نقش کشت بافت در توسعه تحقیقات برنج

– باززايي گياهان
هنگامي كه پينه‌هاي مشتق از پروتوپلاست به بزرگي ۲ ميلي‌متر رسيدند، در يك محيط غذايي باززايي كشت مي‌شوند. معمولاً از محيط غذايي N6 بدون تنظيم كننده رشد يا با سيتوكنين (يك ميلي‌گرم بر ليتر كينيتن) به عنوان محيط غذايي باززايي استفاده مي‌شود (جدول ۲-۳). عبداله و همكاران (۱۹۸۶) ثابت كردند كه محيط غذايي N6 به دليل اين كه غلظت آمونيوم آن در مقايسه با MS پايين‌تر است براي باززايي مناسب‌تر مي‌باشد. عموماً باززايي گياهي در برنج از راه اندام زايي وقوع مي‌يابد. با اين حال، وجود گزارش‌هاي اندكي حاكي از اين است كه گياهان مي‌توانند از راه رويان زايي بدني نيز حاصل شوند (عبداله و همكاران، ۱۹۸۶، كيوزوكا و همكاران، ۱۹۸۷).

معمولاسرعت باززايي گياهچه‌ها۲۰-۱۰% است. اين سرعت نه تنها به شرايط كشت در محيط باززايي بلكه به پروره‌ها، منابع و تعداد واكشت‌هاي لاين‌‌هاي ياخته‌اي مورد استفاده در جداسازي پروتوپلاست ‌ها بستگي دارد. بالاترين سرعت باززايي در نيپون بار و ياماهوشي گزارش شده است. اين دو پروره در دودمانه به يكديگر وابسته هستند. هر دوي آن‌ها داراي قابليت باززايي بالايي در كشت بساكند (ساساكي ۱۹۸۶). ساسانيشي‌كي وكوشي هيكاري نيز براي كشت پروتوپلاست استفاده شدند. عموماً هنگامي كه زيركشت‌هاي منشاء از ياخته‌هاي مرسيتمي جوان نظير

رويان‌هاي نارس، خوشه‌هاي جوان و بساك‌ها انتخاب شوند، داراي سرعت باززايي بالا خواهند بود. علاوه بر اين، وقتي كه پروتوپلاست‌‌ها از پينه‌اي كه براي مدت طولاني واكشت شده‌اند جدا شوند، سرعت باززايي زياد خواهد بود. پينه

تازه به اندازه يك سال پس از آغاز كشت، براي كشت پروتوپلاست پيشنهاد مي‌شود.
اوگورا و همكاران (۱۹۸۷) از پروتوپلاست تعداد زيادي گياه باززايي كردند. بسياري از گياهان باززايي در مقايسه با شاهد تمايل به توليد پنجه‌ها و خوشه‌ها و ميزان محصول بيش‌ترند. با وجود اين، طول ساقه، تعداد دانه در خوشه و باروري دانه‌ها به پايين تمايل داشتند. هشت درصد گياهان باززايي شده‌يك دسته ازكروموزوم‌هاي دولاد عادي را داشتند. از طرف ديگر، در حالتي كه توري‌ياما و همكاران (۱۹۸۶) از كشت پروتوپلاست پينه‌ها كه از دانه‌هاي گرده‌ي بساك‌ها منشا يافته بودند، گياهاني را باززايي كردند كه ۳۳% آن‌ها تك لاد و ۳۹% دولاد بارور، و بقيه با صفات ريخت شناختي ناهنجار، عقيم بودند.

باززايي گياه از طريق كشت پروتوپلاست سازگاني مركب از چندين مرحله است. هر مرحله بايستي متناسب و با دقت و بطور كامل انجام شود. حتي يك خطاي كوچكي در يك مرحله ممكن است باعث شكست كامل شود. از اين‌رو، از ايجاد خط ياخته‌اي آغازين تا مرحله باززايي گياه بايستي در كشت دقت زيادي مبذول داشت.
اطلاعات منعكس در جدول‌هاي ۲-۲ و ۲-۳ نتايج موفقي

ت آميز حالت‌هاي اوليه هستند. پس از اين، چند مطالعه ديگري نيز توسط گروه‌هاي تحقيقاتي مختلف گزارش شده است.سازگان كشت پروتوپلاست فن مهمّي است كه تصور مي‌شود براي توسعه زيست‌فن شناسي، بويژه همجوشي پروتوپلاست و انتقال ژن مورد استفاده قرار گيرد.
کشت بافت عبارت است از کشت یاخته، بافت، پیش‌دش (protoplast) و اندام‌های گیاهی در

شرایط گندزدایی شده و در محیط غذایی مصنوعی در داخل لوله آزمایش. اکنون این فناوری به عنوان یک روش پایه‌ای و یک ابزار محوری بسیار عالی در تکثیر و اصلاح نژاد گونه‌های گیاهی مهم اقتصادی موقعیت ویژه‌ای‌را کسب کرده است. کشت بافت گیاهی در کشاورزی و باغبانی نیز کاربردهای عملی فراوانی دارد. آزمایشگاه‌های ریزازدیادی سالیانه میلیون‌ها نهال درختان و گیاهان زینتی را تولید و به بازار عرضه می‌کنند. کشت انتهای شاخه یا مریستم به منظور تولید گیاهان

عاری از ویروس به طور گسترده‌ای در حال اجراست. کشت بساک، تخمک و همجوشی پیش دش‌ها در به‌نژادی با کاهش مدت زمان لازم و افزایش کارایی انتخاب، سرعت عمل را زیاد کرده است و علاوه بر این روش خوبی در درک فرایندهای زادشناختی (Genetic)، تنکارشناختی (Physiology)، زیست شیمیایی و زیست شناسی مولکولی به شمار می‌رود. از طرف دیگر گیاهان تراریخت که از انتقال DNA خارجی به یاخته‌ها و پس‌از باززایی گیاهی حاصل می‌شوند، به سرعت در حال پیشرفت است و تأثیر این محصولات در سلامت انسان در کشورهای اروپایی و آمریکایی

تردیدهایی را برانگیخته است.اگرچه دامنه‌ی چنین جنبش هایی به آسیا و آفریقا کشیده نشده است امّا به منزله‌ی هشداری برای همه‌ی ملل جهان تلقی می گردد. اهداف اصلی این تحقیق برمبنای تکوین گیاهان تراژنی مقاوم به حشرات، بیماری‌ها، خطر سرما و علف‌کش‌ها استواراست. همجوشی پیش‌دش‌ها (یاخته‌های فاقد دیواره) امکان تلاقی بین گونه‌ای را مقدور می‌سازد. این روش برای تلاقی‌های بین گونه‌ای اهلی و وحشی اهمیت زیادی دارد، زیرا اولاً نسل اول آن‌ها فاقد رویان تکامل یافته و غیر قابل رویشند و دوماً گونه‌های وحشی معمولاً دارای ژن‌های کنترل کننده

مقاومت به آفات و بیماری‌ها و شرایط محیطی می‌باشند. علاوه بر این در بعضی از روش‌های انتقال ژن‌ و تهیه پیش‌دش‌ها یک مرحله‌ی ضروری بوده و دریچه‌ی تازه‌ای در اصلاح نژادی گیاهان زراعی گشوده است. جدول ۱ روش‌های مختلف کشت بافت و کاربرد آن را نشان می‌دهد.
روش‌های کشت بافت مبتنی بر دو مرحله تمایز زدایی و تمایزیابی می‌باشد. یاخته‌ها، بافت‌ها و

اندام‌های گیاهی در طی مرحله تمایز زدایی، توده‌های یاخته‌ای بی‌شکل و متراکمی به نام پینه را تولید می‌نمایند و سپس در شرایط غذایی و محیطی مناسب تمایز یافته و بافت‌های مختلفی را ایجاد نموده و گیاهان کاملی را به وجود می‌آورند. به همین دلیل کشت بافت در مسائل مربوط به رشد و تمایزیابی تحت شرایط باز تولیدی به آزمایش‌های گیاهی کمک گرانبهایی کرده است. کشت بافت در کشاورزی و باغبانی نه تنها به منظور تکثیر گیاهان بلکه اهداف مربوط به جذب مواد غذایی خاک، مقاومت به شوری خاک، حذف عوامل بیماری‌زا، حفظ ذخایر گیاهی ارزشمند در کشت‌ها و در درجه حرارت‌های پایین و اصلاح گیاهان کاربردهای عملی بسیار وسیعی پیدا کرده است. اهمیت کشت بافت گیاهی به اندازه‌ای است که بسیاری از دانشگاه‌های دنیا آن را در دوره‌های آموزشی پیشرفته و مقدماتی خود گنجانیده‌اند و حتی در بعضی از کشورها دوره‌های تخصصی ریزازدیادی را در سطح تولید سازماندهی کرده اند.
نظریه بس‌توانی (Totipotency) که در سال ۱۸۳۸ توسط شلیدین و شوآن پیشنهاد شد، نیروی محرکه‌ی اصلی توسعه‌ی این شاخه‌ی زی فن شناسی بوده است. بس توانی یاخته‌ای عبارت است از این که یاخته‌های گیاهی در وظایفشان خود سازند و در اصل استعداد باززایی و تولید گیاه کامل را در خود دارند. در ابتدا این نگره فقط در یاخته‌های تخم و هاگ تأیید شد. پس از گذشت

مدت زمان طولانی برای یاخته‌ها‌ی بدنی نیز به اثبات رسید. بنابراین، بس‌توانی به عنوان یکی از نشانویژگی‌های یاخته‌های گیاهی، توان بالقوه‌ی بزرگی در به دست آوردن نوترکیب‌های زادشناختی محسوب می‌گردد که با صرف زمان و دشواری‌های بسیاری با روش‌های به‌نژادی سنتی امکان‌پذیر نبوده است. اکنون کشت بافت گیاهی براساس چنین اصولی استوار گردیده و به سرعت در حال گسترش و ترقی می‌باشد.
رواج و کارآیی بالقوه‌ی روش‌های کشت بافت در اصلاح نژاد گیاهی عبارت است از:
(۱) تکثیر گروهی،
(۲) حذف عوامل بیماری‌زا،
(۳) نگهداری ذخایرتوارثی به‌مدت زمان‌ طولانی،
(۴) تولید گیاهان تک لاد (هاپلویید،
(۵) ایجاد و انتخاب تغییرات زادشناختی،

 

(۶) تولید محصولات ثانویه،
(۷) انتقال ژن،
(۸) دورگ‌گیری بین گونه‌‌‌ای و
(۹) مهندسی زادشناختی مولکولی گیاهی.

جدول ۱- روش‌های کشت بافت و کاربرد آن در تکثیر و اصلاح گیاهان

کشت پینــه :
پینه زایی یک مرحله‌ی بسیار مهمی از کشت بافت را تشکیل می‌دهد و تولید پینه‌های رویان زا که دارای قابلیت باززایی گیاهی باشند همواره با محدودیت هایی مواجه بوده‌است. از‌این گذشته در مطالعات پینه‌زایی دو عامل مهم زادمون و محیط ( غذا، نور و حرارت) بیش از همه مورد توجه

قرارمی‌گیرد. زادمون‌های یک گونه یا زیرگونه پاسخ‌های متفاوتی نسبت به کشت نشان می‌دهند. برای تولید پینه از کشت قطعات یک بافت نامتمایز یا کاملاً تمایز یافته و تبدیل آن به یک توده یاخته‌ای تمایز نیافته با ساختاری بی‌سازمان در محیط ‌های غذایی مصنوعی نیمه جامدی که محتوی همه‌ی مواد غذایی پرمصرف، کم مصرف و ساکارز به اضافه‌ی ترکیبات تنظیم کننده رشد به ویژه ۲٫۴-D ، IAA ، NAA کینیتین و یک ژل نیمه جامد کننده باشد، استفاده می‌شود. قسمت‌هایی از گیاه که می‌تواند کشت شود شامل قطعات ساقه، ریشه. میان برگ(مزوفیل)، لپه، نوک شاخه، بافت گل، کامبیوم آوندی، فلس‌های پیازی، درون دانه، محور رویان، اشعه‌مرکزی، پارانشیم آوندی، سپرچه، محور زیرلپه، بساک، ریزهاگ و تخمک یا تخمدان می باشد. اگرچه اندازه، شکل، منابع گیاهی یا زادمون گیاه و شیوه‌ی کشت در القای تشکیل پینه تأثیر بسزایی دارد اما

هر نوع قطعه‌ی زیر کشتی در شرایط محیط غذایی با ترکیبات ویژه ای و دورة نوری خاصی به کشت پاسخ می‌دهد. دانشمندان سی سال پس از شناسایی ترکیب ۲ ,۴-D به خواص هورمونی آن پی بردند و از آن در تمایز زدایی و تولید پینه استفاده کردند. در حال حاضر استفاده از این هورمون در پینه ز‌ایی به طور وسیعی رواج یافته است. در اغلب گیاهان و قطعات زیرکشت، القای پینه‌ در ۲۵ درجه سانتی‌گراد و در تاریکی انجام می‌شود. پینه زایی از نشانویژگی‌های وراثتی محسوب می‌گردد. علاوه بر این عوامل تنکار شناختی ،منابع گیاهی ، محیطی و تیمارسرمایی پیش از کشت به ویژه در کشت‌های مربوط به بساک و ریزهاگ و تخمک اهمیت زیادی دارد.
کشت باززایی :

یاخته‌های پینه به منظور شاخه زایی و تولید گیاه کامل به محیط‌های غذایی دیگری که از نظر ترکیبات به ویژه میزان و نوع هورمون‌ها با محیط‌های غذایی پینه‌زایی متفاوتند، در شرایط گندزدایی شده انتقال می‌یابند. با تغییر نسبت‌ تنظیم کنندگان رشدی می‌توان برای هر منبع گیاهی، محیط غذایی باززایی مناسبی که بیشترین بازدهی کشت را داشته باشد، تهیه کرد. در تمایزیابی پینه‌ها و به وجود آمدن اندام‌های نو پدید برای هر زاد مونی دوره‌ی نوری و درجه حرارت معینی پیشنهاد شده است. همه‌ی پینه‌ها برای تبدیل شدن به گیاه کامل مناسب نیستند و فقط پینه‌های رویان‌زا که اغلب دانه‌ای شکل، مدور، خشک و زرد کمرنگ هستند، بهتر پاسخ می‌دهند. پینه‌های رویان‌زا پس از عمل تمایزیابی ،اندام‌های اولیه‌ای را به وجود می‌آورند که سپس به شاخه‌ها، ریشه‌ها، گل‌ها، جوانه‌ها و رویان‌ها تبدیل می‌گردند. در غلات محدودیت‌هایی از نظر باززایی گیاهان زال مشاهده می‌شود که گاهی ۹۰ تا ۹۵ درصد تولید گیاه را دربر دارد و برای جلوگیری از این پدیده نامناسب، تحقیقاتی در حال انجام است. باززایی پینه‌از مسائل بسیار پیچیده کشت بافت بوده که در تعداد زیادی از گیاهان، بدون حل باقی مانده است. متأسفانه تعداد زیادی از پینه های گونه ها و همجوشی بین گونه‌ای گیاهان به باززایی پاسخ نمی دهند.
کشت بساک و ریزهاگ :

فنون کشت بساک و ریزهاگ به عنوان یک ابزار اصلاحی کارآمد و صرفه‌جویانه ای در تولید خط‌های جور تخم (هوموزیگوت) گیاهی در مدت زمان کوتاه در به‌نژادی مورد استفاده قرار می‌گیرد. گرده‌ی نارس یا ریزهاگ موجود در بساک در کشت‌های یک مرحله‌ای مستقیماً تولیدگیاه را می‌نماید و در حالت دو مرحله‌ای ابتدا پینه را تولید می‌کند و سپس در شرایط غذایی دیگری با نسبت هورمونی متفاوتی به گیاه باززایی می شود. ریزهاگ‌های داخل بساک تک لادند و نیمی از کروموزوم‌های بدنی را در اختیاردارند. هنگامی که در فرایند کشت بساک به یاخته‌های پینه و سپس به گیاه ک

امل تبدیل می‌گردند، یاخته‌های بدنی آن‌ها، تماماً تک لاد و در نتیجه گیاه تک لاد خواهد بود و از آن جا که این گیاهان نمی‌توانند تقسیم میوز را انجام دهند، از طریق بذر قابل تکثیر نیستند (در مواردی که پینه‌ها از دیواره بساک به وجود آمده باشند و یا به طورخود به خودی دولاد شده باشند و تولید بذر نمایند، بارورند). بنابراین، این گیاهان بایستی تحت اثر ماده شیمیایی کولشی سین به گیاهان دولاد تبدیل گردند که در آن کروموزوم‌ها به صورت جفت‌های مشابه وجود خواهند داشت و تک لادهای دو برابر یا دولادهای نرزاد (گیاهان گرده‌ای) جور تخم و خالصند و در خط‌های زادگیری (breeding) به منظور بروز صفات زاد شناختی مغلوب ساده یا جهش یافته مورد استفاده قرار می‌گیرند. برتری این روش در مقایسه با دورگ‌گیری سنتی عبارت است از :

۱-کاهش مدت زمان لازم به‌نژادی با تثبیت جور تخمی
۲- افزایش بازدهی انتخاب به دلیل احتمال بروز سریع ژن‌های مغلوب و پایداری ژن‌های نوترکیب بیشتر
۳- تغییر پذیری وسیع زاد شناختی از راه تولید گوناگونی های گامتوکلنی
۴- حل مشکل عقیمی در تلاقی‌های دور.
تاکنون کشت بساک بیش از دویست گونه گیاهی شامل غلات (جو، ذرت، چاودار، تری‌تیکال، گندم و غیره)، درختان میوه (سیب ،گلابی، گیلاس،مرکبات وبه)، درختان جنگلی (صنوبر و اوکالیپتوس)، سبزیجات (کلم، هویج، خیار، ترب، بادمجان)، گیاهان زراعی (چغندر و توتون) وگیاهان دارویی نیز به کشت بساک پاسخ داده‌اند. تاتوره اولین گیاهی بود که کشت بساک آن انجام شد. بازدهی کش

درجه حرارت اتاق بستگی دارد. در کشت بساک غلات مدت زمان و درجه حرارت دوره سرما دهی و غلظت هورمونی محیط غذایی کشت در میزان تولید گیاهان سبز تأثیر می‌گذارد. از مطالعه باززایی پینه‌های حاصل از نسل اول دورگ‌ها می‌توان چنین استنباط کرد که قابلیت باززایی یک نشانویژگی وراثتی است و توسط ژن‌هایی هدایت می‌شود. از این گذشته در پینه‌هایی که به منظور انتقال ژن با ذرات طلای آغشته به DNA خارجی بمباران می‌شوند و پینه‌هایی که از پیش‌دش‌های امتزاج یافته حاصل می‌گردند، باززایی به سختی انجام می‌شود. پینه‌زایی و باززایی از مباحث اصلی پیشرفت و ترقی این علم محسوب می‌گردد که فایق آمدن بر پیچیدگی‌ها و موانع آن‌ها پشتوانه قدرتمندی را در عرصه‌های کشاورزی نوین فراهم خواهد کرد. به دلیل پایین بودن میزان پاسخ گیاهان به کشت بساک، دانشمندان تمام کوشش خود به بهبود محیط‌های غذایی کشت و بررسی زادمون‌های گیاهی و یک مرحله‌ای کردن کشت متمرکز ساخته‌اند. کشت بساک اولین بار در غلات و توسط نی‌ای‌زیکی (۱۹۶۷) در برنج انجام شد و تاکنون موفقیتهای چشمگیری حاصل گردیده است، اما پاسخ اندک به پینه‌زایی و باززایی و فراوانی گیاهان زال (Albino) از مشکلاتی هستند که محققان با آن‌ها روبرویند.

کشت رویان
هنگامی که دامنه وسیعی از گونه‌های گیاهی برای کارهای عملی دورگ‌گیری مورد استفاده قرار می‌گرفت، کشت رویان به عنوان یک ابزار با ارزشی برای تولید گیاهان دورگ در تلاقی‌های دور رواج یافت. امروزه برای غلبه بر خواب بذر و عقیمی آن، نجات رویان تلاقی‌های دورگ‌های ناسازگار و

باززایی گیاه در داخل لوله آزمایش از روش کشت رویان نارس استفاده می‌شود. در این حالت رویان از بذور نارس یا نزدیک به مرحله‌ی بلوغ جدا شده و در محیط غذایی مصنوعی کشت می‌شود. علاوه بر استفاده از این روش در تلاقی‌های بین گونه‌ای و بین جنسی که معمولاً در مرحله نارسی انجام می‌شود، از آن می‌توان برای تولید پینه‌های رویان‌زا از رویان نارس و رسیده به منظور تهیه پیش‌دش (پروتوپلاست) یا انتقال ژن و DNA که در زی فن شناسی مورد توجه فراوان قرار گرفته است، سودبرد