مهندسي بافت

پيدايش مهندسي بافت به عنوان يك رشته تحصيلي دانشگاهي و صنعت جهاني در حدود ۱۰ سال پيش، فرصت هاي بي نظيري را در جهت توسعه معالجات پيشرفته براي درمان بيماريهاي ارثي يا اكتسابي بوجود آورده است.
مهندسي بافت تركيبات نوين سلول ها، بيومواد بي ياخته (غير سلولي) داروها، فراورده هاي ژني، ژن هاي قابل طراحي، تشخيص، ساخت و رهايش همزمان يا ترتيبي عامل هاي درماني را در بر مي گيرد.

تعريف مهندسي بافت: مهندسي بافت از تركيب علم بيولوژي مواد و علم مهندسي يا به عبارتي Biotech جهت بيان ارتباطات ساختاري بافت هاي فيزيولوژيكي و طبيعي پستانداران در راستاي توسعه روشهاي نوين ترميم بافت و جايگزين سازي بافت تشكيل شده است.
در حقيقت مهندسي بافت با استفاده از روش هاي درماني متنوع اندام هاي مصنوعي زيستي، ناتواني اندامي را درمان كرده و هدف جايگزيني بافت را به جاي اندام هاي معيوب يا از كار افتاده دنبال مي كند.
انواع فرايند مهندسي بافت
۱- بيوپسي سلول هاي بافت نمونه
۲- انجام آزمون هاي ايمني و ذخيره سازي كاشتني
۳- كشت سلولها بر روي داربست پليمري شامل فاكتورهاي رشد و …
۴- فراكاشت (transplant) بافت تهيه شده.
۱-بيوپسي سلول هاي بافت نمونه

بسته به اينكه برداشت سلول از بافت خود شخص (allogenic Cells) يا بافت بيگانه (Xenogenic Cells) باشد. شرايط آزمون ايمني متفاوت خواهد بود.
الف- بيوپسي سلول از خود فرد: در اين حالت موارد ايمني شخص دريافت كننده به كسب عامل هاي غير موروثي (ميكروبي، ويروسي، بيماري زا) در آزمايشگاه محدود مي شود.
ب- بيوپسي سلول از بافت بيگانه: شرايط آ‎زمون در صورتي كه بافت از فرد فوت شده يا اهدا كننده زنده به دست آيد، تفاوت دارد. در اين حالت سلول ها تا زمان تعيين ايمني نهايي در يخچال و

شرايط سرد نگهداري مي شوند. (قرنطينه) . استاندارهاي ايمني جهت نگهداري اعضاء معمولي بدن انسان براي بافت هاي Xenografts مشابه بانك خون بوده و نيازمند بررسي اهدا كننده از جنبه هاي مختلف بيماري زايي است كه از آن جمله مي توان ويروس HIV و انواع هپاتيت B و C را نام برد. علاوه بر مسائل ايمني مربوط به انتقال عوامل بيماري زا ايمني شناسي و پايداري بردارهاي ژن ها تغيير يافته نيز بايد مورد ارزيابي قرار گيرد. همچنين در صورتي كه سلول هاي كاشته شده از نظر ژنتيكي اصلاح شده باشند پاسخ شخص دريافت كنده به فنوتيپ تغيير يافته سلول ها نيازمند

مطالعه و بررسي خواهد داشت.
پس از آزاد شدن بافت ها از قرنطينه پردازش مهندسي بافت آغاز مي شود.
۲- انجام آزمون هاي ايمني و ذخيره سازي كاشتي
بافت هاي مشتق شده از خود شخص معمولاً تحت آزمون بيماري هاي خوني مادر زادي قرار نمي گيرند. پردازش بافت ها جهت كشت سلولي يا ذخيره سازي مستقيم بايد همراه با ايمني كاركنان آزمايشگاه باشد. مسئله ديگر، حفاظت مواد غذايي (nutritions) با استفاده از ظروف كشت باز

(براي مثال ظروف پتري) يا ظروف غير قابل نفوذ مانند (بطري هاي غلطان و فلاسك هاي با درپوش صافي) است كه خطر پراكنده شدن ماده در تماس با سلول هاي انساني تست نشده را به حداقل مي‌رساند.
كاشتني هاي مهندسي بافت بايد از نظر آلاينده هاي بيولوژيكي ايجاد شده در خلال پردازش براي بيماران كاملاً ايمن باشد. اين تضمين بوسيله آزمون استريليزاسيون، سميت و قارچ در محصول نهايي قبل از آزادسازي محصول انجام مي شود.

آزمون استريليزاسيون: در محيط تيوگيليكولات يا هر ماده تصويب شده ديگر براي بررسي ميكرو ارگانيزم ها انجام مي گيرد.
آزمون سميت: بوسيله آزمايش ليمولوس آموبوسيت ليسات (LAL) انجام مي گيرد.
آزمون قارچ: شناسايي ميكوپلاسماها (قارچ ها) توسط كشت مستقيم در محيط كشت نگهبان (Sentry cell culthure) بوسيله پيوند هيبريديزاسيون in situ يا به وسيله آزمايش واكنش زنجير بسپارگر (PCR) انجام مي گيرد.
-اجراي آزمون استريليزاسيون نسبتاً ساده و ارزان بوده در حاليكه آزمون هاي سميت و قارچ پ

يچيده و گران هستند. بنابراين انجام هر آزمون در هر مرحله آماده سازي كاشتني مهندسي بافت از نظر اقتصادي عملي نيست. بنابراين از الگوريتم نمونه برداري براي كنترل روند آماده سازي چندين كاشتني استفاده مي شود.
۳-كشت
هدف از كشت سلول هاي اوليه تهيه مقدا كافي از سلولهاي قابل رشد واجد شرايط مي باشد كه تضمين كننده شباهت توزيع نهايي با توزيع يافت شده در بافت اصلي است.
محيط كشت سلولي شامل مخلوطي از مواد غذايي ضروري (نمك ها، آمينو اسيدها، ويتامين ها، كربوهيدارت ها، اسيدهاي چرب) بافرها (تثبيت كننده هاي PH) و عناصر رديابي به صورت مكمل فاكتورهاي ميتوژنيك مشتق شده از حيوان و هورمون هاي مصنوعي و فاكتورهاي رشد مي باشد. البته انواع خاصي از سلول ها براي تكثير نيازمند هم كشتي با سلول هاي «خوراننده (feeder)» هستند.
استفاده از كشت سلولي به عنوان مدلي براي شرايط in vivo تا حدود زيادي به الزامات زير نيازمند است.
محل آناتومي- پاتولوژي (آسيب شناسي) – نرمالسي – درجه ايسكمي
گزينش و ايزولاسيون Selection & Isolation

ايزولاسيون: تحقيقات نشان داده است كه انواع سلول هاي مشابه مانند سلوهاي فيبروبلاست، اندوتليال يا پري اديپوسايت ها در محل هاي آناتومي مختلف داراي مشخصه هاي متفاوت هستند. اما اين موضوع كه سلول هاي آناتومي يك محل نيز مشخصه هاي متفاوت از خود نشان مي دهند هنوز به خوبي شناخته شده نيست.
استراتژي هاي مختلفي براي ايزولاسيون يا به عبارتي خارج كردن (جداسازي) سلول از بافت وجود دارد از جمله:
۱-آنزيمي ۴- ريزش

۲-مكانيكي ۵-تركيبي از بقيه
۳-تجزيه شيميايي
– روش آنزيمي: يكي از جديد ترين شيوه ها در ايزولاسيون سلول و تكثير سلولي در محيط in vitro قطعه قطعه كردن بافت است. در اين روش تا زماني است كه انتشار مواد غذايي و گازها محدود نشود. بافت به قطعات بسيار كوچك خرد مي شود. سپس قطعات بافت در ظروف كشت بافت كه با سرم جنيني گاو و يا ماتريس هاي ديگر پوشيده شده است، قرارداده مي شود. تركيب ماده و

پوشش سطح و همچنين جداسازي انواع سلول از كلاف هاي مويرگي ميتواند اثر قابل توجهي به نوع سلول نهايي توليد شده داشته باشد. قطعات بدست آمده بافت را براي تثبيت اتصال در زير پوشش قرار مي دهند زيرا تماس مستقيم با سطح كشت موفق explant ضروري است. در مواردي كه بتوان جهت كشت، آنزيم را در معرض محيط قرار داد، بافت با غلظت آنزيمي بهينه براي مدت

كوتاهي در دماي اتاق و يا براي مدت طولاني تري در دماي نگهداري مي شود. (جهت سازگاري). در مواردي كه بافت نمونه كوچك باشد، روش هاي جداسازي آنزيمي يا مكانيكي بسيار شديد بوده و سلول هاي فراواني از دست مي روندكه ادامه كار را غير ممكن مي سازد.

– روش مكانيكي: شيوه مكانيكي قطعه كردن بافت شامل روش گردابي تكان دادن در شيكر چرخشي، پودرسازي با پيپت هايي با قطره هاي متفاوت، عبور بافت از ميان شبكه هاي نايلون يا فولاد زنگ نزن و خرد كردن بافت با سوزن هاي نازك مي شود. اين فرايند تعليق سلول را زودتر از گوارش آنزيمي ايجاد ميكند. اين روش ها به طور كلي براي همه بافت ها مؤثر نيستند. تشخيص نوع روش، بستگي به مقدار نيروي اعمال شده به بافت داشته كه اين جنبه ميتواند سبب آسيب شود

. زيرا سلول ها به برش حساس مي باشند. بطور مثال برش سلولهاي استئوبلاست جمجمه نوزاد موش سبب تغيير مورفولوژي و كاهش تدريجي كلسيم بين سلولي شود. اين روش در مورد بافت هاي نرم مانند طحال گره هاي لنفي، كبد، تومورهاي نرم و احتمالاً مغز قابل اجرا است. سلول هاي تومور خيلي مؤثرتر توسط گوارش آنزيمي جدا مي شود تا روش هاي مكانيكي.
گزينش: گزينش بر اساس خاصيت هاي منحصر به فردي كه يك سلول را از ديگري متمايز مي كند، مانند چگالي و اندازه، نشانه گذاري، گذرراههاي منحصر به فرد متابوليكي و احتياجات غذايي انجام مي شود.

-چگالي و اندازه: در سانتريفوژ نرخ ته نشيني ذرات به نيروي اعمال شده چگالي و ويسكوزيته مايع بستگي دارد. بنابراين با يك نيرو ويسكوزيته معين نرخ ته نشيني متناسب با اندازه ذرات بوده و در نتيجه نرخ ته نشيني در زمان صفر شدن اختلاف بين چگالي ذره و چگالي مايع به صفر نزديك مي شود. همچنين نرخ ته نشيني با افزايش نيروي سانتريفوژ افزايش يافته و در اثر بالا رفتن و يسكوزيته مايع كاهش مي يابد.

استفاده از گراديان جداسازنيز اجازه تشكيل محلول هايي با چگالي مناسب براي باند كردن سلول ها بر طبق چگالي شناوري(buoyant) بدون اينكه سلول ها تحت هيچ گونه تنش اسمزي يا يوني قرارداشته باشند را مي دهد. ماده گراديان قادر است كه براساس چگالي يا اندازه سلول ها را تفكيك كند. براي گزينش بر مبناي چگالي، ماده گراديان به نحوي ساخته مي شود كه حيطه چگالي آن، كل محدوده چگالي سلول هاي موجود در تركيب را در برگيرد. چگالي يك سلول مي تواند توسط خاصيت اسمزي محلول تحت تأثير قرار گيرد.

-نشانه گذاري منحصر به فرد سلول ها (توسط ماركر):
ساختمان سلول ها در بافت ها با توجه به عملكردشان در درون سلول ناهمگن است. اين ساختارها نه تنها نشانگر عملكرد منحصر به فرد سلول هاست بلكه وسيله اي براي تشخيص آنها مي باشد، به خصوص اگر اين ساختارها در سطح سلول باشد.

– گزينش توسط سلول فلورسنت فعال شده (FACS)
گزينش توسط سلول فلورسنت فعال شده به روش سلول سنجي (سايتومتري) روان انجام مي شود كه يكي از پيشرفته ترين تجهيزات در جهت بهره برداري از تكنولوژي پادتن هاي مونوكلونال مي باشد. عملكرد اين دستگاه بر اساس قابليت ايجاد جرياني از سلول هاي منفرد است كه به طور انتخابي توسط صفحات منحرف كننده با بارهاي مخالف قابل تغيير جهت هستند. در ابتدا تركيبي از سلول ها با پادتن هاي مونوكلونال جفت شده با نشانه ها فلوروسنتي نگهداري مي شود. سپس

سلولهايي كه داراي epitope مناسب هستند با پادتن هاي نشان دار باند مي شوند. در اين دستگاه تركيب به صورت جرياني از سلولها در مي آيد كه بوسيله مبدل لرزشي به قطره هاي كوچك شكسته مي شوند. سپس باريكه ليزر به سلول ها تابانده شده و پرتو حاصل توسط

پردازش به نحوي باردار مي شوند كه به خوبي توسط صفحات باردار منحرف كننده قابل انحراف باشند. پس از برخورد باريكه ليزر با سلولهاي مورد نظر يك بار مختصر به صفحات منحرف كننده اعمال مي شود كه نتيجه آن انحراف سلول هاي نشان دار و از دست رفتن سلول هاي بدون نشان است. بطور كلي عمل گزينش در دستگاه FACS بر اساس هر گونه خصوصيت سلولي كه توسط پراكندگي يا انتشار نور باشد انجام مي گيرد. با توجه به پيچيدگي دستگاه عمل گزينش مي تواند بر روي

بيشتر از يك پارامتر انجام شود. از جمله شكل سلول، اندازه سلول، و انواع ويژگي هايي كه توسط ماركر فلورنس قابل بررسي هستند.
-گزينش از طريق سلول مغناطيسي فعال شده (MACS)
اين شيوه از پادتن هاي مونوكلونال و ديگر مولكولهاي گزينش شده با خاصيت مغناطيسي براي گزينش سلول استفاده مي كنند. در اين روش رشته هاي مغناطيسي با پادتن هاي ثانويه گوناگوني پوشيده شده و سلول ها و رشته ها با هم پرورش مي يابند. سلول هاي نشانه دار ويژه با اتصال به ذرات مغناطيسي پادتن ثانويه را حمل مي كنند.لوله اي كه تركيب فوق را حمل مي كند در مقابل مغناطيس قرارداده مي شود. در نتيجه رشته هاي حامل سلول به سمت سلول كشيده مي شوند. سلول هاي غير متصل به رشته مغناطيسي را مي توان به بيرون منتقل كرد، اين فرايند را ميتوان چندين بار تكرار نمود تا سلولهاي غير متصل به كلي خارج شوند. مثالي از اين روش در مطالعات تصفيه سلول هاي از جزاير لانگرهانس موش است.

-گزينش بر اساس احتياجات غذايي.
توانايي سلولها در تكثير و بيان مشخصه هاي منحصر به فرد در كشت سلولي به فاكتورهاي رشد، سايتوكين ها، هورمون ها، ماتريس هاي برون سلولي و تركيبات غذايي همچنين شامل تيتراسيون سطوح بهينه كليه اجزاء ماده مي شود.
سلولهاي مختلف ارگانيزم چند سلولي بوسيله مايع برون سلولي حاوي اكسيژن دي اكسيد كربن، گلوكوز، لاكتيت، آمينو اسيدها و مواد غذايي مهم ديگر، فاكتورهاي رشد و هورمون هاي مشتق شده از پلاسما و از سلول هاي محيط احاطه شده اند. از آنجا كه سلول هاي مختلف خصوصيات متابوليسمي متفاوت دارند، اين محيط ها نيز متفاوت خواهند بود. براي مثال، فيبروبلاستها و

كراتينوسايت هاي يك نمونه پوست در محيط هاي يكسان تكثير نمي شوند. تفاوت در غلظت كليسم و آدنين ظاهراً مؤثرترين عامل در رشد انتخابي مي باشند. رشد بهينه كراتينوسايت ها در غلظت‌هاي نسبتاً كم كلسيم رخ مي دهد. غلظت كلسيم بهينه براي فيبروبلاست ها سبب لايه لايه شدن كراتينوسايت ها شده و آنها ديگر قابليت عبور سريال را در زماني كه غلظت بهينه كلسيم براي كراتينوسايت ها در كمك به تكثير فيبروبلاست بسيار كم است، نخواهند داشت. همچنين

سلولهاي اپيتليال پستاني و فيبروبلاست تها توسط عكس العمل هاي متفاوت شان نسبت به شرايط زير بسته بندي و اجزاء ماده از همديگر تشخيصص داده ميشوند. كليسم اثر قابل ملاحظه اي بر وضعيت فنوتيپ سلول اپيتال مي گذارد. غلظت نستباً بالاي كلسيم سبب لايه لايه شدن سلول ها شده و مثلاً در سلول هاي اپيتليال مري موش عمل گزينش را آسان مي كند. سرم نيز مي‌تواند سلولهاي اپيتليال را از هم جدا كند، براي مثال سلول هاي اپيتال نايژك يك انسان طبيعي در حضور سرم به صورت پوسته پوسته جدا شده درحاليكه كارسينوم ريه در حضور سرم جدا نمي‌شود.