كه شامل اطلاعاتي در مورد منشأ سويه و كاربردهاي بعدي آن است

شناخته مي شود هيچ ميكروارگانيسمي غير از سويه بذر نبايد در seed lot وجود داشته باشد.
مراحل توليد واكسن هاي ويروسي بسير شبيه به توليد واكسن هاي باكتريايي مي باشد.
دراين جا هم با مراحل و واژه هاي Seed lot (بذر اوليه)، تغليظ و پالايش سوسپانسيون، بسته بندي و به دنبال آن فريز كردن در محيط فاقد آب و خشك كه به منظور افزايش تاريخ انقضاء واكسن

در بسيار از واكسن هاي ويروسي انجام مي شود مواجه هستيم. با وجود اين، تفاوت هايي هم در اين ميان وجود دارد. واژگان ديگري هم در مورد فرايند توليد واكسن ويروسي به كار مي رود مانند سوسپانسيون ويروسي. (مثل: واكسن غير فعال فلج اطفال و هاري) به كار گرفته مي شوند. اين در حالي است كه در واكسن هاي زنده(مانند واكسن فلج اطفال (خوراكي)،سرخك و اوريون و برونشيت عفوني) كه ويروس واكسن پس از تجويز در بدن فرد همچنان تكثير خواهد كرد، نياز به مقدار كم تري ويروس مي باشد(۵)

 

كنترل كيفيت:
كارخانه هاي توليد كننده واكسن با انتخاب مواد اوليه مناسب و استاندارد سازي روش هاي توليد و براي توليد محصولات با ثبات و كيفيت بالا تلاش و رقابت زيادي مي كنند، با وجود اين كنترل كيفيت، يكي از مهم ترين مراحل فرايند توليد مي باشد و كوتاهي در آن مي تواند عواقب فاجعه آميزي را در پي داشته باشد، براي مثال در سال ۱۹۰۱ به دنبال مصرف آنتي توكسين ديفتري كه از سرم اسب آلوده به باسيل كزاز تهيه شده بود، ۱۳ كودك به علت كزاز مردند(۷) و در سال ۱۹۵۵ به دنبال

واكسيناسيون با واكسن فلج اطفال ۷۹ مورد بيماري گزارش شد كه به علت كافي نبودن ارزيابي بي خطري واكسن استفاده شده، ۷ تا از ۱۷ batch عوامل متفاوتي مي توانند در توليد يك batch واكسن دخيل باشند مانند مواد بيولوژيك . و همچنين فرايند توليد كه مي تواند بسيار پيچيده باشد. بنابراين هر batch توليد شده ممكن است با ديگيري متفاوت باشد و كنترل كيفيت بايد بر روي هر

batch به تنهايي صورت گيرد.(۵) كنترل كيفيت هم در مورد batch خام و هم در مورد batch پالايش شده، چه در حين توليد (in- process control) وچه در آخر فرايند توليد در خلال مرحله پاياني آن لازم و ضروري است .(۵)
حيوانات آزمايشگاهي هنور به عنوان اصليترين شاهد در تشخيص فعاليت هاي مطلوب و غير مطلوب batch هاي واكسن هاي توليدي مي باشند(۷و۵) و نوع ماده ي اوليه واكسن و فرم ارائه آن (واكسن تخفيف حدت يافته، توكسوئيد، كشته، غيرفعال يا سويه هاي كم حدت) تعيين مي كند كه آزمايشات و به ويژه نوع سيستم invivo به چه نحوي بايد اجرا شود. به طور كلي كنترل كيفيت شامل ۲ بخش است:

۱) ارزيابي بي خطر بودن Safty
2) ارزيابي توانمندي يا اثر بخشي (potency, efficacy)

۵-۱ ارزيابي بي خطر بودن واكسن
دراين ارزيابي ثابت مي شود كه واكسن عاري از هرگونه ماده آسيب رساننده به حيوان يا انسان پس از تجويز آن مي باشد اين مخاطرات را در موارد زير مي توان يافت:
الف: عامل اوليه استفاده شده (سويه باكتري، سويه توكسوئيد يا ويروس)
ب: مواد شيميايي افزوده شده به واكسن (تعميدي يا غير تعميدي)

پ: نوع سوبستراي استفاده شده (محيط كشت، كشت سلولي، تخم مرغ جنين دار، سرم، مايع واكسن،….)
الف: آزمايش هايي كه با هدف بررسي احتمالي توانايي آسيب رساني عامل اوليه واكسن به عنوان بخشي از آزمايش هاي بي خطري واكسن انجام مي شوند، شامل موارد زير است:

۵-۱-۱ آزمايش مسموميت زايي اختصاصي
اين آزمايش براي تشخيص باقي ماندن هرگونه حدت و بيماري زايي در واكسن هاي باكتريايي زنده و يا تشخيص غير فعال سازي ناقص در واكسن هاي كشته باكتريايي يا توكسوئيد به كار مي رود. در مورد واكسن هاي ويروسي از اصطلاح آزمايش غير فعال سازي استفاده مي شود. و به اين منظور گروه هايي از حيوانات مختلف با دوزي از محصول خام يا پالايش شده چندين نوبت بيشتر از

حدي كه در انسان به منظور ايمني زايي استفاده مي شود، تزريق مي شود. در واكسن هاي توكسوئيدي ، استاندارد تعيين شده، وقوع نشانه هاي باليني يا تغييرات ماكروسكوپيك مي باشد. درآزمايش بي خطري واكسن سياه سرفه بر اساس تأثير باكتري (كه به طور ناقص غيرفعال شده است) بر روي وزن گيري موش مي باشد.(۶)،(۵)